Utilización de hojas de luz de microscopía de fluorescencia a la imagen de ojo de pez cebra Desarrollo

El objetivo general de este protocolo experimental es obtener imágenes del desarrollo ocular del embrión de pez cebra en el microscopio de lámina de luz y procesar el conjunto de datos multivista adquirido en Figi a través del complemento de la aplicación de reconstrucción multivista. Este método puede ayudarte a comprender los eventos morfogenéticos en el desarrollo animal. La principal ventaja de este método es que se pueden observar eventos morfogenéticos en el embrión en desarrollo intacto con alta resolución espacial y temporal.

La principal ventaja de la microscopía de lámina de luz es la baja fototoxicidad del método, el rápido tiempo de adquisición con el que se puede obtener una imagen de la muestra y que se puede obtener una imagen de la muestra desde varios ángulos, las llamadas vistas. La captura de la muestra desde diferentes vistas nos permite superar la degradación de la señal y del eje establecido. Estas diferentes imágenes se pueden utilizar y registrar utilizando microesferas fluorescentes alrededor de la muestra.

Podemos reconstruir el volumen tridimensional alcanzando la resolución isotrópica. Aunque demostramos el uso de la microscopía de fluorescencia de lámina ligera para el desarrollo del ojo del pez cebra, este método también se puede utilizar para responder a diversas preguntas en biología del desarrollo y neurociencia utilizando varios organismos modelo. Para empezar, atornille el objetivo de detección en el microscopio mientras mantiene los objetivos iluminadores cubiertos.

A continuación, destape los objetivos y deslice con cuidado la cámara de muestras en el microscopio. Asegure la cámara apretando el tornillo. A continuación, conecte la sonda de temperatura y el bloque Peltier al microscopio.

Los dos tubos que hacen circular el líquido refrigerante para el bloque peltier son compatibles con ambos conectores y pueden funcionar en cualquier orientación. A continuación, use una jeringa para cargar la cámara a través de la jeringa con solución hasta el borde superior de las ventanas de la cámara y verifique si hay fugas. Ahora, encienda el microscopio, la computadora y la incubación.

Inicie el software operativo del microscopio y ajuste la temperatura de incubación a 28,5 grados centígrados. Mientras la temperatura lo requiere durante una hora, prepare la muestra. Comience preparando la agarosa.

Derretir una alícuota preparada de un mililitro de agarosa de bajo punto de fusión al 1% en un medio E tres a 70 grados centígrados. Después de unos 15 minutos, transfiera 600 microlitros de agarosa fundida a un tubo nuevo de 1,5 mililitros y agregue 250 microlitros de medio E tres, 50 microlitros de 0,4% MS 222 y 25 microlitros de solución de material de perlas fluorescentes de vórtice. Coloque el tubo en un bloque calefactor a unos 39 grados centígrados para que la agarosa se acerque a su punto de gelificación.

A continuación, empuje los émbolos con punta de teflón hasta el fondo de los capilares de vidrio de un milímetro de diámetro interior. Prepara cinco de estos. Ahora, vórtice brevemente la mezcla de agarosa y luego transfiera cinco embriones con la mínima cantidad de líquido en ella.

A continuación, se introduce un capilar y se aspira un embrión con la cabeza. La cabeza debe entrar antes que la cola y no puede haber burbujas de aire. Extraiga suficiente solución para que haya aproximadamente dos centímetros de agarosa por encima del embrión y un centímetro de agarosa por debajo.

Extrae un embrión en cada capilar antes de continuar. Este paso requiere algo de práctica para dominarlo. Prepárese para ello utilizando embriones no valiosos.

Cuando la agarosa se solidifique completamente, almacene las muestras en un medio E tres apoyando los capilares en una pared de vaso de precipitados con plastilina con la abertura inferior en solución. Ahora ensamble el portamuestras. Primero, inserte dos fundas de plástico del tamaño correcto una contra la otra en el vástago.

Las aberturas de las mangas deben mirar hacia afuera. A continuación, coloque un tornillo de sujeción. E inserte el capilar a través del soporte hasta que la banda de color negro se haga visible en el otro lado.

Evite tocar el émbolo. A continuación, apriete el tornillo de sujeción. A continuación, empuja un centímetro de agarosa fuera del capilar y recórtalo.

A continuación, inserte el vástago en el disco portamuestras. Antes de cargar el disco de muestra, compruebe que la platina esté en la posición superior del software de control. A continuación, utilice los rieles guía para deslizar el soporte y la muestra hacia el microscopio.

Ahora, imagine la muestra elegida como se describe en el protocolo de texto. El tratamiento de los datos se realiza en Figi. Es una distribución de ImageJ.

Antes de comenzar, Figi debe actualizarse. Guarde el conjunto de datos de imagen adquirido en una sola carpeta. Los archivos intermedios del procesamiento de la imagen se guardarán en la misma carpeta.

Ahora, inicie la aplicación de reconstrucción de vistas múltiples. A continuación, defina un nuevo conjunto de datos. Seleccione la opción Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset LOCI Bioformats y cree un nombre para el archivo de datos de salida.

A continuación, seleccione el primer archivo CZI del conjunto de datos. Los metadatos se cargarán automáticamente. En los metadatos de la imagen, comprueba que el número de ángulos, los canales, las iluminaciones y el tamaño del vóxel estén configurados correctamente.

Al presionar OK, se abre una ventana de registro, la ventana del explorador de configuración de vista y una ventana de consola. El explorador de configuración de vistas proporciona una interfaz fácil de usar. Seleccione los archivos que deben procesarse y presione el botón derecho del mouse.

Se abrirá una nueva ventana que muestra los diferentes pasos de procesamiento a medida que se ejecutan. En la esquina superior derecha están los botones de información y guardar. Info muestra un resumen del contenido del archivo de datos guardado y, al pulsar guardar, se guardarán los resultados del procesamiento.

De lo contrario, el programa no guarda los resultados de los pasos de procesamiento. Para volver a guardar todo el conjunto de datos, primero, seleccione todos los archivos presionando Ctrl + A y haciendo clic con el botón derecho. A continuación, seleccione Volver a guardar conjunto de datos y Como HDF5.

A continuación, se debe marcar la confirmación de la acción de volver a guardar. Después de unos minutos, para cada punto de tiempo, el programa indicará cuándo se ha completado el reguardado. A continuación, proceda a la detección de puntos de interés en los datos.

Seleccione todos los puntos de tiempo pulsando Ctrl+A y haga clic con el botón derecho. Para seleccionar, detecte puntos de interés. En las opciones, seleccione diferencia de gaussiano.

Y seleccione, hacia abajo, imágenes de muestra antes de la segmentación. En la siguiente ventana, elija la configuración de detección. En las opciones de localización de subpíxeles, seleccione Ajuste cuadrático tridimensional.

A continuación, en la especificación del punto de interés, seleccione interactivo. Para la opción XY de muestra descendente, seleccione coincidir con la resolución Z. Y para la muestra Z hacia abajo, seleccione 1x.

A continuación, ejecute la operación seleccionando la opción Calcular en Java de CPU. En la ventana emergente, seleccione una vista para probar los parámetros. Una vez que se cargue la vista, ajuste el brillo y el contraste presionando Ctrl + Shift + C en el teclado.

Además, para la detección de cuentas, cambie la opción de aspecto a verde máximo. Ahora observe la segmentación como anillos verdes alrededor de las detecciones. Ajuste los valores de diferencia de gaussien para los parámetros sigma one y threshold para segmentar de forma óptima los cordones con el número mínimo de falsos positivos.

Cada cuenta solo debe detectarse una vez. Después de determinar los parámetros óptimos, presione listo. Después de que la computadora carga, cada vista individual del punto de tiempo y segmenta las cuentas, el programa genera un archivo de registro con el número de cuentas que detectó por vista.

Debe haber entre 600 y varios miles de cuentas por vista. De lo contrario, es necesario ajustar los parámetros de detección. Este es un proceso complicado.

La pirámide de detección rara vez es precisa en el primer intento y los reinicios pueden variar entre los puntos de tiempo de una película. Relajar el fresco detectará todas las perlas reales y permitirá que haya más falsos positivos puede ayudar. Si ninguna combinación de la pirámide funciona, entonces se debe adquirir un nuevo conjunto de datos utilizando diferentes perlas fluorescentes.

Ahora proceda con el registro de las detecciones y realice una deconvolución de vista múltiple desde la pila. LSFM es un método ideal para obtener imágenes de los procesos de desarrollo a múltiples escalas, desde estructuras intercelulares hasta células y tejidos completos, durante largos períodos de tiempo. Se pueden capturar eventos intercelulares muy rápidos a alta resolución, como el crecimiento de microtúbulos en células neuroprogenitoras.

A partir de una sola película, es posible cuantificar el crecimiento de los microtúbulos. Las estructuras intracelulares se pueden seguir durante muchas horas, como el centrosoma dentro de las células ganglionares de la retina. El comportamiento de una sola célula se puede extraer de imágenes de tejido completo, como la ubicación trans de una célula ganglionar a través de la retina.

La deconvolución de múltiples vistas crea una pila Z isótropa combinando varias vistas diferentes mediante la función de dispersión de puntos. Esto proporciona imágenes muy mejoradas en comparación con las vistas individuales o las fusiones de promedio ponderado. Por ejemplo, la transformación de la vesícula óptica en una copa óptica se puede estudiar a partir de cortes ópticos en diferentes orientaciones a través del conjunto de datos mostrado.

Además, la buena calidad de imagen en general, incluso en el interior del embrión, es evidente. Por ejemplo, cuando se visualiza la morfogénesis de la copa óptica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo montar una imagen de embriones de pez cebra en un microscopio de lámina de luz.

Y cómo procesar conjuntos de datos multivista en Figi. Una vez dominado, tomará alrededor de dos horas comenzar un experimento de lapso de tiempo en un microscopio de lámina de luz. El análisis de datos posterior llevará mucho más tiempo.

Podría ser beneficioso usar un clúster de equipos para esa tarea. Puede encontrar más consejos prácticos, consejos para la resolución de problemas y enlaces a otros recursos en el protocolo de texto. Tiene que haber suficiente capacidad de almacenamiento y un plan claro de tuberías de procesamiento de datos disponible antes del experimento.

Si tiene algún problema, pregunta o solicitud futura, consulte el sitio web de características respectivo o los problemas de archivos en los repositorios de github respectivos.