Name: Utilización de hojas de luz de microscopía de fluorescencia a la imagen de ojo de pez cebra Desarrollo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: Aprenda a utilizar microscopía de hoja de luz para imaginar el desarrollo ocular en embriones de pez cebra con alta resolución espacial y temporal. Este método permite visualizar eventos morfogenéticos en tiempo real con baja fototoxicidad.

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Queremos agradecer a Tobias Pietzsch por proporcionar su potente software de código abierto BigDataViewer. Agradecemos a la Instalación de Microscopía Óptica del Instituto Max Planck de Biología Celular Molecular y Genética (MPI-CBG), a saber, Jan Peychl, Sebastian Bundschuh y Davide Accardi por la asistencia técnica, el perfecto mantenimiento de los microscopios utilizados en el estudio y por los comentarios sobre el manuscrito y H. Moon (MPI-CBG Scientific Computing Facility) por el BigDataServer. Agradecemos a Julia Eichhorn por montar la película 1. Los miembros del laboratorio Norden y Svea Grieb proporcionaron muchos comentarios útiles sobre el manuscrito. Jaroslav Icha, Christopher Schmied y Jaydeep Sidhaye son miembros de la Escuela Internacional de Investigación Max Planck de Biología Celular, del Desarrollo y de Sistemas y estudiantes de doctorado en la Universidad Técnica de Dresde. Pavel Tomancak cuenta con el apoyo de la beca ERC Starting Grant: Quantitative Analysis of the Hourglass Model of Evolution of Development and Human Frontier Science Program Young Investigator grant RGY0093/2012. Caren Norden cuenta con el apoyo del Programa de Ciencia de la Frontera Humana (CDA-00007/2011) y la Fundación Alemana de Investigación (DFG) [SFB 655, A25].

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La publicación de este video-artículo es apoyado por Zeiss.

La morfogénesis es el proceso que da forma el embrión y, junto con el crecimiento y la diferenciación impulsa la ontogenia de un huevo fecundado en un organismo multicelular maduro. Los procesos morfogenéticos durante el desarrollo de los animales se pueden analizar mejor mediante imágenes de los especímenes vivos intactos 1-3. Esto es porque tal formación de imágenes embrión entero conserva todos los componentes que generan y regulan el desarrollo, incluyendo los gradientes de moléculas de señalización, matriz extracelular, vasculatura, inervación, así como propiedades mecánicas del tejido circundante. Para salvar las escalas, en las que se produce la morfogénesis, los acontecimientos subcelulares rápidas tienen que ser capturado en una escala temporal minutos en el contexto del desarrollo de todo el tejido durante horas o días. Para cumplir con todos estos requisitos, se ha desarrollado una aplicación moderna 4 de la ortogonal microscopio plano de iluminación 5. Originalmente, fue nombrado el plano de iluminación selectiva de Microscopía (SPIM) 4; ahora una hoja de luz que todo lo abarca término microscopía de fluorescencia (LSFM) se utiliza normalmente. LSFM permite obtener imágenes en alta resolución en el tiempo, mientras que induce menos fototoxicidad de escaneo láser o disco giratorio microscopios confocales 6,7. Hoy en día, ya hay muchas implementaciones del principio básico de hoja de luz de iluminación y se ha utilizado para la imagen una gran variedad de muestras y procesos que antes eran inaccesibles para los investigadores 8-11. En primer lugar, quisiéramos destacar varias ventajas clave de LSFM sobre los enfoques de microscopía confocal convencionales: Para obtener resultados significativos a partir de imágenes en vivo experimentos microscópicas, es importante que la observación sólo afecta mínimamente la muestra. Sin embargo, muchos organismos incluyendo el pez cebra son muy susceptibles a la exposición a la luz láser, por lo que es difícil de imagen en un microscopio confocal de alta resolución de tiempo sin ef fototoxicidaddefectos como 6,7 estancamiento del desarrollo o retraso. LSFM es actualmente la técnica de imágenes de fluorescencia con los menores efectos perturbadores en la muestra 7. Dado que la hoja delgada luz láser ilumina sólo la parte de la muestra que se forma la imagen en un punto de tiempo determinado, el microscopio de lámina de luz es el uso de fotones de manera muy eficiente. En consecuencia, la baja exposición a la luz para observaciones con lapso de tiempo más largos de los especímenes más sanos, por ejemplo 12-17. Por otra parte, gracias a la mínima invasividad de LSFM, el número de imágenes adquiridas ya no está dictada por la cantidad de luz que la muestra puede tolerar, sino más bien por la cantidad de datos pueden ser procesados ​​y almacenados. En la misma línea de mantener la muestra en condiciones fisiológicas cerca, LSFM viene con el montaje de la muestra estrategias alternativas muy adecuados para los embriones vivos. En las técnicas de LSFM, los embriones se insertan típicamente dentro de una delgada columna de agarosa de bajo porcentaje. el mounting en cilindros de agarosa permite la completa libertad de rotación, por lo que la muestra se puede observar desde el ángulo perfecto (en LSFM denomina vista) y desde varios puntos de vista al mismo tiempo. La proyección de imagen de múltiples vistas y la fusión de múltiples vistas posterior es beneficioso sobre todo para grandes muestras de dispersión, y permite la captura de ellos con alta resolución, isotrópico. Un resumen de otras estrategias posibles de montaje LSFM se puede encontrar en el manual oficial de explotación del microscopio, en el capítulo sobre la preparación de la muestra escrito por el laboratorio de E. Reynaud. Es una lectura recomendable, especialmente si el objetivo es a diferentes muestras de imagen que se describe aquí. La adquisición de imágenes en LSFM es de gran campo, basado en cámaras, a diferencia de escaneo láser confocal microscopio. Esto resulta en una señal a una mayor relación de ruido (SNR) de las imágenes adquiridas y puede ser extremadamente rápido (decenas a cientos de cuadros por segundo). La alta sensibilidad de LSFM permite además de imágenes de samp débilmente fluorescenteles, como factores de transcripción expresados ​​en los niveles endógenos o 18, en el futuro cercano, las proteínas endógenas etiquetados utilizando CRISPR / Cas9. La alta SNR también es importante para el éxito de análisis de imágenes aguas abajo. Se requiere que la alta velocidad no sólo para capturar procesos intracelulares rápidas, sino también a la imagen de todo el embrión desde múltiples puntos de vista suficientemente rápido. Una fusión perfecta de las varias vistas sólo se puede lograr, si el fenómeno observado no cambia durante la adquisición de estas varias pilas z procedentes de vistas separadas. Las ventajas de LSFM no vienen típicamente a expensas de la calidad de imagen. La resolución lateral de LSFM es ligeramente peor que la resolución de un microscopio confocal. Esto se debe a los objetivos de detección utilizados en LSFM tienen una menor apertura numérica (generalmente 1,0 o menos) en comparación con 1/2 a 1/3 de los objetivos de agua o la inmersión de silicio sobre la instalación de confocal estándar. Además, debido a la amplia detección de campos en LSFM (Absence de un agujero de alfiler), hay más luz fuera de foco en comparación con un microscopio confocal. La cantidad de luz fuera de foco es determinado por el espesor de la lámina de luz. Sin embargo, estas desventajas se compensan por el mayor SNR en LSFM. En la práctica, esto se traduce en imágenes de calidad similar en comparación con, por ejemplo, girando el disco de adquisición confocal 15. En consecuencia, esto permite la extracción fiable de características como las membranas celulares o núcleos, por ejemplo, por linaje de células rastreo 15,19. La resolución axial de LSFM se determina, además del objetivo de detección, por el espesor de la lámina de luz. La resolución axial de LSFM puede en algunos casos supera la resolución de los microscopios confocal. En primer lugar, la mejora en la resolución viene cuando la lámina de luz es más fina que la resolución axial del objetivo de detección, que se produce normalmente para grandes especímenes fotografiados con un objetivo bajo aumento. La segunda forma, cómo el LSFM puede ACHIEVE mejor resolución axial, es la fusión de múltiples vistas, en la que la información de alta resolución xy desde diferentes puntos de vista se combina en una sola imagen de pila. La pila fusionado resultante tiene una resolución isotrópica acercarse a los valores de la resolución en la dirección lateral 20,21. La estrategia para el registro de los múltiples puntos de vista sobre la otra se describe en este artículo se basa en el uso de perlas de poliestireno fluorescentes como marcadores fiduciarios embebidos en la agarosa alrededor de la muestra 20,21. Como resultado de la comercialización LSFM, esta técnica ya está disponible para una amplia comunidad de científicos 22. Por lo tanto, la motivación para escribir este protocolo es que esta tecnología sea accesible para los biólogos del desarrollo que carecen de experiencia práctica en LSFM y para obtener estos científicos empezaron a utilizar esta tecnología con sus muestras. Nuestro protocolo utiliza el microscopio ficha técnica de iluminación comercial, lo que constituye un microscopio conceptualmente simple tsombrero es fácil de operar. Además, nos gustaría hablar de otros protocolos recientes para obtener imágenes de pez cebra con configuraciones LSFM de fabricación casera, que podrían ser adecuados para responder a determinadas preguntas 23-25. Otra opción de entrada a LSFM son las plataformas abiertas 26,27, que utilizan los principios de libre acceso para traer la microscopía de lámina de luz a una comunidad más amplia. La documentación tanto del hardware y los aspectos del software se puede encontrar en http://openspim.org y https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/. En este protocolo, se utiliza el pez cebra teleósteos como un sistema modelo para estudiar los procesos de desarrollo con LSFM. La morfogénesis del ojo de pez cebra es un ejemplo que pone de manifiesto muchos de los beneficios de LSFM. LSFM ya se ha utilizado en el pasado para investigar el desarrollo del ojo en medaka 28 y en el pez cebra 29,30. En la etapa temprana de desarrollo del ojo que es complicado para orientar el embrión correctamente para microscopía convencional,como la yema voluminosos no permite que el embrión se encuentran en el lado con su ojo hacia el objetivo. Sin embargo, con LSFM de montaje en una columna de agarosa, la muestra puede ser reproducible posicionado. Además, durante la transición de la vesícula óptica a la etapa de copa óptica, el ojo se somete a grandes reordenamientos morfogenéticas acompañadas de crecimiento, lo que requiere la captura de una gran pila z y un gran campo de visión. También para estos desafíos LSFM es superior a la imagen confocal convencional. El proceso de formación copa óptica es tridimensional, por lo tanto es difícil de comprender y visualizar únicamente por formación de imágenes de una vista. Esto hace que las imágenes multivista con la resolución isotrópica beneficioso. Después de la formación copa óptica, la retina se vuelve cada vez más sensibles a la exposición al láser. Por lo tanto, la baja fototoxicidad asociado con LSFM es una ventaja importante para la formación de imágenes a largo plazo. Aquí presentamos un protocolo optimizado para la imagen de uno a tres días de edad embriones de pez cebra unalarvas nd con enfoque en el desarrollo del ojo. Nuestro método permite la grabación de películas a intervalos que cubren hasta 12-14 h con alta resolución espacial y temporal. Es importante destacar que, también mostramos una tubería para el procesamiento de datos, que es un paso esencial en LSFM, ya que esta técnica invariablemente genera grandes conjuntos de datos, a menudo en el rango terabyte.

<table><tbody><tr><td>Microscopio Lightsheet Z.1</td><td>Carl Zeiss Microscopía</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarosa de bajo punto de fusión</td><td>Roth</td><td>6351.1</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa de bajo punto de fusión</td><td>Sigma</td><td>A4018 o A9414</td><td></td></tr><tr><td>3-aminobenzoato de etilo metanosulfonato (MESAB/MS-222/Tricaína)</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>N-Feniltiourea (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>500 nm perlas fluorescentes rojas F-Y 050</td><td>Millipore (Estapor)</td><td>80380495</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l (1&nbsp; mm diámetro interior, marcado en negro) capilares</td><td>de la marca</td><td>701904</td><td>vende como repuesto para transferpettor</td></tr><tr><td>Émbolos de punta de teflón para 20&nbsp; &mu; l capilares</td><td>Marca</td><td>701932</td><td>vendido como pieza de repuesto para transferpettor</td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio circulares de diámetro 18 mm, espesor seleccionado 0,17&nbsp; mm</td><td>Thermo scientific (Menzel-Glaser)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Juntas tóricas para ventanas de cámara 17&times; </td><td>Pinzas de microscopía</td><td></td><td></td>Carl Zeiss de 1,5 mm</tr><tr><td>, estilo 55</td><td>Dumont</td><td>0209-55-PO</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Jeringas Luer-Lock</td><td>Becton Dickinson</td><td>300865</td><td></td></tr><tr><td>cable de extensión de 150 cm para perfusión compatible con jeringas Luer-Lock</td><td>Becton Dickinson</td><td>397400</td><td></td></tr><tr><td>Links</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enlace 1 Aplicación</td><td></td><td></td> de reconstrucción multivista<td><a href="https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration">https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration</a> <a href="http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction">http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction</a></td></tr><tr><td>Link 2 BigDataViewer</td><td></td><td></td><td><a href="https://github.com/bigdataviewer"> https://github.com/bigdataviewer</a></td></tr><tr><td>Link 3 BigDataViewer</td><td></td><td></td><td><a href="http://fiji.sc/BigDataViewer">http://fiji.sc/BigDataViewer</a></td></tr><tr><td>Link 4 Multiview reconstruction application-issues</td><td></td><td></td><td><a href="https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues">https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues</a></td></tr><tr><td>Link 5 BigDataViewer-issues</td><td></td><td></td><td><a href="https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues">https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues</a></td></tr><tr><td>Link 6 BigDataServer</td><td></td><td></td><td><a href="http://fiji.sc/BigDataServer">http://fiji.sc/BigDataServer</a></td></tr></tbody></table>

utilización de hojas de luz de microscopía de fluorescencia a la imagen de ojo de pez cebra desarrollo

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

La microscopía de fluorescencia de lámina de luz (LSFM) está ganando cada vez más popularidad como método para obtener imágenes del desarrollo embrionario. Las principales ventajas de LSFM en comparación con los sistemas confocales son su baja fototoxicidad, estrategias de montaje suaves, adquisición rápida con una alta relación señal/ruido y la posibilidad de obtener imágenes de muestras desde varios ángulos (vistas) durante largos períodos de tiempo. La creación de imágenes desde múltiples vistas libera todo el potencial de LSFM, pero al mismo tiempo puede crear conjuntos de datos del tamaño de un terabyte. El procesamiento de estos conjuntos de datos es el mayor desafío de usar LSFM. En este protocolo esbozamos algunas soluciones a este problema. Hasta hace poco, LSFM se realizaba principalmente en laboratorios que tenían la experiencia para construir y operar sus propios microscopios de lámina de luz. Sin embargo, en los últimos tres años se pusieron a disposición varias implementaciones comerciales de LSFM, que son multipropósito y fáciles de usar para cualquier biólogo del desarrollo. Este artículo está dirigido principalmente a aquellos investigadores que no son desarrolladores de tecnología LSFM, pero que desean emplear LSFM como una herramienta para responder preguntas específicas de biología del desarrollo. 
Aquí, utilizamos imágenes del desarrollo del ojo del pez cebra como ejemplo para introducir al lector a la tecnología LSFM y demostramos las aplicaciones de LSFM en múltiples escalas espaciales y temporales. Este artículo describe un protocolo experimental completo que comienza con el montaje de embriones de pez cebra para LSFM. A continuación, describimos las opciones para obtener imágenes utilizando el microscopio de lámina de luz disponible en el mercado. Es importante destacar que también explicamos una canalización para el posterior registro y fusión de conjuntos de datos multivista utilizando una solución de código abierto implementada como un complemento de Fiji. Si bien este protocolo se centra en la obtención de imágenes del ojo de pez cebra en desarrollo y en el procesamiento de datos de una configuración de imagen en particular, la mayoría de las ideas y sugerencias de solución de problemas que se presentan aquí son de uso general y el protocolo se puede adaptar a una variedad de experimentos de microscopía de lámina de luz.

LSFM es un método ideal para obtener imágenes de los procesos de desarrollo a través de escalas. Varias aplicaciones se compilan aquí que muestra imágenes a corto y largo plazo de las estructuras intracelulares, así como células y tejidos enteros. Estos ejemplos también demuestran que LSFM es una herramienta útil en diversas etapas de desarrollo de los ojos de la formación de copa óptica de la neurogénesis en la retina. Película 1 sirve como una ilustración de la orientación general LSFM, primero que muestra una vista ampliada de un embrión intacto en el la incrustación de cilindro de agarosa en campo claro y más tarde que muestra una vista detallada de la retina en el canal de fluorescencia. <img alt="película 1" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie1.jpg" /> Película 1:. LSFM de la retina del pez cebra Para ilustrar el enfoque LSFM, esta película muestra por primera vez en el campo claro que el embrión se forma la imagen intacta dentro de la unagarose cilindro antes de cambiar a la fluorescencia. Más adelante se muestra que el gran campo de visión permite la observación de toda la retina. A continuación, la película muestra una pequeña región ampliada de la retina para destacar la buena resolución subcelular. Un Ath5: diferencia-GFP 37 embrión de pez cebra transgénico se utilizó para la imagen. Este transgén etiquetas de diferentes neuronas en la retina (principalmente células ganglionares y precursores fotorreceptoras). La parte de la fluorescencia de la película fue capturado como un único punto de vista de grabación con iluminación de doble cara mediante el objetivo 40X / 1.0 W con intervalos de 5 minutos. Se muestra la proyección de intensidad máxima de un grueso volumen de 30 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie1.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.</a> Película 2 demuestra, cómo los eventos intracelulares muy rápidas se pueden capturar con alta resolución; en este caso el crecimiento de los microtúbulos ensu plus termina en las células progenitoras neuronales de la retina. La información contenida en la película permite el seguimiento y cuantificación de los microtúbulos más extremo crecimiento. <img alt="película 2" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie2.jpg" /> Película 2:. Dinámica de los microtúbulos en una sola célula Esta película capta cada vez más consejos de microtúbulos marcados por la punta, más proteína marcadora EB3-GFP 38. La proteína se expresa en una única célula progenitora de la retina. Los microtúbulos están creciendo predominantemente en la dirección de apical a basal (de arriba abajo). La velocidad media de los cometas EB3 se midió como 0,28 ± 0,05 m / seg. El punto brillante en la parte apical de la célula que presenta actividad de nucleación de microtúbulos alta es el centrosoma. El embrión de tipo salvaje fue inyectado con Hsp70: plásmido ADN EB3-GFP. La película fue adquirido 4 horas después del choque de calor (15 minutos a 37 ° C) en alrededor de 28 fertiliz hrpostación (HPF) como una sola grabación con iluminación a una cara vista usando los intervalos de tiempo objetiva y 1 seg 63X / 1.0 W. La célula solo fue recortada a partir de un campo de visión que cubre la mayor parte de la retina. La intensidad máxima se muestra la proyección de dos rebanadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie2.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.</a> La figura 3 muestra, cómo las estructuras intracelulares pueden ser seguidos durante muchas horas. Aquí, el centrosoma en la translocación de las células ganglionares de la retina (CGR) es capturado. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig3.jpg" /> Figura 3:. Localización Centrosoma durante la translocación de células ganglionares de la retina Este montaje de un experimento de lapso de tiempo muestra la posición del centrosoma durante toda la maduración de las células ganglionares de la retina (RGC).En los progenitores neuronales del centrosoma se localiza en la punta del proceso apical (1:00). Durante la división celular, los dos centrosomas sirven como postes para el huso mitótico (2:25). Esta división da lugar a una célula hija que se diferencia en una de las CGR y una segunda célula hija que se convierte en un precursor de las células fotorreceptoras. Después de la división, el cuerpo celular de la RGC se transloca a la parte basal de la retina, mientras que el proceso apical permanece unido en el lado apical. Una vez que el RGC alcanza la parte basal, su proceso apical y se separa el centrosoma viaja con él (6:15). El centrosoma se puede seguir mientras se retrae gradualmente junto con el proceso apical (6:50, 7:20, 8:10). En el último cuadro (08:55) las células ganglionares está creciendo un axón de su parte basal, mientras que el centrosoma está aún localizada apicalmente. El mosaico de expresión se logró mediante la inyección de plásmido ADN en embriones de tipo salvaje en una etapa de células. Las células se visualizaron mediante la Ath5: GFP-CAAX (verde) constRUCT, que las etiquetas de las CGR y otras neuronas. Los centrosomas (puntas de flecha) son etiquetados por Centrin-29 tdTomato expresión (magenta). El lado apical de la retina es en la parte superior de la imagen y el lado basal en la parte inferior. Se muestra la proyección de intensidad máxima de un grueso volumen de 30 micras. Las imágenes fueron recortadas de una película que cubre toda la retina. La película comienza en alrededor de 34 horas después de la fecundación (HPF). Una pila z fue adquirido cada 5 min con el objetivo de 40X / 1,0 W. El tiempo se muestra en el formato hh: mm. La barra de escala representa 10 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> En la Figura 4 se muestra, cómo el comportamiento de una sola célula se puede extraer de los datos de captura de todo el tejido, tal como en la película 1. Translocación de un RGC puede ser fácilmente rastreado y su proceso apical y basalES seguidos. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig4.jpg" /> Figura 4:. Translocación de una sola célula ganglionar de la retina La translocación RGC de apical a lado basal de la retina se produce después de la mitosis terminal como se describe en la Figura 3 La RGC está marcado por la expresión de la Ath5:. GAP-GFP 37 transgén. Se muestra la proyección de intensidad máxima de un grueso volumen de 30 micras. Las imágenes fueron recortadas de una película que cubre toda la retina. La película comienza en alrededor de 34 HPF. Una pila z fue adquirido cada 5 min con el objetivo de 40X / 1,0 W. El tiempo se muestra en el formato hh: mm. La barra de escala representa 5 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> La Figura 5 demuestra la capacidad de LSFM multiview para capturar tejido scprocesos morfogenéticos Ale con celulares de resolución en el ejemplo de la morfogénesis copa óptica, durante el cual vesícula óptica se transforma en una copa óptica. La calidad de la imagen se puede mejorar enormemente por imágenes multivista, cuando la imagen final se combina de la información de 5 puntos de vista diferentes (en este caso) en una pila de z con la resolución isotrópica. Esta figura ilustra la mejora en la calidad de la imagen después de la fusión promedio ponderado y más ganancia en la imagen de contraste y resolución después de deconvolución multivista. La figura muestra dos rebanadas ópticos en diferentes orientaciones a través del conjunto de datos. Además, un montaje del conjunto de datos deconvolved muestra la morfogénesis copa óptica con el tiempo. Todos los tiempos se muestran a continuación en la película 3. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig5.jpg" /> Figura 5: Comparación de la calidad de imagen entre visión única y dos métodos de MultiVoie fusión. (A) Una rebanada óptica de datos de vista individuales que se muestran desde la vista lateral y (B) vista dorsal. artefactos de banda y la degradación de la señal más profundo dentro de la muestra son evidentes. También una parte de la imagen visible en los datos fusionados (CF) no fue capturado en esta vista particular. (C) El mismo corte óptico, ahora como datos multiview fusionado muestran desde la vista lateral y (D) vista dorsal. Tenga en cuenta que los artefactos de la raya y se suprimen las estructuras profundas en la muestra están mejor resueltos. (E) El mismo corte óptico ahora como multiview deconvolved datos que se muestran desde la vista lateral y (F) vista dorsal. Tenga en cuenta el aumento del contraste y resolución para las membranas de las células individuales y los núcleos pueden ser bien distinguida. La resolución no se deteriora notablemente más profundo dentro de la muestra. El conjunto de datos fue adquirido con la iluminación de dos caras a partir de 5 puntos de vista de aproximadamente 20 grados. Las pilas de z abfuera 100 m con 1,5 micras tamaño de paso se adquirieron en cada vista en intervalos de 10 min durante 10 horas con el objetivo 20X / 1,0 W. imágenes de entrada para la fusión multiview y deconvolución se muestrearon abajo 2 × para acelerar el procesamiento de imágenes. se llevaron a cabo 15 iteraciones de la deconvolución de múltiples vistas. (G) El montaje muestra un área recortada de la vista dorsal partir de los datos deconvolved para resaltar los eventos morfogenéticos durante el desarrollo del ojo temprano de la vesícula óptica a la etapa de copa óptica. Las dos capas de la vesícula óptica, que son epitelios columnar inicialmente similares, se diferencian en las poblaciones de células distintas. La capa distal cerca de la epidermis se convierte en el neuroepitelio de la retina (RN) y la capa proximal cerca del tubo neural se convierte en el epitelio pigmentario de la retina (RP). Las células en la alargado RN y invaginate para formar la copa óptica (1:40-5:00); al mismo tiempo, las células se aplanan RP. El ectodermo de superficie es inducida para formar una lente (01:40), whinvagina ich tarde (5:00). La película empieza a las 17 HPF. El tiempo se muestra en el formato hh: mm. Todas las membranas celulares son etiquetados por la β-actina: transgén ras-GFP y todos los núcleos están etiquetados por la Hsp70: H2B-RFP transgén. La barra de escala representa 30 micras. FB cerebro anterior, la lente LE, OP placoda olfativa, RN neuroepitelio de la retina, el epitelio pigmentario de la retina RP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie3.jpg" /> Película 3: Óptica taza de morfogénesis muestra con vista única y dos métodos de fusión multiview La película de lapso de tiempo ilustra el proceso completo de la morfogénesis copa óptica de la vesícula óptica a la etapa de copa óptica.. Muestra una sola rebanada óptica de la vista lateral (arriba) y una sola rebanada óptica de la vista dorsal (parte inferior). Las células de la vesícula óptica en desarrollo experimentan reordenamientos complejos para formar finalmente la copa óptica hemisférica con el neuroepitelio retiniana interna y el epitelio pigmentario de la retina externa. Una lente se forma a partir del ectodermo superficie. Se invagina junto con el neuroepitelio y se sienta en la copa óptica. Todas las membranas celulares se etiquetan mediante la expresión de la β-actina: GFP-ras transgén (verde) y los núcleos se etiquetan con Hsp70: H2B-RFP (magenta). La película comienza en alrededor de 17 HPF. El conjunto de datos fue adquirido con la iluminación de doble cara a partir de 5 puntos de vista de aproximadamente 20 grados de separación y az pilas de alrededor de 100 micras fueron adquiridas cada 10 minutos con el objetivo 20X / 1.0 W. El tiempo se muestra en el formato hh: mm. La barra de escala representa 50 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie3-final.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

La microscopía de fluorescencia de lámina de luz es una excelente herramienta para obtener imágenes del desarrollo embrionario. Permite la grabación de vídeos de largo lapso de tiempo de embriones vivos en condiciones casi fisiológicas. Demostramos su aplicación para obtener imágenes del desarrollo del ojo del pez cebra a través de amplias escalas espacio-temporales y presentamos una línea para la fusión y deconvolución de conjuntos de datos multivista.

Utilización de hojas de luz de microscopía de fluorescencia a la imagen de ojo de pez cebra Desarrollo

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

El objetivo general de este protocolo experimental es obtener imágenes del desarrollo ocular del embrión de pez cebra en el microscopio de lámina de luz y procesar el conjunto de datos multivista adquirido en Figi a través del complemento de la aplicación de reconstrucción multivista. Este método puede ayudarte a comprender los eventos morfogenéticos en el desarrollo animal. La principal ventaja de este método es que se pueden observar eventos morfogenéticos en el embrión en desarrollo intacto con alta resolución espacial y temporal.La principal ventaja de la microscopía de lámina de luz es la baja fototoxicidad del método, el rápido tiempo de adquisición con el que se puede obtener una imagen de la muestra y que se puede obtener una imagen de la muestra desde varios ángulos, las llamadas vistas. La captura de la muestra desde diferentes vistas nos permite superar la degradación de la señal y del eje establecido. Estas diferentes imágenes se pueden utilizar y registrar utilizando microesferas fluorescentes alrededor de la muestra.Podemos reconstruir el volumen tridimensional alcanzando la resolución isotrópica. Aunque demostramos el uso de la microscopía de fluorescencia de lámina ligera para el desarrollo del ojo del pez cebra, este método también se puede utilizar para responder a diversas preguntas en biología del desarrollo y neurociencia utilizando varios organismos modelo. Para empezar, atornille el objetivo de detección en el microscopio mientras mantiene los objetivos iluminadores cubiertos.A continuación, destape los objetivos y deslice con cuidado la cámara de muestras en el microscopio. Asegure la cámara apretando el tornillo. A continuación, conecte la sonda de temperatura y el bloque Peltier al microscopio.Los dos tubos que hacen circular el líquido refrigerante para el bloque peltier son compatibles con ambos conectores y pueden funcionar en cualquier orientación. A continuación, use una jeringa para cargar la cámara a través de la jeringa con solución hasta el borde superior de las ventanas de la cámara y verifique si hay fugas. Ahora, encienda el microscopio, la computadora y la incubación.Inicie el software operativo del microscopio y ajuste la temperatura de incubación a 28,5 grados centígrados. Mientras la temperatura lo requiere durante una hora, prepare la muestra. Comience preparando la agarosa.Derretir una alícuota preparada de un mililitro de agarosa de bajo punto de fusión al 1% en un medio E tres a 70 grados centígrados. Después de unos 15 minutos, transfiera 600 microlitros de agarosa fundida a un tubo nuevo de 1,5 mililitros y agregue 250 microlitros de medio E tres, 50 microlitros de 0,4% MS 222 y 25 microlitros de solución de material de perlas fluorescentes de vórtice. Coloque el tubo en un bloque calefactor a unos 39 grados centígrados para que la agarosa se acerque a su punto de gelificación.A continuación, empuje los émbolos con punta de teflón hasta el fondo de los capilares de vidrio de un milímetro de diámetro interior. Prepara cinco de estos. Ahora, vórtice brevemente la mezcla de agarosa y luego transfiera cinco embriones con la mínima cantidad de líquido en ella.A continuación, se introduce un capilar y se aspira un embrión con la cabeza. La cabeza debe entrar antes que la cola y no puede haber burbujas de aire. Extraiga suficiente solución para que haya aproximadamente dos centímetros de agarosa por encima del embrión y un centímetro de agarosa por debajo.Extrae un embrión en cada capilar antes de continuar. Este paso requiere algo de práctica para dominarlo. Prepárese para ello utilizando embriones no valiosos.Cuando la agarosa se solidifique completamente, almacene las muestras en un medio E tres apoyando los capilares en una pared de vaso de precipitados con plastilina con la abertura inferior en solución. Ahora ensamble el portamuestras. Primero, inserte dos fundas de plástico del tamaño correcto una contra la otra en el vástago.Las aberturas de las mangas deben mirar hacia afuera. A continuación, coloque un tornillo de sujeción. E inserte el capilar a través del soporte hasta que la banda de color negro se haga visible en el otro lado.Evite tocar el émbolo. A continuación, apriete el tornillo de sujeción. A continuación, empuja un centímetro de agarosa fuera del capilar y recórtalo.A continuación, inserte el vástago en el disco portamuestras. Antes de cargar el disco de muestra, compruebe que la platina esté en la posición superior del software de control. A continuación, utilice los rieles guía para deslizar el soporte y la muestra hacia el microscopio.Ahora, imagine la muestra elegida como se describe en el protocolo de texto. El tratamiento de los datos se realiza en Figi. Es una distribución de ImageJ.Antes de comenzar, Figi debe actualizarse. Guarde el conjunto de datos de imagen adquirido en una sola carpeta. Los archivos intermedios del procesamiento de la imagen se guardarán en la misma carpeta.Ahora, inicie la aplicación de reconstrucción de vistas múltiples. A continuación, defina un nuevo conjunto de datos. Seleccione la opción Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset LOCI Bioformats y cree un nombre para el archivo de datos de salida.A continuación, seleccione el primer archivo CZI del conjunto de datos. Los metadatos se cargarán automáticamente. En los metadatos de la imagen, comprueba que el número de ángulos, los canales, las iluminaciones y el tamaño del vóxel estén configurados correctamente.Al presionar OK, se abre una ventana de registro, la ventana del explorador de configuración de vista y una ventana de consola. El explorador de configuración de vistas proporciona una interfaz fácil de usar. Seleccione los archivos que deben procesarse y presione el botón derecho del mouse.Se abrirá una nueva ventana que muestra los diferentes pasos de procesamiento a medida que se ejecutan. En la esquina superior derecha están los botones de información y guardar. Info muestra un resumen del contenido del archivo de datos guardado y, al pulsar guardar, se guardarán los resultados del procesamiento.De lo contrario, el programa no guarda los resultados de los pasos de procesamiento. Para volver a guardar todo el conjunto de datos, primero, seleccione todos los archivos presionando Ctrl + A y haciendo clic con el botón derecho. A continuación, seleccione Volver a guardar conjunto de datos y Como HDF5.A continuación, se debe marcar la confirmación de la acción de volver a guardar. Después de unos minutos, para cada punto de tiempo, el programa indicará cuándo se ha completado el reguardado. A continuación, proceda a la detección de puntos de interés en los datos.Seleccione todos los puntos de tiempo pulsando Ctrl+A y haga clic con el botón derecho. Para seleccionar, detecte puntos de interés. En las opciones, seleccione diferencia de gaussiano.Y seleccione, hacia abajo, imágenes de muestra antes de la segmentación. En la siguiente ventana, elija la configuración de detección. En las opciones de localización de subpíxeles, seleccione Ajuste cuadrático tridimensional.A continuación, en la especificación del punto de interés, seleccione interactivo. Para la opción XY de muestra descendente, seleccione coincidir con la resolución Z. Y para la muestra Z hacia abajo, seleccione 1x.A continuación, ejecute la operación seleccionando la opción Calcular en Java de CPU. En la ventana emergente, seleccione una vista para probar los parámetros. Una vez que se cargue la vista, ajuste el brillo y el contraste presionando Ctrl + Shift + C en el teclado.Además, para la detección de cuentas, cambie la opción de aspecto a verde máximo. Ahora observe la segmentación como anillos verdes alrededor de las detecciones. Ajuste los valores de diferencia de gaussien para los parámetros sigma one y threshold para segmentar de forma óptima los cordones con el número mínimo de falsos positivos.Cada cuenta solo debe detectarse una vez. Después de determinar los parámetros óptimos, presione listo. Después de que la computadora carga, cada vista individual del punto de tiempo y segmenta las cuentas, el programa genera un archivo de registro con el número de cuentas que detectó por vista.Debe haber entre 600 y varios miles de cuentas por vista. De lo contrario, es necesario ajustar los parámetros de detección. Este es un proceso complicado.La pirámide de detección rara vez es precisa en el primer intento y los reinicios pueden variar entre los puntos de tiempo de una película. Relajar el fresco detectará todas las perlas reales y permitirá que haya más falsos positivos puede ayudar. Si ninguna combinación de la pirámide funciona, entonces se debe adquirir un nuevo conjunto de datos utilizando diferentes perlas fluorescentes.Ahora proceda con el registro de las detecciones y realice una deconvolución de vista múltiple desde la pila. LSFM es un método ideal para obtener imágenes de los procesos de desarrollo a múltiples escalas, desde estructuras intercelulares hasta células y tejidos completos, durante largos períodos de tiempo. Se pueden capturar eventos intercelulares muy rápidos a alta resolución, como el crecimiento de microtúbulos en células neuroprogenitoras.A partir de una sola película, es posible cuantificar el crecimiento de los microtúbulos. Las estructuras intracelulares se pueden seguir durante muchas horas, como el centrosoma dentro de las células ganglionares de la retina. El comportamiento de una sola célula se puede extraer de imágenes de tejido completo, como la ubicación trans de una célula ganglionar a través de la retina.La deconvolución de múltiples vistas crea una pila Z isótropa combinando varias vistas diferentes mediante la función de dispersión de puntos. Esto proporciona imágenes muy mejoradas en comparación con las vistas individuales o las fusiones de promedio ponderado. Por ejemplo, la transformación de la vesícula óptica en una copa óptica se puede estudiar a partir de cortes ópticos en diferentes orientaciones a través del conjunto de datos mostrado.Además, la buena calidad de imagen en general, incluso en el interior del embrión, es evidente. Por ejemplo, cuando se visualiza la morfogénesis de la copa óptica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo montar una imagen de embriones de pez cebra en un microscopio de lámina de luz.Y cómo procesar conjuntos de datos multivista en Figi. Una vez dominado, tomará alrededor de dos horas comenzar un experimento de lapso de tiempo en un microscopio de lámina de luz. El análisis de datos posterior llevará mucho más tiempo.Podría ser beneficioso usar un clúster de equipos para esa tarea. Puede encontrar más consejos prácticos, consejos para la resolución de problemas y enlaces a otros recursos en el protocolo de texto. Tiene que haber suficiente capacidad de almacenamiento y un plan claro de tuberías de procesamiento de datos disponible antes del experimento.Si tiene algún problema, pregunta o solicitud futura, consulte el sitio web de características respectivo o los problemas de archivos en los repositorios de github respectivos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

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