Name: Desarrollo de una In Vitro Ensayo para evaluar la función contráctil de las células mesenquimales que la transición epitelio-mesenquimal Sufrió (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Aprende a evaluar la contractilidad de células mesenquimales post-EMT mediante un ensayo de contracción de gel. Esta técnica accesible permite estudiar fibrosis pulmonar y remodelación de vías aéreas.

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Agradecemos al Dr. Tadashi Koyama por su ayuda técnica. Este trabajo fue apoyado en parte por los números de subvención JSPS KAKENHI 23249045, 15K09211, 15K19172; una subvención al Grupo de Investigación en Insuficiencia Respiratoria del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar de Japón; una beca para la investigación sobre enfermedades alérgicas e inmunología, Japón.

1. Preparación y cultivo de células epiteliales de pulmón <ol><li> células epiteliales de pulmón humano A549 Cultura (línea de células adherentes) en de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 UI / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina. </li><li> Retirar y desechar el medio de cultivo celular de placa de cultivo, y se lava una vez con 5 - 10 ml de tampón fosfato salino (PBS). Después del lavado, aspirar inmediatamente a la PBS. </li><li> Añadir 2 ml de ácido tripsina / etilendiaminotetraacético (EDTA) (0,05%) y se incuba a 37 ° C y 5% de CO2 durante 3 min. </li><li> Recoger las células separadas en tubos de centrífuga que contiene medio de cultivo de células, centrifugar los tubos a temperatura ambiente durante 4 min a 150 x g. </li><li> Resuspender el pellet de células en 2 ml de medio de cultivo celular y retirar una muestra para el recuento de células. Contar el número de las células utilizando un hemocitómetro con tripán azul mancha para comprobar la viabilidad celular. </li><li> células A549 semilla en10 placas de poliestireno cm a una densidad de 0,5 - 1,0 x 10 6 células / placa con 10 ml de medio para el ensayo de contracción de gel. Sembrar las células en placas de 6 pocillos de poliestireno a una densidad de 0,5 - 1,0 x 10 5 células / pocillo con 2 ml de medio para la confirmación de la EMT. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO2 durante 24 horas. </li></ol> 2. Procedimiento de EMT <ol><li> Añadir 10 l de TGF-β1 (5 g / ml) y 10 l de TNF-α (10 g / ml) a la placa para el ensayo de contracción de gel sembrado en el paso 1.6. Añadir 2 l de TGF-β1 (5 g / ml) y 2 l de TNF-α (10 g / ml) a la placa para la confirmación EMT cabeza de serie en el paso 1.6. Se incuba a 37 ° C y 5% de CO2 durante 48 horas. </li></ol> 3. Confirmación de Procedimiento EMT por PCR y Western Blotting <ol><li> Confirmar cambio en la morfología (de similar a la piedra del adoquín al husillo forma) de las células tratadas utilizando microscopía de contraste de fase. Nota: Normacélulas de Al A549 tienen adoquín apariencia similar a la piedra y de forma triangular que es una característica de las células epiteliales, pero después de la estimulación con TGF-β1 y TNF-α, las células aparecen de largo y en forma de huso que es similar a las células mesenquimales 14,15. </li><li> Evaluar la expresión de un marcador epitelial, tales como E-cadherina, y los marcadores mesenquimales tales como N-cadherina, vimentina y actina de músculo liso α-utilizando PCR o Western Blot. <ol><li> Extraer el ARN total de las células usando el kit de extracción de ARN 16 y sintetizar cDNA utilizando la transcriptasa inversa 17 de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Medir la expresión de los niveles de mRNA utilizando el sistema de PCR en tiempo real 18 y tinte de cianina monomérica kit PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores específicos para GAPDH (gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa), ACTA2 (alfa-actina-2), CDH1 (cadherina-1; E-cadherina) y VIM (vimentina) se muestran en la Tabla 1 </strong&gt;. </li><li> Lisar las células utilizando un tampón de lisis (Tabla 2) que contenía 1% de cóctel inhibidor de proteasa. Medir todas las concentraciones de proteína de la muestra utilizando un kit de ensayo de proteínas de 19,20, y aplicar las mismas cantidades de proteína en un gel de poliacrilamida. <ol><li> Realizar SDS-electroforesis en gel y transferencia semiseca de las proteínas a una membrana de PVDF 21. Incubar la membrana con anticuerpos primarios en tampón de bloqueo durante 1 - 2 hr. Después de la incubación, lavar dos veces la membrana con tampón de lavado y se incuba la membrana hr 1 con segundos anticuerpos. Nota: Véase la Tabla de Materiales / Equipo de anticuerpos y diluciones utilizadas en estos estudios. Véase la Tabla 2 para los componentes del tampón de bloqueo. </li><li> Lavar la membrana con tampón de lavado dos veces. Tome fotos de la membrana con el kit de detección de Western Blot 22 utilizando una cámara CCD de 11,23 frío. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Gel Ensayo de contracción para la EMT Evaluación <ol><li> Aspirar el medio acondicionado desde el recipiente de cultivo de células, y lavar bien con 5 - 10 ml de PBS para eliminar las células muertas. Después del lavado, aspirar inmediatamente a la PBS. </li><li> Añadir 2 ml de 0,05% de tripsina / EDTA y se incuba a 37 ° C y 5% de CO2 durante 3 min. </li><li> Recoger las células separadas en tubos de centrífuga que contienen DMEM complementado con inhibidor de tripsina (1 mg / ml), centrifugar los tubos a temperatura ambiente durante 4 min a 150 x g. </li><li> Mezclar tipo gel 1 de colágeno con agua destilada, y 4 × DMEM concentrado para ajustar los volúmenes para lograr una concentración de colágeno de 1,75 mg / ml, y 1 × concentración DMEM. Asegúrese de mantener el medio de gel en hielo durante este paso. Nota: Para hacer 6 ml de medio de gel, mezclar bien 3,5 ml de tipo 1 de gel de colágeno (3 mg / ml), 1,5 ml de 4 × DMEM concentrado, y 1 ml de agua destilada. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 500 l de PBS y extraer una muestra para recuento de células. Contarel número de las células utilizando un hemocitómetro con tinción de azul de tripano para verificar la viabilidad celular. </li><li> Añadir el medio de gel de ajustar los volúmenes de lograr una densidad celular de 3,0 × 10 5 células / pocillo (6,0 × 10 5 células / ml) y suavemente pero rápidamente se mezcla mediante pipeteo sin gelificación. </li><li> Dispensar 0,5 ml de la mezcla en cada pocillo de una placa no tratada de 24 pocillos de forma rápida y cuidadosamente para asegurarse de forma cilíndrica ordenada. Tenga cuidado de no permitir que las burbujas de aire que contaminan los geles (Figura 1A). Nota: El medio de gel que contiene las células es viscoso y puede gelificar fácilmente y la forma de media luna forma en el pozo. </li><li> Incubar la placa durante 15 min en un incubador de células a 37 ° C, 5% de CO2 y 95% de humedad a gel completamente. </li><li> Separar los geles de la placa sin romper moviendo una espátula esterilizada de una manera para dibujar una circunferencia en una dirección. Usando una espátula, transferir suavemente los geles a placas de cultivo de tejidos de 60 mmque contiene 5 ml de DMEM / 1% de FBS con o sin TGF-β1 (5 ng / ml) y TNF-α (10 ng / ml). </li><li> Agite con cuidado los platos para asegurar geles están flotando en el medio. Incubar en un incubador de células a 37 ° C, 5% de CO2 y 95% de humedad. </li></ol> 5. Medición de Gel Tamaño <ol><li> Medir el tamaño de gel de colágeno después de 0, 24, 48, y 72 hr utilizando un sistema de análisis de imagen. <ol><li> Encienda el sistema de documentación de geles (Figura 2A), y poner los platos en el armario de protección contra la luz. A continuación, retire la tapa de platos en el armario. </li><li> Abra el software de análisis relacionada gel. Haga clic en el botón &quot;adquisición de imágenes&quot; en la barra de menú para mostrar la imagen de los geles en el gabinete. A continuación, haga clic en &quot;adquirir&quot; en la barra de menú para tomar imágenes de los geles (Figura 2B). </li><li> Haga clic en el botón &quot;detección&quot; en la barra de menús (Figura 2C) y ajustar la región de medición (i círculo amarillon Figura 2C) arrastrando el ratón. A continuación, haga clic en el botón &quot;detectar automáticamente&quot; en la barra de menú (véase el botón en la Figura 2D). El software detecta automáticamente los geles que muestran un mapa de calor (Figura 2D). </li><li> Haga clic en &quot;OK&quot; para extraer el contorno de los geles de tratamiento de la imagen y calcular áreas rodeadas por el contorno (Figura 2E). Después se calcula el área, el área calculada se visualiza en la ventana emergente separada. Nota: Si los geles se solapan entre sí durante la exploración, geles mueva suavemente con una punta de pipeta estéril. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.

El protocolo desarrollado en este estudio comprende dos etapas. La primera etapa se realiza para inducir EMT, mientras que el segundo paso es el ensayo de contracción de gel. Dado que es importante confirmar que las células se sometieron a EMT, el paso 2 proporciona un excelente complemento a los cambios en la expresión de genes y morfológicos. Estudios anteriores demostraron que la EMT de las células A549 fue inducida por sólo el 24 por TGF-β1; Sin embargo, como hemos informado anteriormente 10, e...

Fibrosis está implicada en la patogénesis de diversas enfermedades progresivas crónicas, como la enfermedad pulmonar intersticial, fibrosis cardiaca, cirrosis hepática, insuficiencia renal terminal, la esclerosis sistémica, y las enfermedades autoinmunes 1. Entre las enfermedades pulmonares intersticiales, fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es una enfermedad progresiva crónica y muestra mal pronóstico. característica patológica de la IPF es el desarrollo de focos de fibroblasto que consiste en fibroblastos y miofibroblastos activados que están asociados con el pronóstico. Se proponen los orígenes de tales fibroblastos pulmonares que se derivan de varias células mesenquimales, incluyendo fibroblastos pulmonares residentes originalmente y que circulan fibrocitos de la médula ósea. Recientemente, se ha propuesto transición epitelio-mesenquimal (EMT) que se asocia con la formación de células mesenquimales 2, y para contribuir a la patogénesis de trastornos fibróticos. Se cree que la EMT juega un papel importante en el proceso de desarrollo fetal, la cicatrización de heridas, y la progresión del cáncer, incluyendo la invasión tumoral y la metástasis 3. Tras el proceso de EMT, las células epiteliales obtener la capacidad de las células mesenquimales por la pérdida de marcadores epiteliales, tales como la E-cadherina, y por la expresión de marcadores mesenquimales, tales como la vimentina, y α-actina de músculo liso (SMA) 4,5. Estudios anteriores mostraron la evidencia de que proceso de EMT se ha asociado con el desarrollo de fibrosis de tejidos en el riñón y el pulmón 6 7. Además, la inflamación crónica promueve la enfermedad fibrótica 8; Además, las citoquinas inflamatorias tales como miembro de la superfamilia de factor de necrosis tumoral 14 (TNFSF14; LIGHT), factor de necrosis tumoral (TNF) -α, y la interleucina-1β, se ha demostrado para mejorar EMT 9-12. ensayo de contracción de gel de colágeno, un ensayo de contracción de las células a base de colágeno en el que los fibroblastos se incrustan en el tipo Igel de colágeno tridimensional, es un ideal modelo in vitro para la evaluación de la contractilidad. La contractilidad es una de las funciones características de los fibroblastos y contribuye a la reparación de heridas normal y fibrosis 13. En este ensayo, se cree que la unión de los fibroblastos para colágeno tipo I a través de mecanismos dependientes de integrina se supone para producir tensión mecánica bajo ciertas condiciones, y en consecuencia dar lugar a la contracción del tejido. Aquí, se informa que el desarrollo del ensayo de contracción de gel que adaptarse para evaluar la adquisición de la función contráctil en las células que se sometieron a EMT. Este informe demuestra que este ensayo modificado es adecuado para la evaluación de la contractilidad de las células mesenquimales que se sometieron a EMT.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>sigma aldrich</td><td>11965-092</td><td>para A549 medio</td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>Transformando el factor de crecimiento-&beta; 1, Humano, productos químicos de laboratorio recombinantes</td><td>Wako</td><td>209-16544</td><td></td></tr><tr><td>TNF-y alfa humano recombinante;</td><td>R& D systems</td><td>210-TA/CF</td><td></td></tr><tr><td>E-Cadherin (24E10) Tecnología</td><td>de señalización de células</td> mAb de conejo<td>#3195</td><td>dilución 1:3.000</td></tr><tr><td>Vimentina (D21H3)</td><td>Tecnología de señalización de células</td> mAb de conejo<td>#5741</td> dilución <td>1:3.000</td></tr><tr><td>Anti-&alpha;-Tubulina anticuerpo</td><td>sigma aldrich</td><td>T9026</td><td>dilución 1:10.000</td></tr><tr><td>Antiactina monoclonal, &alpha;-Anticuerpo de músculo liso& nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5228</td><td>Dilución 1:10.000</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-N-cadherina</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>#610920</td><td>Dilución 1:1.000</td></tr><tr><td>IgG anti-ratón, oveja Ab entera ligada a HRP (anticuerpo secundario)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-100UL</td><td>1:20.000 dilución</td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG, Ab Donkey entero ligado a HRP (anticuerpo secundario)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-100UL</td><td>1:20.000 dilución</td></tr><tr><td>Reactivo de bloqueo</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN418</td><td>2% en TBS-T</td></tr> 6 <tr><td>pocillos Clear Flat Bottom TC-Tratado con placa de cultivo celular multipocillo, con tapa</td><td>corning</td><td>#353046</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Placa de cultivo celular</td><td>TPP</td><td>#93100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, tecnologías de vida en polvo</td><td></td><td>12100-046</td><td>Para 4&times; DMEM</td></tr><tr><td>Gel de colágeno tipo 1</td><td>Gelatina Nitta</td><td>Cellmatrix tipo I-A</td><td></td></tr><tr><td>24 pocillos placa de cultivo celular</td><td>AGC TECHNO GLASS</td><td>1820-024</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de documentación de gel&nbsp;</td><td>ATTO</td><td>AE-6911FXN</td><td>Generador de imágenes en gel</td></tr><tr><td>Software de análisis de gel</td><td>ATTO</td><td>Densitograph, ver. 3.00</td><td>software de análisis incluido con AE-6911FXN</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), Tecnologías de Vida Roja de Fenol</td><td></td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>24 Placas de Pocillos, sin tratar</td><td>IWAKI</td><td>1820-024</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Azul de Tripano, 0.4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>kit de extracción de ARN</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologías de vida con transcriptasa inversa</td><td></td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de PCR en tiempo real</td><td>Stratagene</td><td>Mx-3000P</td><td></td></tr><tr><td>SYBR kit de PCR verde</td><td>Qiagen</td><td>204145</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa (100x)</td><td>life technologies</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>Membrana</td> <td>de PVDFATTO</td><td>2392390</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas</td><td>bio-rad</td><td>5000006JA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gel de poliacrilamida</td><td>ATTO</td><td>2331810</td><td></td></tr><tr><td>reactivo de detección de Western blot</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>Cámara CCD fría</td><td>ATTO</td><td>Ez-Capture MG/ST</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de tripsina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9003-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Polioxietileno (20)Monolaurato de sorbitán</td><td>Wako Productos químicos de laboratorio</td><td>163-11512</td><td></td></tr><tr><td>Éter de polioxietileno (9) octiifenilo</td><td>Productos químicos</td> de laboratorio de Wako <td>141-08321</td><td></td></tr></tbody></table>

desarrollo de una<em&gt; in vitro</em&gt; ensayo para evaluar la función contráctil de las células mesenquimales que la transición epitelio-mesenquimal sufrió

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

La fibrosis a menudo está involucrada en la patogénesis de diversas enfermedades crónicas progresivas, como la enfermedad pulmonar intersticial. La característica patológica es la formación de focos fibroblásticos, que se asocia con la gravedad de la enfermedad. Se propone que las células mesenquimales que consisten en los focos fibroblásticos se derivan de varias fuentes celulares, incluidos los fibroblastos intrapulmonares originalmente residentes y los fibrocitos circulantes de la médula ósea. Recientemente, se ha supuesto que las células mesenquimales que se sometieron a una transición epitelio-mesenquimal (EMT) contribuyen a la patogénesis de la fibrosis. Además, la EMT puede ser inducida por el factor de crecimiento transformante β, y la EMT puede ser mejorada por citocinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral α. El ensayo de contracción en gel es un modelo in vitro ideal para la evaluación de la contractilidad, que es una de las funciones características de los fibroblastos y contribuye a la reparación de heridas y fibrosis. Aquí, se demuestra el desarrollo de un ensayo de contracción en gel para evaluar la capacidad contráctil de las células mesenquimales que se sometieron a EMT.

Durante la EMT, las células epiteliales pierden marcadores epiteliales, como E-cadherina, y obtener la expresión de marcadores mesenquimales, como la vimentina y α-actina de músculo liso 4,5. La incubación de células epiteliales de pulmón humano A549 con TGF-β1 y TNF-α induce EMT. La aparición de células A549 normales son de adoquín como la forma y la forma del triángulo que es una característica de las células epiteliales (Figura 3A), pero después de estimula...

Aquí, describimos el desarrollo y la aplicación de un ensayo de contracción en gel para evaluar la función contráctil en células mesenquimales que experimentaron una transición epitelio-mesenquimatosa.

Desarrollo de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayo para evaluar la función contráctil de las células mesenquimales que la transición epitelio-mesenquimal Sufrió

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la contractilidad de las células mesenquimales que han sufrido una transición mesenquimal epitelial inducida por citocinas inflamatorias in vitro, o EMT. Este mesénquima es una variación de la función celular básica después de la EMT inducida por respuestas inmunitarias inflamatorias, como durante la fibrosis pulmonar idiopática o la remodelación de las vías respiratorias en el asma grave. Las principales ventajas de esta técnica son que no requiere de dispositivos específicos y que demuestra un alto contenido de desmontaje.Comience lavando un cultivo de células epiteliales pulmonares humanas A-549 con cinco a diez mililitros de PBS. A continuación, separe las células adherentes con dos milímetros de tripsina-EDTA a 37 grados centígrados y un cinco por ciento de dióxido de carbono. Después de tres minutos, transfiera la suspensión celular a tubos cónicos que contengan medio de cultivo celular y centrifuga las células en una centrífuga.Vuelva a suspender los gránulos en dos milímetros de medio de cultivo celular, reservando un pequeño elocuente para el recuento. A continuación, siembre de 0,5 a 1 veces 10 a la sexta célula en diez milímetros de medio por placa de poliestiérreno de diez centímetros e incube los cultivos celulares durante 24 horas. Para la inducción de EMT, al día siguiente, trate las células con 10 microlitros de TGF beta 1 y TNF alfa, y devuelva las placas a la incubadora durante otras 48 horas.Al cuarto día, lavar los cultivos inducidos por emt con cinco a diez mililitros de pbs, luego separar las células con tripsina-EDTA como se acaba de demostrar. A continuación, centrifuga las suspensiones celulares en DMEM suplementado con inhibidor de tripsina y vuelve a suspender los gránulos en 500 microlitros de pbs. A continuación, cuente las células y añada el medio de gell recién preparado hasta una densidad de 3 veces 10 a la 5ª célula por pocillo, mezclando suave pero rápidamente la solución con pipeta antes de la gelificación.Con prontitud, pero con cuidado, dispense 0,5 mililitros de células en cada pocillo de una placa de 24 pocillos no tratada en formas cilíndricas ordenadas. A continuación, coloque la placa en una incubadora de cultivos celulares durante 15 minutos. Cuando el gel se haya solidificado por completo, mueva una espátula esterilizada en un círculo alrededor del exterior de cada gel en una dirección, para separar los geles de las placas sin que se rompan.Al retirar el gel, tenga cuidado de no mover la espátula hacia adelante y hacia atrás en el pozo. A continuación, utilice la espátula para transferir suavemente los geles a placas individuales de cultivo de tejidos de 16 milímetros que contengan cinco mililitros de DMEM suplementados con un uno por ciento de FBS, con o sin TGF beta 1 y TNF alfa. Finalmente, agite suavemente los platos para asegurarse de que los geles floten en el medio y devuelva los geles a la incubadora de cultivos celulares.Las células a541 no tratadas muestran una apariencia en forma de adoquín y triángulo, característica de las células epiteliales. Sin embargo, después de su estimulación con TGF beta 1 y TNF alfa, las células muestran una forma de huso alargada, similar a la observada para las células mesinfémicas. La QRTCPR de la expresión de los marcadores epiteliales y mesincémicos antes y después de la EMT revela que las células A541 tratadas con citocinas inflamatorias durante 48 horas exhiben una expresión significativamente reducida de CDH1 y una expresión significativamente aumentada de VIAM y ACTA2.Además, la estimulación con estas citocinas atenúa la expresión de E-cadherina determinada por el análisis de sangre occidental, mientras que se inducen las expresiones de vimentina, N-cadherina y actina alfa del músculo liso. En un ensayo de contracción en gel, después de 48 horas, los geles que contienen células tratadas con TGF beta 1 y TNF alfa son más pequeños que los geles controlados que contienen células tratadas con PBS. De hecho, después de 72 horas, el tamaño de los geles que contienen los geles tratados con citocinas se reduce significativamente, en comparación con los geles controlados medidos por un analizador de geles.Como se observó, los pasos de contracción del gel se pueden completar en tres horas si se realizan correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar confirmar que la EMT se ha inducido con éxito antes de realizar el ensayo de contracción del gel. Después de la observación, esta técnica proporciona una forma de variar el proceso de EMT durante un estado inflamatorio como la fibrosis o el remodelado pulmonar.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo emitir células que tienen EMT, en un tipo de cuagenter y espumarlas en medio.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Se describe el uso de un ensayo basado en células ES de ratón para identificar ventanas de tiempo crítico para la Wnt / β-catenina y la activación de la señal de BMP durante la inducción cardiogénico. El método ofrece una plataforma estandarizada que cuantifica la eficiencia de forma fiable cardiogénico, y es aplicable al estudio de los linajes de células.

Modificado madre embrionarias de ratón basado en células para la cuantificación de la eficiencia de inducción cardiogénico

El mesénquima craneal experimenta movimientos dramáticos morfogénicas probable que proporciona una fuerza motriz para la elevación de los pliegues...

Un ensayo de explante para evaluar el comportamiento celular del mesénquima craneal

Un método directo se describe para la inducción de la transición epitelial a mesenquimal (EMT) en una variedad de tipos de células. Se incluyen métodos para el análisis de células en estados EMT por inmunocitoquímica.

Inducción y Análisis de epitelial a mesenquimal de transición

Se ha demostrado que la regulación alternativa del empalme contribuye a la transición epitelio-mesenquimal (EMT), un programa celular esencial en diversos procesos fisiológicos y patológicos. Aquí describimos un método que utiliza un modelo de EMT inducible para la detección de empalme alternativo durante EMT.

Detección de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal de transición

Aquí, describimos métodos para aislar células epicárdicas primarias de ratón mediante un ensayo de cultivo de excrecencia y evaluamos la migración funcional de células derivadas del epicardio (EPDC) utilizando un sistema de cultivo cardíaco ex vivo. Estos protocolos son adecuados para identificar moduladores genéticos y químicos de la transición epitelial a mesenquimal (EMT) y la motilidad epicárdicos.

Consecuencia del epicardio y Ensayo de Cultivo<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Evaluación de la migración de células derivadas del epicardio

La transición epitelial a mesenquimal (EMT) permite que los cánceres se vuelvan invasivos. Para investigar la EMT, se describe un modelo in vitro basado en células madre neurales (NSC) desprovisto de suero y enzimas. Este sistema estandarizado permite la evaluación cuantitativa y cualitativa de la migración celular, la expresión génica y proteica. El modelo es adecuado para el descubrimiento de fármacos.

Un modelo enzima y Cultura Neural Stem Cell libre de suero para la EMT Investigación Adecuado para el descubrimiento de fármacos

Presentamos un ensayo de fuerza de tracción de alto rendimiento fabricado con caucho de silicona (PDMS). Este novedoso ensayo es adecuado para estudiar los cambios físicos en la contractilidad celular durante diversos procesos y enfermedades biológicas y biomédicas. Demostramos la utilidad de este método midiendo un aumento dependiente de la contractilidad durante la transición epitelial a mesenquimal.

Microscopía de fuerza de tracción de alto rendimiento Mediante PDMS revela efectos dependientes de la dosis de transformar el factor de crecimiento en la transición epitelial a mesenquimal

Describimos un flujo de trabajo sistemático para investigar la señalización β TGF y la EMT inducida por TGF-β mediante el estudio de la proteína y la expresión génica implicadas en esta vía de señalización. Los métodos incluyen hinchazón occidental, un ensayo de reportero luciferasa, qPCR y tinción de inmunofluorescencia.

Estudio de la señalización β TGF y la transición epitelial a mesenquimal inducida por TGF-β en cáncer de mama y células normales

Se describen métodos para investigar TGF-β2 inducida por EndMT en células endoteliales mediante la observación de los cambios en la morfología celular y el examen de la expresión endMT relacionados con los cambios de marcador utilizando la tinción de inmunofluorescencia. La edición del gen CRISPR/Cas9 fue descrita y utilizada para agotar el gen que codifica el caracol para investigar su papel en endMT inducido por TGF-β2.

TGF-β mediada por la transición endotelial a mesenquimal (EndMT) y la evaluación funcional de los efectores endMT utilizando la edición de genes CRISPR / Cas9

Este trabajo presenta un protocolo flexible para utilizar la tecnología de superficies contráctiles elastoméricas marcadas fluorescentemente (FLECS) en formato de micropozos para una cuantificación simplificada y sin intervención de las fuerzas contráctiles de una sola célula basada en desplazamientos visualizados de micropatrones de proteínas fluorescentes.

Análisis simplificado y de alto rendimiento de la contractilidad de una sola célula utilizando elastómeros con micropatrones

Este protocolo proporciona métodos para generar tejidos cardíacos y esqueléticos diseñados en 3D y describe su uso en modalidades preclínicas de detección de fármacos. Los métodos descritos utilizan un sistema de detección magnética para facilitar la evaluación simultánea de 24 tejidos en paralelo.

Pruebas preclínicas de fármacos en tejidos musculares escalables diseñados en 3D

Aprende a evaluar la contractilidad de células mesenquimales post-EMT mediante un ensayo de contracción de gel. Esta técnica accesible permite estudiar fibrosis pulmonar y remodelación de vías aéreas.

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