Name: Análisis cicloheximida persecución de degradación de proteínas en Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Aprenda a analizar la degradación de proteínas en Saccharomyces cerevisiae mediante persecución con cicloheximida y western blot. Este método simplifica el estudio de la estabilidad proteica sin isótopos radiactivos.

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Los autores agradecen a los miembros actuales y anteriores del laboratorio de Rubenstein por proporcionar un entorno de investigación entusiasta y de apoyo. Los autores agradecen a Mark Hochstrasser (Universidad de Yale) por compartir reactivos y experiencia. E.M.R. agradece a Stefan Kreft (Universidad de Konstanz) y Jennifer Bruns (Universidad de Pittsburgh) por compartir su valiosa experiencia en el análisis cinético de proteínas. Este trabajo fue apoyado por una subvención de los Institutos Nacionales de Salud (R15 GM111713) a E.M.R., un premio de investigación ASPiRE de la Universidad Estatal de Ball a E.M.R., un premio de investigación del capítulo de Sigma Xi de la Universidad Estatal de Ball a S.M.E., y fondos de la Oficina del Rector y el Departamento de Biología de la Universidad Estatal de Ball.

1. Crecimiento y cosecha de células de levadura <ol><li> Si no el análisis de la cinética de degradación de una proteína de levadura endógena, transformar la cepa (s) de levadura deseada con un plásmido que codifica la proteína de interés. Métodos fiables para la transformación de levadura se han descrito previamente 37. </li><li> Inocular la levadura en 5 ml de medio apropiado (por ejemplo, selectiva definida (SD) medio sintético para el mantenimiento del plásmido de las células transformadas o YPD) medio de levadura no selectivo extracto-peptona-dextrosa (para las células no transformadas). Incubar durante la noche a 30 ° C, en rotación. NOTA: 30 ° C es la temperatura óptima para el crecimiento de tipo salvaje típica cepas de levadura de laboratorio 38. Sin embargo, debido a que algunas cepas de levadura mutantes no crecen de manera óptima a 30 ° C y algunas proteínas sufren degradación dependiente de la temperatura, las temperaturas utilizadas para el crecimiento de células de levadura y Chase cicloheximida deben determinarse empíricamente 39. </li><li> medir THdensidad óptica a 600 nm de correo (OD 600) de cada cultivo durante la noche. NOTA: Las células pueden estar en fase de crecimiento logarítmico o estacionario pero debe haber alcanzado mínimamente una densidad que permita la dilución hasta una DO 600 = 0,2 en 15 ml de medio fresco. </li><li> Diluir los cultivos de una noche a un valor de DO 600 de 0,2 en 15 ml de medio fresco. </li><li> Incubar levadura a 30 ° C, agitando hasta que las células alcanzan la fase de crecimiento semilogarítmica (es decir, una DO 600 entre 0,8 y 1,2). </li><li> Durante el crecimiento de células de levadura, realice lo siguiente para prepararse para el procedimiento de cicloheximida grano: <ol><li> Establecer un bloque de calor que puede acomodar tubos de 15 ml cónicos a 30 ° C para la incubación de las células en presencia de cicloheximida. Añadir agua a los pozos del bloque de calor para permitir la distribución de calor eficiente a las culturas. Añadir agua a cada pocillo de tal manera que un tubo cónico de 15 ml hará que el nivel de agua a la altura de, pero no desborde, el labio del pozo. </li><li> Establecer un segundo bloque de calor que puede acomodar tubos de 1,5 ml de microcentrífuga a 95ºC para la desnaturalización de proteínas después de la lisis celular. </li><li> Pre-caliente medio de cultivo fresco (1,1 ml por punto de tiempo por la cultura para ser ensayadas) a 30 ° C. </li><li> Añadir 50 l de 20x Detener la mezcla a tubos de microcentrífuga de pre-marcado (un tubo por el tiempo del punto por cultivo a ensayar). Colocar los tubos en hielo. PRECAUCIÓN: La azida de sodio, un ingrediente de 20x Detener la mezcla, es tóxico por ingestión o por contacto dérmico. Siga las recomendaciones del fabricante en la preparación, el almacenamiento y el manejo de azida de sodio. En caso de exposición accidental, consultar hoja de datos proporcionada por el fabricante. </li></ol></li><li> Cuando las células han alcanzado el crecimiento semilogarítmica, recoger 2,5 OD 600 unidades de cada cultivo por punto de tiempo a ensayar (por ejemplo, 7,5 OD 600 unidades para analizar la abundancia de proteínas en tres puntos de tiempo). Centrifugadora recogieron las células en 15 ml tubos cónicos a 3,000 xg a temperatura ambiente durante 2 min. NOTA: Una OD 600 unidad es igual a la cantidad de levadura presente en 1 ml de cultivo a una DO 600 de 1,0. El volumen de cultivo (en ml) que se requieren para cosechar X OD 600 unidades (V) se puede determinar mediante el uso de la siguiente ecuación: V = X OD 600 unidades / OD 600 de medición. Por ejemplo, para la cosecha de 7,5 OD 600 unidades de cultivo de células de levadura a una DO 600 de 1,0, recoger 7,5 OD 600 unidades / 1,0 = 7,5 ml de cultivo de levadura. </li><li> Resuspender cada sedimento celular en 1 ml de 30 ° C (pre-calentado) medio de crecimiento fresco por 2,5 OD 600 unidades de células (por ejemplo, 3 ml de 7,5 OD 600 unidades). </li></ol> 2. La cicloheximida Caza <ol><li> Equilibrar las suspensiones de células de levadura por incubación durante 5 min en el bloque de calor C 30 °. </li><li> Preparar un temporizador para contar a partir de las 0:00. </li><li> Para comenzar la persecución cicloheximida, pulse el botón &quot;Inicio&quot; en el temporizador. Rápidamente,pero con cuidado, lleve a cabo los siguientes pasos: <ol><li> Añadir cicloheximida a una concentración final de 250 mg / ml a la suspensión de células de levadura primero (por ejemplo, añadir 37,5 l de 20 mg / ml de la cicloheximida a 3 ml de suspensión de células), y vortex brevemente para mezclar. PRECAUCIÓN: La cicloheximida es un irritante cutáneo y es tóxico por ingestión oral. Siga las recomendaciones del fabricante en la preparación, el almacenamiento y el manejo de cicloheximida. En caso de exposición accidental, consultar hoja de datos proporcionada por el fabricante. </li><li> Inmediatamente después de la adición de cicloheximida y agitación en vórtex, la transferencia de 950 l (~ 2,4 OD 600 unidades) de la suspensión de células de levadura con cicloheximida añadido a un tubo de microcentrífuga de pre-marcado que contiene 50 l enfriado en hielo mezcla 20x de parada. Vortex el tubo de microcentrífuga, y el lugar en hielo hasta que se han recogido todas las muestras. </li><li> Devolver la suspensión de células de levadura a 30 ° C. </li></ol></li><li> Repita los pasos 2.3.1 a 2.30.3 para cada una de las suspensiones de células de levadura restantes a intervalos de tiempo regulares (por ejemplo, cada 30 segundos, de manera que se añade a la cicloheximida la muestra # 1 a las 0:00, muestra # 2 a las 0:30, muestra # 3 a las 1:00 , etc.). </li><li> En cada punto de tiempo posterior, las suspensiones de células de levadura vórtice y de transferencia de 950 l a tubos de microcentrífuga de marcado que contiene 50 l pre-refrigerada 20x parada Mix. Vortex y lugar recogido células en hielo. Salida 15 ml tubos cónicos de 30 ° C bloque de calor. <ol><li> Por ejemplo, para la recogida de las células 30 min después de la adición de cicloheximida (suponiendo 30-sec intervalos entre adición de cicloheximida a suspensiones de células de levadura al principio de la evolución en el tiempo) y agitar y remover 950 l de suspensión de células de la muestra # 1 en 30:00 . Repita para la Muestra # 2 a 30:30, y así sucesivamente. NOTA: para evitar la sedimentación de la levadura, las suspensiones de células de vórtice en tubos de 15 ml cónicos aproximadamente cada 5 min durante todo el curso de la persecución. Alternativamente, la suspensión de células de levaduras puede ser mantenido en un baño de agua agitando de forma continua durante la duración del experimento cicloheximida persecución. </li></ol></li><li> Cuando todas las muestras se han recogido, pellet recogió células por centrifugación a 6500 xg a temperatura ambiente durante 30 seg. Eliminar el sobrenadante con la pipeta o aspiración. Las células están ahora listas para la lisis alcalina. Como alternativa, complemento de congelación células se sedimentaron en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C. </li></ol> 3. extracción de proteínas post-alcalina (Modificado de 16,40) <ol><li> Añadir 100 ml de agua destilada a cada sedimento celular. Volver a suspender pipeteando arriba y abajo o vórtex. </li><li> Añadir 100 ml de NaOH 0,2 M a cada muestra. Mezclar pipeteando arriba y abajo o vórtex. </li><li> Se incuban las células en suspensión a temperatura ambiente durante 5 min. En esta etapa, las células de levadura no se han lisaron, y las proteínas no se han publicado 40. </li><li> Precipitar las células por centrifugación a 18.000 xg en los estribos habitaciónambiente durante 30 seg. Aspirar el sobrenadante con la pipeta o aspiración. </li><li> Para lisar las células, añadir 100 l de tampón de muestra Laemmli a cada sedimento celular. Volver a suspender pipeteando arriba y abajo o vórtex. NOTA: la incubación secuencial de las células con proteínas libera tampón de muestra de Laemmli y NaOH en una forma compatible con sodio dodecil electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) utilizando un sistema de tampón de Tris-glicina. </li><li> Incubar a 95 ° C durante 5 minutos para desnaturalizar completamente proteínas. NOTA: La incubación a 95 ° C puede no ser adecuado para el análisis de las proteínas que son propensas a la agregación (por ejemplo, las proteínas con varios segmentos transmembrana). Estas proteínas pueden llegar a ser insoluble cuando se incuban a temperaturas elevadas 41. Por lo tanto, para el análisis de tales proteínas, los lisados ​​deben incubarse a temperaturas más bajas (por ejemplo, 37 ° C - 70 ° C) durante 10 - 30 min, como se determina empíricamente. </li><li> lisados ​​centrifugar a 18.000 xga room temperatura durante 1 min para sedimentar el material insoluble. El sobrenadante (solubilizado proteína extraída) está listo para la separación por SDS-PAGE y análisis de transferencia western posterior. Como alternativa, las tiendas lisados ​​a -20 ° C. </li></ol> 4. Representante de SDS-PAGE y procedimiento de Western blot (Adaptado de 16) <ol><li> Carga de proteína estándares de peso molecular y el volumen determinado empíricamente de los lisados ​​en un gel de SDS-PAGE. NOTA: Elija el porcentaje de acrilamida y bis-acrilamida en el gel SDS-PAGE basada en el peso molecular de la proteína de interés. En general, inferiores geles porcentuales son más adecuados para la resolución de proteínas de mayor peso molecular. </li><li> gel funcionar a 200 V hasta que el frente de colorante ha alcanzado el borde inferior del gel. </li><li> Transferencia de las proteínas desde el gel a membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) por transferencia en húmedo a 20 V para 60 a 90 min a 4 ° C. </li><li> Bloquear la membrana por incubación en Tris-solución salina tamponada (TBS) que contiene 5% de leche desnatada, oscilación, a temperatura ambiente durante 1 hr o a 4 ° C durante la noche. NOTA: Para evitar el crecimiento microbiano en la presencia de una membrana incubaron durante la noche, se recomienda incluir azida de sodio en la solución de bloqueo a una concentración final de 0,02%. </li><li> Incubar la membrana con el anticuerpo primario específico para la proteína de interés en TBS con 0,1% de Tween-20 (TBS / T) y 1% de leche desnatada, oscilación, a temperatura ambiente durante 1 hr. </li><li> Lavar la membrana a temperatura ambiente de 3 x 5 min con TBS / T, meciéndose. </li><li> Incubar la membrana con anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado en TBS / T con leche desnatada 1% a temperatura ambiente durante 1 hr, balanceo. NOTA: Los fluoróforos son sensibles a la luz. Por lo tanto, diluciones de anticuerpos conjugados con fluoróforos deben estar preparados en la oscuridad, y la incubación de las membranas en presencia de anticuerpos conjugados con fluoróforos y posteriores pasos de lavado debe ocurrir en prueba de luz (por ejemplo, envueltas en papel aluminio) containers. </li><li> Lavar la membrana a temperatura ambiente de 3 x 5 min con TBS / T, meciéndose. </li><li> membrana de imagen utilizando LI-COR Odyssey CLx y el software Image Studio (o equipos de imagen comparable y software), siguiendo las recomendaciones del fabricante. </li><li> Después de la adquisición de la imagen de la membrana, se incuba la membrana con un anticuerpo primario específico para una proteína de control de carga en TBS / T con leche desnatada 1% a temperatura ambiente durante 1 hr, balanceo. </li><li> Lavar la membrana a temperatura ambiente de 3 x 5 min con TBS / T, meciéndose. </li><li> Incubar la membrana con anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado en TBS / T con leche desnatada 1% a temperatura ambiente durante 1 hr, balanceo. </li><li> Lavar la membrana a temperatura ambiente de 3 x 5 min con TBS / T, meciéndose. </li><li> membrana de imagen como en el paso 4.9. </li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este trabajo, se presenta un método para el análisis de la cinética de degradación de proteínas. Esta técnica se puede aplicar fácilmente a una gama de proteínas degradadas por una variedad de mecanismos. Es importante tener en cuenta que los experimentos de persecución cicloheximida informan sobre la cinética de degradación de la piscina en estado estable de una proteína dada. Otras técnicas pueden ser usadas para analizar la cinética de degradación de poblaciones específicas de las proteínas. Por ejemplo, el destin...

Las proteínas desempeñan funciones cruciales en prácticamente todos los procesos celulares. Muchos procesos fisiológicos requieren la presencia de una proteína específica (o proteínas) durante un período de tiempo determinado o en circunstancias particulares. Por lo tanto, los organismos supervisan y regulan la abundancia de proteínas para satisfacer las necesidades celulares 1. Por ejemplo, las ciclinas (proteínas que controlan la división celular) están presentes en fases específicas del ciclo celular, y la pérdida de los niveles de ciclina regulados se ha asociado con la formación de tumores malignos 2. Además de regular los niveles de proteína para satisfacer las necesidades celulares, las células emplean mecanismos de control de calidad de degradación para eliminar mal plegadas, las moléculas de proteína sin ensamblar, o de otra manera aberrantes 3. El control de la abundancia de proteínas implica regulación tanto de la síntesis de macromoléculas (transcripción y traducción) y la degradación (proteólisis y la decadencia de ARN). degradación de la proteína alterada o excesiva contribuye a múltiples patologías, Incluyendo el cáncer, fibrosis quística, enfermedades neurodegenerativas, y trastornos cardiovasculares 4-8. Por lo tanto, los mecanismos proteolíticos representan dianas terapéuticas prometedoras para una gama de enfermedades 9-12. Análisis de proteínas en un solo punto de tiempo (por ejemplo, mediante transferencia Western 13, 14 citometría de flujo o microscopía de fluorescencia 15) proporciona una instantánea de la abundancia de proteínas en estado estacionario sin revelar las contribuciones relativas de la síntesis o degradación. Del mismo modo, reportero ensayos basados ​​en el crecimiento reflejan los niveles de proteína en estado estacionario durante un período de tiempo prolongado sin discriminar entre las influencias de la síntesis y degradación de 15-20. Es posible inferir la contribución de los procesos de degradación a los niveles de proteína en estado estacionario mediante la comparación de la abundancia antes y después de la inhibición de los componentes específicos del mecanismo de degradación (por ejemplo, mediante la inactivación de la prote farmacológicamenteasome 21 o la anulación de un gen de la hipótesis de ser necesarios para la degradación 13). Un cambio en los niveles de proteína en estado estacionario después de la inhibición de rutas de degradación proporciona una fuerte evidencia de la contribución de la proteolisis con el control de la abundancia de proteínas 13. Sin embargo, este análisis todavía no ofrece información sobre la cinética de rotación de proteínas. Persecución cicloheximida seguido por el Western Blot supera estas deficiencias, permitiendo a los investigadores visualizar la degradación de proteínas con el tiempo 22-24. Además, debido a la detección de proteínas cicloheximida siguiente persecución se realiza típicamente por el Western Blot, isótopos radiactivos y largos pasos de inmunoprecipitación no son necesarios para la persecución cicloheximida, a diferencia de muchas técnicas de persecución de impulsos de uso común, que también se realizan para visualizar la degradación de proteínas 25. La cicloheximida se identificó por primera vez como un compuesto con buen anti-hongoslazos producidos por la bacteria Streptomyces griseus gram-positivas 26,27. Es una molécula de células permeable que inhibe específicamente citosólica eucariota (pero no organellar) Traducción al alterar ribosomal translocación 28-31. En un experimento de cicloheximida persecución, se añade la cicloheximida a las células, y las alícuotas de células se recogen inmediatamente y en puntos de tiempo específicos después de la adición del compuesto 22. Las células se lisaron, y se analiza la abundancia de proteínas en cada punto de tiempo, típicamente por Western blot. Las disminuciones en la abundancia de proteínas después de la adición de cicloheximida se puede atribuir a la degradación de proteínas con confianza. Una proteína inestable disminuirá en abundancia con el tiempo, mientras que una proteína relativamente estable exhibirá poco cambio en la abundancia. Mecanismos de degradación de proteínas selectiva han sido altamente conservado a lo largo Eukarya. Mucho de lo que se conoce acerca de la degradación de proteínas se supo por primera vez enel modelo eucariota unicelular, Saccharomyces cerevisiae (levadura en ciernes) 25,32-36. Los estudios con levaduras es probable que continúen proporcionando nuevos e importantes conocimientos sobre la degradación de proteínas. Un método para la persecución de cicloheximida en células de levadura, seguido por Western blot de la abundancia de proteínas se presenta aquí.

<table><tbody><tr><td>Cepas de levadura, plásmidos, medio estándar y componentes</td><td></td><td></td><td></td>tampón</tr><tr><td>deseados Tubos de vidrio de borosilicato desechables</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-32</td><td>Disponible en una variedad de fabricantes</td></tr><tr><td>Incubadora con regulación de temperatura (p. ej. Incubadora Heratherm Modelo IMH180)</td><td>Dot Scientific 51028068</td><td></td><td>Disponible en una variedad de fabricantes</td></tr><tr><td>Tambor intercambiable New Brunswick para tubos de 18 mm (rodillo de tubo)</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-0450</td><td>Se recomienda un rodillo de tubo para mantener durante la noche cultivos iniciadores de células de levadura en suspensión. Alternativamente, si no se dispone de un rodillo de tubo, se puede utilizar un agitador de plataforma en una incubadora con temperatura controlada para los cultivos iniciadores durante la noche. Se puede usar un agitador de plataforma o un rodillo de tubo para mantener cultivos más grandes en suspensión.</td></tr><tr><td>New Brunswick TC-7 Tambor de rodillos 120 V 50/60 H</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-4004</td><td>Para uso con rodillo de tubo</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Espectrofotómetro</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>Disponible en una variedad de fabricantes</td></tr><tr><td>Centrífuga 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5427 000.216&nbsp;</td><td>El rotor que se vende con unidad tiene capacidad para tubos de microcentrífuga de 1,5 y 2,0 ml. El rotor se puede cambiar por uno que contenga tubos cónicos de 15 y 50 ml</td></tr><tr><td>Rotor de ángulo fijo F-35-6-30 con tapa y adaptadores para centrífuga modelo 5430/R, 15/50 ml Tubos cónicos, 6 plazas</td><td>Eppendorf</td><td>F-35-6-30</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de rosca serigrafiado de 15 ml 17 x 20 mm cónico, polipropileno</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td>Disponible en una variedad de fabricantes</td></tr><tr><td>Tubo flexible de 1,5 ml, Tubos de microcentrífuga naturales y limpios por PCR</td><td>Eppendorf</td><td>22364120</td><td>Disponibles en una variedad de fabricantes</td></tr><tr><td>Calentadores analógicos Dri-Bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>1172011AQ</td><td>Se recomienda disponer de dos calentadores (uno para incubar células durante el tratamiento con cicloheximida y otro para hervir lisados para desnaturalizar proteínas). Alternativamente, 30 &deg; El baño de agua C se puede utilizar para la incubación de células en presencia de cicloheximida. El baño de agua hirviendo con placa caliente se puede utilizar alternativamente para desnaturalizar proteínas.</td></tr><tr><td>Bloque calefactor para tubos cónicos de 12 x 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-473-70</td><td>Para usar con el calentador Dri-Bath durante la incubación de células en presencia de cicloheximida.</td></tr><tr><td>Bloque calefactor para 20 tubos cónicos de 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718-9Q</td><td>Para usar con el calentador Dri-Bath para hervir lisados para la desnaturalización de proteínas.</td></tr><tr><td>Aparatos de funcionamiento y transferencia, fuentes de alimentación y equipos de imagen o cuartos oscuros de SDS-PAGE para SDS-PAGE y transferencia a membrana</td><td></td><td></td><td>Variará según el laboratorio y la aplicación</td></tr><tr><td>Sistema de adquisición de imágenes Western blot (p. ej. Escáner Li-Cor Odyssey CLx y software Image Studio)</td><td>Li-Cor</td><td>9140-01</td><td>Variará según el laboratorio y la aplicación</td></tr><tr><td>EMD Millipore Immobilon Membranas de transferencia de PVDF</td><td>Fisher Scientific</td><td>IPFL00010</td><td>Variará según el laboratorio y la aplicación</td></tr><tr><td>Anticuerpos primarios (p. ej. Fosfoglicerato quinasa (Pgk1) Anticuerpo monoclonal de ratón (clon 22C5D8))</td><td>Life Technologies</td><td>459250</td><td>Variará según el laboratorio y la aplicación</td></tr><tr><td>Anticuerpos secundarios (p. ej. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L))</td><td>Life Technologies</td><td>A-21065</td><td>Variará según el laboratorio y la aplicación</td></tr></tbody></table>

análisis cicloheximida persecución de degradación de proteínas en<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

La regulación de la abundancia de proteínas es crucial para prácticamente todos los procesos celulares. la abundancia de proteínas refleja la integración de las tasas de síntesis de proteínas y la degradación de proteínas. Muchos ensayos de presentación de informes sobre la abundancia de proteínas (por ejemplo, de una sola vez punto de transferencia de western, citometría de flujo, microscopía de fluorescencia, o los ensayos de reportero basadas en el crecimiento) no permiten la discriminación de los efectos relativos de la traducción y la proteolisis en los niveles de proteína. En este artículo se describe el uso de persecución cicloheximida seguido por el Western Blot para analizar específicamente la degradación de proteínas en el eucariota unicelular modelo, Saccharomyces cerevisiae (levadura en ciernes). En este procedimiento, las células de levadura se incuban en presencia de cicloheximida inhibidor de la traducción. Las alícuotas de células se recogen inmediatamente después y en puntos específicos de tiempo después de la adición de cicloheximida. Las células se lisaron, y los lisados ​​se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida for análisis de transferencia Western de la abundancia de proteínas en cada punto de tiempo. El procedimiento de persecución cicloheximida permite la visualización de la cinética de degradación de la población en estado estacionario de una variedad de proteínas celulares. El procedimiento puede utilizarse para investigar los requisitos genéticos para y las influencias ambientales sobre la degradación de proteínas.

Para ilustrar la metodología de persecución cicloheximida, la estabilidad de Deg1 -Sec62 (Figura 1), un sustrato modelo de levadura retículo endoplásmico (ER) -asociado degradación (ERAD), se analizó 42-44. En ERAD, de control de calidad enzimas ubiquitina ligasa se unen covalentemente las cadenas de la pequeña proteína ubiquitina a las proteínas aberrantes localizado en la membrana ER. Tales proteínas polyubiquitylated se retiran posteriormente de la...

La abundancia de proteínas refleja las tasas de síntesis y degradación de proteínas. En este artículo se describe el uso de la cicloheximida seguida de western blot para analizar la degradación de proteínas en el modelo de eucariota unicelular, Saccharomyces cerevisiae (levadura en ciernes).

Análisis cicloheximida persecución de degradación de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar la degradación de la población en estado estacionario de una proteína específica en Saccharomyces cerevisiae. Este método puede utilizarse para determinar los requisitos genéticos y los efectos ambientales sobre la degradación de una proteína de interés. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere isótopos radiactivos ni prolongados pasos de inmunoprecipitación, a diferencia de las técnicas de pulso-captura, que también se emplean para visualizar la degradación proteica.Este procedimiento puede utilizarse para analizar ya sea una proteína endógena de levadura o una proteína expresada a partir de un plásmido. Para este último caso, la cepa de levadura se transforma con un plásmido que codifica la proteína de interés siguiendo un protocolo estándar de transformación de levaduras. Inocule la levadura en cinco mililitros de medio adecuado.Incubar durante la noche a 30 grados Celsius con rotación. A la mañana siguiente, medir la densidad óptica a 600 nanómetros, o OD600, de cada cultivo nocturno. Diluir los cultivos hasta una OD600 de 0,2 en 15 mililitros de medio fresco.Incubar a 30 grados Celsius con agitación hasta q

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Biología

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Ensayo de degradación de proteínas propensas a plegamientos incorrectos: una técnica para monitorear la degradación de proteínas mal plegadas mediante tratamiento con cicloheximida y fraccionamiento de detergentes

Este video describe un ensayo de microplaca basado en fluorescencia in vitro para estudiar la cinética de degradación de una proteína mutante de luciferasa mal plegada marcada con fluorescencia expresada en los núcleos de células de mamíferos transfectadas. El ensayo consiste en el tratamiento de células que expresan la proteína mutante fluorescente con un inhibidor de la traducción y un inhibidor del proteasoma para evaluar la degradación mediada por el proteasoma de la proteína mal plegada.

Ensayo de persecución de cicloheximida basado en microplacas de fluorescencia: una técnica para monitorear la cinética de degradación de proteínas nucleares fluorescentes mal plegadas

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Ensayo de crecimiento basado en reportero para el Análisis Sistemático de la degradación de proteínas

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Determinación basada en el crecimiento y en la confirmación bioquímica de Requisitos Genéticos para la degradación de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

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