Análisis cicloheximida persecución de degradación de proteínas en
18 de abril de 2016
La abundancia de proteínas refleja las tasas de síntesis y degradación de proteínas. En este artículo se describe el uso de la cicloheximida seguida de western blot para analizar la degradación de proteínas en el modelo de eucariota unicelular, Saccharomyces cerevisiae (levadura en ciernes).
El objetivo general de este procedimiento es visualizar la degradación de la población en estado estacionario de una proteína específica en Saccharomyces cerevisiae. Este método puede utilizarse para determinar los requisitos genéticos y los efectos ambientales sobre la degradación de una proteína de interés. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere isótopos radiactivos ni prolongados pasos de inmunoprecipitación, a diferencia de las técnicas de pulso-captura, que también se emplean para visualizar la degradación proteica.
Este procedimiento puede utilizarse para analizar ya sea una proteína endógena de levadura o una proteína expresada a partir de un plásmido. Para este último caso, la cepa de levadura se transforma con un plásmido que codifica la proteína de interés siguiendo un protocolo estándar de transformación de levaduras. Inocule la levadura en cinco mililitros de medio adecuado.
Incubar durante la noche a 30 grados Celsius con rotación. A la mañana siguiente, medir la densidad óptica a 600 nanómetros, o OD600, de cada cultivo nocturno. Diluir los cultivos hasta una OD600 de 0,2 en 15 mililitros de medio fresco.
Incubar a 30 grados Celsius con agitación hasta que las células alcancen la fase de crecimiento logarítmico media. Mientras las células de levadura están creciendo, prepararse para el procedimiento de rastreo con cicloheximida. Colocar un bloque térmico que pueda acomodar tubos cónicos de 15 mililitros a 30 grados Celsius para la incubación de las células en presencia de cicloheximida.
Para garantizar una distribución eficiente del calor a los cultivos, agregue agua a cada pocillo del bloque térmico de manera que el nivel del agua suba hasta el borde del pocillo al colocar un tubo cónico de 15 mililitros, sin derramar. Configure un segundo bloque térmico que pueda acomodar tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros a 95 grados Celsius para la desnaturalización de proteínas tras la lisis celular. Precaliente medio de crecimiento fresco a 30 grados Celsius.
Se necesitan 1,1 mililitros de medio por punto de tiempo por cultivo que se va a analizar. Añada 50 microlitros de Stop Mix 20x a tubos de microcentrifugadora previamente etiquetados. Prepare un tubo por punto de tiempo por cultivo que se va a analizar.
Coloque los tubos en hielo. Cuando las células de levadura hayan alcanzado un crecimiento logarítmico medio, recoja 2,5 unidades de OD600 de cada cultivo por punto temporal que se vaya a analizar. Una unidad de OD600 equivale a la cantidad de levadura presente en un mililitro de cultivo con una OD600 de 1,0.
Centrifugar las células recolectadas en tubos cónicos de 15 mililitros a 3.000 ×g a temperatura ambiente durante dos minutos. Eliminar el sobrenadante. Re-suspender cada botón celular en un mililitro de medio de crecimiento fresco a 30 grados Celsius por cada 2,5 unidades de OD600 de células.
Antes de comenzar la prueba de seguimiento con cicloheximida, equilibre las suspensiones de células de levadura incubándolas en el bloque térmico a 30 grados Celsius durante cinco minutos. El aspecto más difícil de este procedimiento es la sincronización de la adición de cicloheximida y la recolección de células para cada muestra. Garantizamos el éxito estableciendo y cumpliendo estrictamente un cronograma para la adición de cicloheximida y la recolección de células.
Para iniciar la prueba de seguimiento con cicloheximida, presione Iniciar en el temporizador. Añada rápidamente pero con cuidado cicloheximida hasta una concentración final de 250 microgramos por mililitro a la primera suspensión de células de levadura y mezcle brevemente mediante vortex. Transfiera inmediatamente 950 microlitros, o aproximadamente 2,4 unidades de OD600, de la suspensión de células de levadura con cicloheximida añadida a un tubo de microcentrifugado previamente etiquetado que contenga 50 microlitros de Mezcla de Parada 20x fría.
Vortex la microtubos y colóquelo en hielo hasta que se hayan recogido todas las muestras. Comience la carrera con cicloheximida como se demostró para cada una de las suspensiones restantes de células de levadura a intervalos de tiempo regulares. En cada punto de tiempo subsiguiente, vortex las suspensiones de células de levadura y transfiera 950 microlitros a microtubos etiquetados que contienen 50 microlitros de Mezcla de Parada 20x previamente enfriada.
Vortex y coloque las células recolectadas en hielo. Para evitar la sedimentación de las células de levadura, vortex las suspensiones celulares en los tubos cónicos de 15 mililitros aproximadamente cada cinco minutos durante todo el período de seguimiento. Cuando se hayan recolectado todas las muestras, haga un pellet de las células recolectadas mediante centrifugación a 6,500 ×g y temperatura ambiente durante 30 segundos.
Elimine el sobrenadante mediante pipeteo o aspiración. Las células ya están listas para la lisis alcalina. Prepare las células para la lisis alcalina añadiendo 100 microlitros de agua destilada a cada pellet celular y resuspendiendo mediante pipeteo ascendente y descendente.
Añada 100 microlitros de hidróxido de sodio 0,2 molar a cada muestra. Mezcle mediante vortex. Incube las células a temperatura ambiente durante cinco minutos.
En esta etapa, las células de levadura no han sido lisadas y las proteínas no han sido liberadas. A continuación, haga un pellet de las células mediante centrifugación a 18.000 ×g a temperatura ambiente durante 30 segundos. Retire el sobrenadante por pipeteo o aspiración.
Para lisar las células, agregue 100 microlitros de tampón de muestra Laemmli a cada pellet celular. Re-suspenda mediante pipeteo ascendente y descendente. Incube a 95 grados Celsius durante cinco minutos para desnaturalizar completamente las proteínas.
Centrifugar los lisados a 18.000 × g y temperatura ambiente durante un minuto para obtener el sedimento del material insoluble. El sobrenadante, que corresponde a la proteína extraída solubilizada, está listo para la separación mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y el posterior análisis por inmunotransferencia. Alternativamente, los lisados pueden almacenarse a menos 20 grados Celsius.
Se analizó la estabilidad de Deg1-Sec62, un sustrato modelo de degradación asociada al retículo endoplasmático en levaduras, mediante la metodología de caza con cicloheximida. La proteína Deg1-Sec62 migra en geles SDS-PAGE como múltiples especies y se degrada fácilmente en células de tipo salvaje. Pgk1 es un control de carga cuya abundancia no varía en las condiciones analizadas.
La pérdida del ligasa de ubiquitina residente en el RE, hrd1, o de la enzima conjugadora de ubiquitina ubc7, estabilizó sustancialmente la proteína Deg1-Sec62, lo que confirma el papel previamente observado de estas proteínas en la degradación de Deg1-Sec62. Cue1 es una proteína transmembrana que ancla ubc7 a la membrana del RE y activa la enzima, pero no se ha investigado directamente el requisito de cue1 en la degradación de Deg1-Sec62. La observación de este estudio de que Deg1-Sec62 se estabilizó en ausencia de cue1 confirmó un papel para cue1 en la degradación asociada al RE de Deg1-Sec62.
El resultado del Western blot se cuantificó utilizando software de análisis de imágenes. Para comparar la abundancia de la proteína Deg1-Sec62 entre las muestras, se determinó la relación entre las intensidades de señal ajustadas de Deg1-Sec62 y Pgk1 para cada muestra. Es importante recordar que este procedimiento informa principalmente sobre la cinética de degradación de una población en estado estacionario de una proteína de interés.
Para visualizar la degradación de una población recién sintetizada de una proteína de interés, se pueden utilizar otras técnicas, como los experimentos de pulso-captura. No olvide que la cicloheximida y el azida sódica son extremadamente tóxicos y se deben tomar precauciones para evitar el contacto directo con estos productos químicos durante la realización de este procedimiento.
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Descripción general
Este artículo describe un método para visualizar la degradación de proteínas en Saccharomyces cerevisiae mediante el uso de una técnica de caza con cicloheximida seguida de inmunotransferencia western. Esta técnica permite a los investigadores analizar la degradación de proteínas específicas sin necesidad de isótopos radiactivos ni de pasos prolongados de inmunoprecipitación.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Degradación de proteínas
- Biología celular
- Sistemas modelo de levadura
Antecedentes
- La abundancia de proteínas está influenciada por las tasas de síntesis y degradación.
- La técnica de retención con cicloheximida es un método utilizado para estudiar la estabilidad de las proteínas.
- El inmunotransferido (Western blotting) es una técnica para detectar proteínas específicas.
- Comprender la degradación de proteínas es fundamental para obtener conocimientos sobre los procesos celulares.
Objetivo del estudio
- Visualizar la degradación de una proteína específica en levadura.
- Determinar los factores genéticos y ambientales que afectan la degradación de proteínas.
- Proporcionar una alternativa más sencilla a las técnicas tradicionales de pulso-captura.
Métodos Utilizados
- Uso de cicloheximida para inhibir la síntesis de proteínas.
- Transferencia western para analizar los niveles de proteína a lo largo del tiempo.
- Transformación de levadura con plásmidos que codifican proteínas de interés.
- Inoculación de levadura en medio de crecimiento adecuado.
Resultados principales
- Visualización exitosa de la degradación de proteínas en levadura.
- Identificación de los requisitos genéticos para la degradación de proteínas.
- Evaluación de los efectos ambientales sobre la estabilidad de las proteínas.
- Demuestra la eficiencia del método en comparación con técnicas tradicionales.
Conclusiones
- El método de caza con cicloheximida es eficaz para estudiar la degradación de proteínas.
- Esta técnica simplifica el análisis de la estabilidad de proteínas en levaduras.
- Los hallazgos contribuyen a una mejor comprensión de la dinámica de proteínas en las células.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cinética de degradación de proteínas es fundamental para la validación de objetivos y la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento. El método de seguimiento con cicloheximida permite la evaluación cuantitativa de la estabilidad de proteínas en un modelo genéticamente manipulable, apoyando la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías. Este enfoque proporciona una confianza predictiva para priorizar objetivos y reducir riesgos en hipótesis mecanicistas antes del cribado de compuestos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la medición de las tasas de degradación de poblaciones de proteínas en estado estacionario.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de objetivos mediante el análisis de perturbaciones genéticas y ambientales.
- Valor predictivo: Genera datos cuantitativos de cinética de degradación para orientar las decisiones sobre la confianza en el objetivo y la selección de carteras.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayo: Produce resultados estandarizados y reproducibles de inmunotransferencia para mediciones temporales de la estabilidad proteica.
- Escalabilidad: Compatible con pruebas de múltiples condiciones para evaluar los efectos de compuestos sobre las vías de degradación proteica.
- Utilidad de la plataforma: Establece una capacidad reutilizable para evaluar la interacción con el blanco mediante la modulación de la degradación en sistemas basados en levaduras.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Utiliza Saccharomyces cerevisiae como un sistema relevante para modelar mecanismos conservados de degradación.
- Continuidad traslacional: Conecta la validación inicial de dianas en fase de descubrimiento con estudios preclínicos mediante el análisis del camino conservado del ubiquitina-proteasoma.
- Avance ajustado al riesgo: Identifica modificadores genéticos y ambientales de la degradación para reducir los riesgos de los mecanismos diana antes de la validación en mamíferos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se enmarca dentro del continuo de descubrimiento, desde la validación del blanco hasta la identificación de fármacos líderes, al proporcionar datos de cinética de degradación que orientan la selección del blanco y los estudios sobre el mecanismo de acción.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis y la aclaración de vías al aislar variables de degradación de los efectos de síntesis.
- Tamizaje: Permite el desarrollo de ensayos para el tamizaje de compuestos mediante el establecimiento de tasas basales de degradación en cepas de levadura modificadas genéticamente.
- Análisis: Genera lecturas cuantitativas de inmunotransferencia normalizadas respecto a controles de carga para el análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación Traducional: Relaciona los hallazgos sobre degradación en levadura con sistemas mamíferos a través de componentes conservados de la degradación asociada al retículo endoplásmico.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma estandarizada para la reducción de riesgos de objetivos en múltiples proyectos mediante estudios de perturbación genética y química.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona una reducción del riesgo mecanicista mediante la cuantificación de la semivida de proteínas e identificación de las dependencias de las vías de degradación.
- Valor operativo: Ofrece un flujo de trabajo estandarizado y libre de isótopos, compatible con la infraestructura habitual de inmunotransferencia (western blot).
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción del proyecto al reducir la ambigüedad sobre el mecanismo del blanco y los efectos de compuestos moduladores sobre la estabilidad.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de blancos terapéuticos basada en la trazabilidad de la degradación y la conservación de las vías.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de cultivos de levadura, protocolos de seguridad con cicloheximida y cuantificación mediante inmunotransferencia (western blot).
- Depende del acceso a bloques térmicos de 30 °C y 95 °C, centrífugas y equipo estándar para electroforesis SDS-PAGE/inmunotransferencia.
- Necesita la estandarización entre equipos de los procedimientos para la recolección de puntos temporales, la eficiencia de lisis y la normalización de señales.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen sistemas de expresión basados en plásmidos, marcado con epítopos y compatibilidad con bibliotecas de knock-out de levaduras.
- Las limitaciones prácticas incluyen la toxicidad de la cicloheximida, posibles efectos secundarios sobre la traducción y el requisito de detección en rango lineal en la inmunotransferencia.
