Murino de próstata micro-disección y la castración quirúrgica

El objetivo general de estos procedimientos es permitir el estudio de la próstata, así como de las diversas condiciones hormonales dentro del ratón. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cáncer de próstata, como por ejemplo, cuáles son los efectos de la privación hormonal en la carcinogénesis de la próstata. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden estudiar los efectos de diversos procesos patológicos y cambios hormonales en las glándulas prostáticas individuales.

Comience sujetando un ratón a una tabla de disección en posición supina a través de la almohadilla del pie de cada pata y rociando el abdomen con etanol al 70%. A continuación, sujetando la piel de la parte inferior del abdomen con fórceps, utilice unas tijeras para cortar la piel y el peritoneo aproximadamente un centímetro antes de la abertura del pene. Continúe cortando la piel y el peritoneo desde la parte inferior del abdomen hasta ambos lados del abdomen hasta la caja torácica, exponiendo la cavidad peritoneal.

Después de identificar la ubicación de la vejiga y el tracto urogenital, o UGT, mueva suavemente la grasa y otros órganos hacia un lado para exponer los tejidos urinarios. Luego, con fórceps, agarre un conducto deferente en su base, cerca de la uretra, y desgarre el vaso. Después de quitar el otro conducto, use fórceps para sostener y levantar cuidadosamente la vejiga, mientras que simultáneamente usa tijeras para cortar la uretra por debajo de la próstata ventral y aproximadamente un centímetro por debajo de la base de la vejiga.

Transfiera la UGT recolectada a una placa de Petri de 60 a 100 milímetros que contenga aproximadamente de cinco a 10 mililitros de PBS, y coloque la placa bajo un microscopio de disección. A continuación, tome un par de pinzas finas en cada mano, sosteniendo los instrumentos como lápices, y apoye los antebrazos en la mesa de trabajo, a cada lado del microscopio, para mantenerlos firmes. Coloque la UGT con las pinzas, de modo que la vejiga quede hacia arriba, la uretra apunte hacia abajo y las vesículas seminales se coloquen a ambos lados de la vejiga.

Agarrando la uretra con una pinza, use la otra pinza para retirar cuidadosamente la grasa sin eliminar ningún tejido prostático. Cuando se haya eliminado toda la grasa, desgarre el tejido conectivo entre los dos lóbulos ventrales de la próstata para separarlos. Luego, sosteniendo uno de los lóbulos ventrales cerca de la punta con un par de pinzas, agarre la base del lóbulo lo más cerca posible de la uretra.

Ahora, mueva el otro par de pinzas para sujetar la uretra mientras separa el lóbulo del vaso con un movimiento firme y suave. Confirmar que no queda tejido prostático adherido a la uretra. Luego, coloque el lóbulo en el medio apropiado, de acuerdo con el siguiente paso experimental.

Después de aislar el otro lóbulo ventral de la misma manera, use fórceps para separar suavemente uno de los lóbulos anteriores de la vesícula seminal, teniendo cuidado de no perforar la vesícula seminal. Luego, una vez que el lóbulo esté independiente de la vesícula seminal, retírelo de la misma manera que se acaba de demostrar para el lóbulo ventral. Después de aislar el segundo lóbulo anterior, voltee el UGT restante, de modo que la próstata dorsal sea visible, y use fórceps para desgarrar el tejido conectivo entre los dos lóbulos laterales dorsales y entre los lóbulos y la región posterior de las vesículas seminales.

A continuación, retire los lóbulos laterales dorsales individuales, como se acaba de demostrar. Para realizar la castración, comience colocando un ratón anestesiado sobre una superficie limpia y estéril en posición supina y confirme el nivel adecuado de sedación mediante un pellizco en los dedos de los pies. Si el ratón no reacciona, use una maquinilla de afeitar eléctrica para afeitar el área quirúrgica y esterilizar el abdomen.

A continuación, utilice unas tijeras quirúrgicas estériles para hacer una incisión vertical de un centímetro a través de la piel de la línea media de la parte inferior del abdomen, aproximadamente un punto cinco centímetros por delante del pene, seguida de una incisión más pequeña a través del peritoneo, teniendo cuidado de no cortar ningún órgano. Con pinzas estériles, levante suavemente el borde cortado del peritoneo para visualizar la cavidad peritoneal y use otra pinza estéril para extraer una de las almohadillas de grasa testicular hasta que aparezcan los testículos. Luego, use una pluma de cauterización para cortar lentamente la almohadilla de grasa, sosteniendo los testículos hasta que se haya cortado la arteria testicular.

Si la arteria se corta demasiado rápido, el vaso puede sangrar demasiado, lo que requiere la eutanasia del ratón. Recomiendo calentar la pluma de cauterio a borbotones, y no dejar que se caliente demasiado, luego, mover el instrumento lentamente a través de la arteria para que el animal no se desangre. Una vez que se hayan cortado la almohadilla de grasa y la arteria, deseche los testículos y la almohadilla de grasa y repita la castración para los otros testículos.

Después de que se haya extirpado el segundo testículo, cierre el peritoneo con suturas de seda estériles y grape la piel con clips para heridas quirúrgicas. Luego, administre analgesia para controlar el dolor y coloque al ratón en una jaula limpia, sobre un calentador de jaulas, durante 5 a 10 minutos con monitoreo, hasta que se recupere por completo. El tracto urogenital completo está compuesto por los seis lóbulos de la próstata, la vejiga, las vesículas seminales y la uretra.

El conducto deferente se adhiere a la uretra, pero es innecesario para la mirodisección prostática y, por lo tanto, se puede separar antes de la extirpación de la UGT. El tracto urogenital permanecerá intacto una vez que se haya extirpado del abdomen; cubierto de tejido graso que debe eliminarse para acceder a los lóbulos de la próstata. En este experimento representativo, la castración fue seguida por dos ciclos de regeneración hormonal, y los niveles de testosterona en el suero fueron monitoreados por ELISA.

Como era de esperar, en condiciones de castración, los niveles de testosterona prácticamente desaparecieron. En presencia de tamoxifeno, un modulador selectivo del receptor de estrógenos, no se observaron diferencias significativas con la condición hormonalmente normal. Sin embargo, después de la castración, la reintroducción de testosterona causó un aumento dramático en los niveles séricos de testosterona.

Después de la microdisección, los lóbulos de la próstata de los ratones castrados disminuyen significativamente, mientras que los lóbulos de los animales tratados con testosterona se recuperan a su tamaño original. Además, la tinción de hematoxilina y eosina del tejido prostático anterior en condiciones normales, castradas y regeneradas, revela una reducción drástica en el crecimiento robusto del tejido en las secciones de los animales castrados. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en cinco minutos por ratón, si se realiza correctamente.

Al intentar la castración, es importante recordar mantener todo estéril y asegurarse de controlar el dolor que siente el ratón. Después de la castración, se pueden realizar otros métodos, como la reintroducción de andrógenos, para responder preguntas adicionales sobre los efectos de la testosterona en los tumores de próstata. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del cáncer de próstata exploraran la carcinogénesis, el desarrollo y la resistencia a la castración en ratones.