Name: Murino de próstata micro-disección y la castración quirúrgica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Aprende micro-disección prostática y castración quirúrgica en ratones para investigar el cáncer de próstata y los efectos de la privación hormonal en la carcinogénesis.

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Algunas de las figuras de este manuscrito fueron generosamente proporcionadas por el laboratorio de Bart O. Williams. Los autores son apoyados por el Instituto Nacional del Cáncer otorga U54CA143803, CA163124, CA093900, CA143055 Y.

Este protocolo se reúne y sigue las directrices establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Johns Hopkins. 1. micro-disección de una próstata de ratón <ol><li> La eutanasia a los ratones por asfixia con dióxido de carbono o un método alternativo autorizado conforme a las directrices para el cuidado y uso de animales institucionales. </li><li> Pin el ratón en una posición supina a una tabla de disección por poner un pasador a través de cada una de las cuatro patas. </li><li> Pulverizar el abdomen con 70% de etanol. </li><li> Mantenga la piel de la parte inferior del abdomen con unas pinzas, y usar las tijeras para cortar a través de la piel y el peritoneo aproximadamente 1 cm por delante del orificio del pene, cuidado de no cortar cualquier órgano. </li><li> Cortar la piel y el peritoneo de la parte inferior del abdomen, hasta ambos lados del abdomen a la caja torácica, la exposición de la cavidad peritoneal. </li><li> Identificar la vejiga y el tracto urogenital, y exponerlos moviendo suavemente los órganos de grasa y otros a un lado. </li><li> Usiunas pinzas de agarre Ng, los conductos deferentes en la base cerca de la uretra, y arrancarla. </li><li> Repita con el conducto deferente opuestos. </li><li> Con unas pinzas, agarre cuidadosamente la vejiga y tire hacia arriba, mientras que al mismo tiempo el uso de tijeras para cortar a través de la uretra por debajo de la vejiga y la próstata ventral (aproximadamente 1 cm por debajo de la base de la vejiga). Nota: A medida que la vejiga se detuvo, el (la vejiga que contiene, una sección de la uretra, todos los lóbulos de la próstata y las vesículas seminales) todo el tracto urogenital vendrá con él. Puede haber un poco de resistencia. </li><li> Coloque el tracto urogenital (UGT) en una placa de Petri que contiene 60 a 100 mm aproximadamente 5-10 ml de fosfato salino tamponado (PBS). </li><li> Realizar la parte restante del protocolo bajo un microscopio de disección. Use dos pinzas finas, una en cada mano. Mantenga la pinza &quot;como un lápiz&quot; y descansar los antebrazos en la mesa de trabajo con el fin de mantener el equilibrio ellos. </li><li> Utilice unas pinzas finas para posicionar el UGT de tal manera que la vejiga estáen la parte superior, la uretra está apuntando hacia abajo, y las vesículas seminales están colocados a ambos lados de la vejiga. </li><li> Agarre la uretra con uno fórceps y con cuidado tire de la grasa con los otros fórceps sin que se rompa la basura cualquier tejido de la próstata. Nota: Fat aparecerá relativa &quot;brillante&quot; para el tejido circundante. </li><li> Una vez que se elimina la grasa, el uso de fórceps para rasgar el tejido conectivo entre los dos lóbulos ventrales de la próstata y separarlos. </li><li> Para eliminar uno de los lóbulos ventrales, utilice uno de fórceps para agarrar un solo lóbulo ventral cerca de la punta, y el uso de las otras pinzas para agarrar ese lóbulo en la base lo más cercano a la uretra como sea posible. Mientras que aún agarrando la base del lóbulo, utilizar las otras pinzas para agarrar la uretra. Tire del lóbulo lejos de la uretra con un movimiento firme y lisa. Asegúrese de que se mantiene sin tejido de la próstata unido a la uretra. Coloque el lóbulo en el medio apropiado, dependiendo de la siguiente etapa experimental. <ol><li> Para fijar y parafina incrustar los samplio para el análisis histológico, colocar el lóbulo en 10% de formalina tamponada neutra (NBF) 8. </li><li> Coloque el lóbulo en medio de congelación, tales como PTU, para la crioconservación y el corte 8. </li><li> Coloque el lóbulo en PBS frío para el aislamiento de células individuales para la cultura o citometría de flujo 9. </li></ol></li><li> Repita el paso 1.15 con el otro lóbulo ventral. </li><li> Para eliminar uno de los lóbulos anteriores, el uso de fórceps para tirar suavemente del lóbulo lejos de la vesícula seminal, teniendo cuidado de no perforar la vesícula seminal. Una vez que el lóbulo es independiente de la vesícula seminal, y eliminar de la misma manera como el lóbulo ventral en el paso 1,15. </li><li> Repita el paso 1.17 con el otro lóbulo anterior. </li><li> Da la vuelta al tracto urogenital restante sobre tal que la próstata dorsal es visible. </li><li> Para eliminar uno de los lóbulos dorsolaterales, el uso de fórceps para rasgar el tejido conectivo entre los dos lóbulos dorsolaterales y también el tejido conectivo entre los lóbulos y tél región posterior de las vesículas seminales. Retire el lóbulo de una manera similar como el lóbulo ventral en el paso 1,15. </li><li> Repita el paso 1.20 con el otro lóbulo dorsolateral. </li></ol> 2. La castración quirúrgica Nota: Esta es una cirugía de supervivencia, por lo que la asepsia, anestesia y el tratamiento del dolor son importantes para la realización ética y exitosa de este protocolo. Siga todas las directrices para el cuidado y uso de animales institucionales. Utilice una fuente de calor externa, tal como una manta de agua de recirculación, durante el procedimiento quirúrgico para prevenir la hipotermia. No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía para la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado. Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos antes de su uso en cirugía. <ol><li> En una superficie limpia y estéril anestesiar al ratón usando las medidas apropiadas (por ejemplo, 2% de isoflurano inhalado) y la posición de la mOuse en una posición supina. Nota: los métodos de anestesia alternativos, como la ketamina, también se pueden utilizar, dependiendo del protocolo de animales aprobado. </li><li> Comprobar los reflejos del ratón apretando los dedos de los pies. Si el ratón no reacciona, proceder al siguiente paso. Si no reacciona, espere 1-3 minutos, y puedes volver a intentarlo. Afeitar el área quirúrgica con una maquinilla de afeitar eléctrica. </li><li> Asépticamente preparar el abdomen del ratón usando alternando matorrales de etanol al 70% y el yodo o los procedimientos recomendados por el personal veterinario institucional o IACUC. </li><li> Con un bisturí estéril practicar una incisión vertical de 1 cm a través de la piel en la línea media del abdomen inferior, de aproximadamente 1,5 cm por delante del pene. </li><li> Hacer una pequeña incisión (&lt;1 cm) a través del peritoneo, cuidado de no cortar cualquier órgano. </li><li> El uso de pinzas estériles, agarre el borde del corte del peritoneo y levantarla con cuidado a fin de ser capaz de ver la cavidad peritoneal por debajo. </li><li> El uso de otro pinzas estériles, meter la mano en THe cavidad peritoneal y el agarre sea la almohadilla de grasa de testículo izquierdo o derecho, lateral a la vejiga. Tire de la almohadilla de grasa a través de la abertura en el peritoneo y la piel hasta que el testículo sale así. Tenga cuidado de no lesionar otros tejidos u órganos durante este paso. </li><li> Con un marcador de cauterio, cortar a través de la almohadilla de grasa que mantiene los testículos. Cortar lentamente a través de la arteria testicular con el lápiz cauterio Nota: Si la arteria testicular se corta demasiado rápido, puede haber sangrado excesivo y el ratón pueden tener que ser sacrificados. </li><li> Una vez que se cortan la almohadilla de grasa y la arteria, retire la almohadilla de testículo y grasa. </li><li> Repita los pasos 2.6-2.9 con el otro testículo. Nota: Un método alternativo para la eliminación de los testículos es para ligar quirúrgicamente la arteria testicular, seguido por el corte del recipiente con unas tijeras. </li><li> Suturar el peritoneo se cerró con sutura absorbible. </li><li> Grapa la piel se cerró con grapas para heridas quirúrgicas. </li><li> Administrar un analgésico para controlar el dolor, y el lugarel ratón en una jaula limpia en una jaula más caliente durante 5-10 minutos. Monitorear el ratón para detectar signos de dolor o sangrado. </li></ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).</li>
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<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+luminal+epithelial+stem+cell+that+is+a+cell+of+origin+for+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A luminal epithelial stem cell that is a cell of origin for prostate cancer.</a> Nature. 461 (7263), 495-500 (2009).</li>
<li>Pascal, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5alpha-Reductase+inhibition+coupled+with+short+off+cycles+increases+survival+in+the+LNCaP+xenograft+prostate+tumor+model+on+intermittent+androgen+deprivation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">5alpha-Reductase inhibition coupled with short off cycles increases survival in the LNCaP xenograft prostate tumor model on intermittent androgen deprivation therapy.</a> J Urol. 193 (4), 1388-1393 (2015).</li>
<li>Shen, M. M., Abate-Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+prostate+cancer%3A+new+prospects+for+old+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges.</a> Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Próstata micro-disección permite la experimentación de lóbulos específica y el análisis de la próstata de ratón (Figura 1). En modelos de ratones genéticamente modificados, los fenotipos se pueden observar en un lóbulo que no se ve en otros. Además, para el análisis histológico, este protocolo asegura que la máxima cantidad de tejido de la próstata puro puede ser seccionadas y teñidas, sin otros tejidos del tracto urogenital presentes en la sección. Por último, para los experimentos de una sola célula, ...

La próstata es el sitio más común de cáncer en hombres en los EE.UU.. Cerca de 220.000 hombres cada año serán diagnosticados con cáncer de próstata, y aproximadamente 27.000 hombres sucumbirán a la enfermedad 1. Los hombres tienen un riesgo de 1 en 7 tiempo de vida de un diagnóstico de cáncer de próstata en los EE.UU. 1. Hiperplasia de próstata benigna (BPH), un agrandamiento no canceroso relacionada con la edad de la próstata, es también una condición generalizada, que afecta a más del 80% de los hombres de más de 80 2. Como tal, la próstata es el foco de una investigación considerable. Los modelos de ratón se han utilizado ampliamente para estudiar las enfermedades de la próstata 3. En general, la próstata del ratón es un excelente representante de la glándula humana 4, pero hay similitudes y diferencias entre el ratón y la anatomía y la fisiología de próstata humana 5. En ambas especies, la próstata se encuentra en la base de la vejiga, que rodea a la uretra. La glándula de la próstata humana es una única loser, dividido en cuatro zonas: central, de transición, periférica, y el estroma fibromuscular anterior. En contraste, la próstata de ratón consta de tres lóbulos pareadas en diferentes posiciones alrededor de la uretra: anterior, ventral y dorsolateral. A nivel celular, la diferencia principal es que la célula basal a la proporción de células luminal en humanos es de aproximadamente 1: 1, pero es 1: 4 en ratones 6. El estroma murino también es diferente en ratones en relación con los seres humanos - los seres humanos tienen más extensa del músculo liso, mientras que la capa muscular es mucho más delgada en la próstata murino. La adecuada identificación, disección, y la manipulación de la próstata del ratón son esenciales para la investigación de la próstata del ratón. Los niveles hormonales afectan drásticamente el desarrollo y la homeostasis de la glándula de la próstata en los seres humanos y ratones. Mientras que el estrógeno parece desempeñar un papel en el desarrollo de la próstata 7, la hormona más importante en la próstata es la testosterona. La testosterona es esencial para un desarrollo glandularmantenimiento d. Después de cualquiera de la castración física o química, aproximadamente el 90% de las células luminales en el apoptose adulto de próstata y la glándula reduce. Si se vuelve a introducir la testosterona a un individuo en condiciones de castración, la próstata es capaz de regenerarse a sí mismo a plena capacidad. La testosterona también parece conducir a cáncer de próstata, por lo que la terapia de privación de andrógenos es una estrategia terapéutica utilizada comúnmente. Sin embargo, muchos cánceres de próstata se vuelven resistentes a la privación de andrógenos. Además, los hombres sometidos a terapia de privación de andrógenos para el tratamiento del cáncer de próstata sometidos a ciclos de condiciones castrados y regeneradas. En el ratón, la castración quirúrgica, junto con la regeneración hormonal de la próstata mediante la reintroducción de la testosterona, es una herramienta importante con el que para estudiar la resistencia a la castración y los efectos de la bicicleta testosterona en la próstata. En este artículo, vamos a discutir y demostrar las técnicas apropiadas por los que pueda LOCATe y micro-diseccionar una próstata de ratón, así como quirúrgicamente castrar a un ratón.

<table><tbody><tr><td>Herramientas quirúrgicas</td><td>Roboz</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>OCT medium</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>Debe colocarse sobre hielo seco para congelar y almacenarse a -80 °C; C</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Johns Hopkins</td><td></td><td>También disponible de proveedores en línea</td></tr><tr><td>Pluma de cauterización</td><td>Medline ESCT002</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutura de seda</td><td>AD Surgical</td><td>M-S330R19</td><td></td></tr> Clips quirúrgicos para <tr><td>heridas</td><td>Roboz</td><td>RS-9265</td><td></td></tr></tbody></table>

murino de próstata micro-disección y la castración quirúrgica

Murine Prostate Micro-dissection and Surgical Castration

Los modelos de ratón se utilizan ampliamente para estudiar el cáncer de próstata y otras enfermedades. El ratón es un excelente modelo con el que estudiar la próstata y se ha utilizado como sustituto de los descubrimientos sobre el desarrollo y las enfermedades de la próstata humana. La microdisección de la próstata permite el estudio coherente de la anatomía de la próstata, la histología y las características celulares específicas del lóbulo en ausencia de contaminación de otros tejidos. La testosterona afecta el desarrollo de la próstata y las enfermedades. La terapia de privación de andrógenos es un tratamiento común para los pacientes con cáncer de próstata, pero muchos tumores de próstata se vuelven resistentes a la castración. La castración quirúrgica de modelos de ratón permite estudiar la resistencia a la castración y otras facetas de la biología hormonal en la próstata. Este procedimiento puede combinarse con la reintroducción de testosterona o la regeneración hormonal de la próstata, un método poderoso para estudiar los linajes de células madre en la próstata. Juntas, la microdisección de la próstata y la castración quirúrgica abren una multitud de oportunidades para una investigación sólida y consistente del desarrollo y la enfermedad de la próstata. Este manuscrito describe los protocolos para la microdisección de próstata y la castración quirúrgica en el ratón de laboratorio.

Todos los seis lóbulos prostáticos fueron retirados de un ratón a través de la próstata micro-disección (Figura 1). El tracto urogenital completa (UGT) se compone de todos los lóbulos de la próstata, la vejiga, vesículas seminales y la uretra (Figura 1a). El conducto deferente se une a la uretra, pero no es necesaria para la próstata micro-disección, y por lo tanto se pueden separar antes de la retirada de la UGT cortando la uretra (Figura 1b-1c)...

Este manuscrito describe los protocolos de próstata micro-disección y la castración quirúrgica en el ratón de laboratorio. También se representan los resultados representativos producidos por estos protocolos. Finalmente, se discuten las ventajas y utilización de estos protocolos.

Murino de próstata micro-disección y la castración quirúrgica

Mouse models are used extensively to study prostate cancer and other diseases. The mouse is an excellent model with which to study the prostate and has ...

El objetivo general de estos procedimientos es permitir el estudio de la próstata, así como de diversas condiciones hormonales dentro del ratón. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cáncer de próstata, como, ¿cuáles son los efectos de la privación hormonal sobre la carcinogénesis prostática? La principal ventaja de esta técnica es que los efectos de diversos procesos patológicos y cambios hormonales pueden estudiarse en glándulas prostáticas individuales.Comience fijando un ratón a una tabla de disección en posición supina mediante las almohadillas de cada pata y rocíe el abdomen con etanol al 70%. A continuación, sujetando la piel del abdomen inferior con pinzas, use tijeras para cortar la piel y la peritonea aproximadamente un centímetro anterior a la abertura del pene. Continúe cortando la piel y la peritonea desde el abdomen inferior hacia ambos lados del abdomen hasta la caja torácica, exponiendo así la cavidad peritoneal.Después de identificar la ubicación de la vejiga y del tracto urogenital, o TUG, mueva suavemente la grasa y otros órganos hacia un lado para exponer los tejidos urinarios. Luego, utilizando pinzas, sujete un conducto deferente

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En este video, describimos el procedimiento para la disección del sistema urogenital o UGS de un modelo de ratón macho. Este UGS se disecciona ex vivo para aislar la glándula prostática y estudiar su papel en el desarrollo del cáncer de próstata.

Extracción de próstata del sistema urogenital de ratón: una técnica para separar la glándula prostática de otros órganos del sistema urinario y genital en ratones machos

En este video, demostramos el procedimiento para administrar la inyección intraprostática de células de cáncer de próstata en un modelo de ratón. Los modelos murinos ortotópicos se pueden utilizar para estudiar el origen de la enfermedad y la respuesta a las terapias de tratamiento en un entorno no invasivo y clínicamente relevante.

Inyección intraprostática de células cancerosas: una técnica para administrar células cancerosas para establecer un modelo ortotópico de cáncer de próstata en ratones

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Modelado del cáncer de próstata en modelos de ratón modificados genéticamente: una técnica de edición de genes localizados mediada por CRISPR/Cas9 en células del lóbulo anterior de la próstata de ratón

Este modelo ortotópico de cáncer de próstata humano permite la cuantificación del tamaño del tumor, las células tumorales circulantes, y formación de distinta metástasis al pulmón. Como las células deben escapar del órgano principal, entrar en el torrente sanguíneo, y se implanta en un sitio secundario, este modelo recapitula efectivamente el escenario en los seres humanos.

Un modelo murino de cáncer de próstata humano Metástasis ortotópico

El cáncer de próstata es la segunda causa más común de muertes relacionadas con el cáncer en los Estados Unidos. Un modelo ortotópico de cáncer proporciona un enfoque útil para comprender la biología del cáncer de próstata y evaluar la eficacia de los regímenes terapéuticos. Este protocolo describe los pasos detallados necesarios para establecer un modelo ortotópico de cáncer de próstata en ratones.

Preclínica modelo murino ortotópico de cáncer de próstata humano

El objetivo de este protocolo es demostrar la inyección intra prostática de las células de cáncer de próstata, con la posterior castración. Modelos preclínicos ortotópico de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y resistente a la castración son críticos para el estudio de la enfermedad en el contexto de un microambiente tumoral clínicamente relevante y un anfitrión inmunocompetente.

Un modelo murino Syngeneic bioluminiscente y fluorescente ortotópico de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y resistente a la castración

Ingeniería de tejido renales construcciones proporcionan una solución para la escasez de órganos y los efectos deletéreos de la diálisis. Aquí, describimos un protocolo micro disecar riñones murinos para el aislamiento de segmentos córtico-medular. Estos segmentos están implantados en construcciones celulares libre de andamio, formando organoides renal.

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Virus de la entrega de guías CRISPR para la próstata murina por alteración del gen

Ratones modificados genéticamente son modelos útiles para la investigación de mecanismos del cáncer de próstata. Aquí presentamos un protocolo para identificar y disecar la próstata lóbulos de un mouse del Sistema urogenital, diferenciarlas basados en la histología y aislar y cultura primaria células prostáticas en vitro como esferoides para análisis posteriores.

Identificación, caracterización histológica y disección de ratón próstata lóbulos para modelos In Vitro esferoide 3D cultura

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Este manuscrito describe una forma consistente de realizar rápidamente orquiectomías y ovariectomías de supervivencia en roedores.

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