La aplicación secuencial de cubreobjetos de vidrio para evaluar la compresión Rigidez de la lente del ratón: tensión y el análisis morfométricos

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la rigidez a la compresión y la geometría de las lentes de ratón utilizando un enfoque simple y económico. Este método puede responder preguntas clave en el campo de las lentes. Por ejemplo, cómo las diferentes perturbaciones genéticas y experimentales afectan a las propiedades biomecánicas del cristalino.

Las principales ventajas de esta técnica son que es precisa, reproducible y no requiere equipos costosos o especializados. Este método proporciona información sobre las propiedades de las lentes de ratón, con una posible aplicación a organismos modelo más grandes, como ratas y conejos. La visualización del método es fundamental porque los pasos de disección del cristalino y aplicación del cubreobjetos son difíciles de aprender sin una demostración.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Catherine Cheng, una postdoc de mi laboratorio. Comience la disección usando pinzas curvas para deprimir el tejido alrededor del ojo de un ratón sacrificado, sacando el ojo de la cuenca. Luego, retire el ojo y colóquelo en una placa de disección que contenga PBS fresco bajo un microscopio de disección.

Corta el nervio óptico lo más cerca posible del globo ocular. E inserte suave y cuidadosamente pinzas finas y rectas en el globo ocular a través del orificio donde el nervio óptico sale de la parte posterior del órgano. Realice con cuidado una incisión con unas tijeras desde la parte posterior hasta el borde de la córnea, teniendo cuidado de no dañar el cristalino.

Continúe la incisión a lo largo de la unión entre la córnea y la esclerótica, al menos hasta la mitad del globo ocular. Y empuje suavemente la córnea para extraer el cristalino del ojo a través de la abertura. Luego, use pinzas rectas de punta fina para eliminar con cuidado cualquier residuo grande que aún esté adherido a la lente.

Y confirmar visualmente que la lente está libre de daños. Al menos dos horas antes de comenzar las mediciones de rigidez, utilice una balanza analítica para pesar al menos 10 cubreobjetos de la misma caja. Determine el peso promedio de los cubreobjetos.

A continuación, humedece previamente los cubreobjetos y un espejo en ángulo recto en PBS a temperatura ambiente. Mientras se hidratan los materiales, llene la cámara de medición con 65 a 75 mililitros de PBS. Y coloque la cámara bajo un microscopio de disección configurado con un aumento de 30X, con iluminación desde la parte inferior y una fuente de luz de fibra óptica en los lados izquierdo y derecho.

Cuando las fundas estén listas, coloque el espejo de ángulo recto en la cámara a una distancia constante de la hendidura que se utilizará para sostener la lente. A continuación, con pinzas curvas, transfiera con cuidado las lentes disecadas a la cámara de medición. Configure la fuente de alimentación óptica de potencia al 80% de la intensidad de luz máxima y ajuste la salida de la fuente de alimentación en función de la iluminación ambiental, las preferencias del usuario y la calidad de la imagen según sea necesario.

Obtenga imágenes de vista superior de las lentes descargadas directamente desde arriba de la cámara. Luego, tome una foto del borde del espejo enfocado, seguida de una imagen de vista lateral de la lente descargada a través del espejo fuera de la hendidura. Luego, coloque una lente en la hendidura y confirme que la lente esté asentada de manera segura y recta dentro de la hendidura en su polo anterior o posterior.

Tome una foto de la lente en el espejo. A continuación, coloque suavemente un cubreobjetos sobre la lente. Después de dos minutos, tome otra imagen de vista lateral de la lente cargada.

Continúe agregando cubreobjetos, obteniendo imágenes de vista lateral dos minutos después de la adición de cada cubreobjetos, hasta que se haya aplicado el total de 10 cubreobjetos. A continuación, retire todos los cubreobjetos, espere los últimos dos minutos y obtenga imágenes de vista lateral del objetivo dentro y fuera de la hendidura. Y una imagen de vista superior de la lente fuera de la hendidura.

Para determinar el tamaño del núcleo del cristalino, coloque un lente en una placa de Petri limpia llena de PBS y use pinzas finas y rectas para desencapsular suavemente el cristalino. Para quitar las células de fibra cortical, enrolle el cristalino entre los dedos enguantados. A continuación, enjuague suavemente el núcleo de la lente en el PBS y vuelva a colocar el núcleo en la cámara de medición.

Adquiera una imagen del núcleo de la lente a través del espejo en ángulo recto. Por último, para analizar las imágenes, utilice el software de análisis de imágenes adecuado para medir los diámetros ecuatoriales y axiales de las lentes antes y después de cada paso de carga. Mida también el diámetro de cada núcleo de la lente.

En este experimento representativo, se midieron la rigidez y las dimensiones de lentes de ratón de dos, cuatro y ocho meses de edad y se calcularon las deformaciones axiales y ecuatoriales. La deformación axial es una función logarítmica de la carga aplicada con una disminución estadísticamente significativa, dependiente de la edad, en las deformaciones axiales y ecuatoriales bajo la carga máxima aplicada, lo que indica que la lente del ratón se endurece con la edad. Los datos de imagen recopilados durante este experimento también se utilizaron para determinar otras características morfológicas de la lente.

Como era de esperar, los diámetros axial y ecuatorial, y el volumen de la lente, aumentaron con la edad. La relación de aspecto indica que la lente tiene un diámetro ecuatorial ligeramente mayor que el diámetro axial. Y este parámetro no cambió con la edad.

El diámetro, el volumen y la fracción del núcleo del cristalino aumentan con la edad, lo que sugiere que el núcleo del cristalino se remodela para aumentar en tamaño relativo a medida que el cristalino envejece. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en 30 a 45 minutos por lente, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante colocar la lente de manera uniforme dentro de la hendidura y permitir que la lente se relaje durante dos minutos entre cada cubreobjetos adicional.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la rigidez a compresión y la morfometría de las lentes de ratón utilizando la aplicación secuencial de cubreobjetos. Esta técnica precisa, sencilla y barata allana el camino para que los investigadores exploren los efectos biomecánicos de las mutaciones genéticas en ratones.