Análisis alta Content Screening para evaluar los efectos toxicológicos de nocivo Componentes y potencialmente perjudicial (HPHC)

El objetivo general de este enfoque, que combina un analizador de células en tiempo real basado en impedancia y una plataforma basada en cribado de alto contenido, es proporcionar información sobre las dosis efectivas, la toxicidad y los efectos biológicos, para obtener el perfil tóxico de los compuestos probados. Este enfoque puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la toxicología. Abordando, por ejemplo, la citotoxicidad, la genotoxicidad y las respuestas al estrés celular.

Además, no solo proporciona información sobre múltiples parámetros bioquímicos y morfológicos simultáneamente, sino que también se puede aplicar a una gama diferente de tipos de células y modelos de cultivo celular. Debido a la jurisdicción y la limitación, todo el enfoque se realizará evaluando solo una pequeña parte del compuesto. Por la misma razón, solo se mostrará un protocolo para demostrar la Evaluación de Cribado de Alto Contenido.

Los encargados de demostrar el procedimiento serán Stefano Acali y Alexander Laurent, técnicos de mi laboratorio. Para ver las células epiteliales bronquiales humanas normales, o células NHBE, programe el instrumento para definir el número y la duración de las mediciones de impedancia. En este estudio, los datos se registran cada 15 minutos, durante 48 horas.

Mida el fondo de la placa pipeteando 50 microlitros de medio precalentado en cada pocillo de una placa RTCA de 96 pocillos. Este paso representa un requisito técnico para que el instrumento calcule la resistencia eléctrica del medio para utilizarla como referencia de referencia para los cálculos basados en celdas. A continuación, agregue 50 microlitros de suspensión celular a una concentración de 144, 000 células por mililitro al medio que ya está en cada pocillo de la placa RTCA.

Una vez que la célula se ha calentado, es muy importante dejar la placa a temperatura ambiente durante 40 minutos para permitir que las células se adhieran y obtengan una distribución celular homogénea. Incube las placas RTCA en la cuna de la incubadora y comience a registrar los datos durante las próximas 24, más o menos dos horas, antes de la dosificación. Para el control positivo, diluir la solución madre de estaurosporina de 10 milimolares, de uno a 10, en DMSO.

Agregue cinco microlitros de la dilución a 195 microlitros de medio para obtener una solución de trabajo 5x. Para los componentes dañinos y potencialmente dañinos, disuelva cada uno de ellos en el vehículo para generar una solución madre de un molar. A continuación, diluir cada solución madre de la sustancia problema, de una a 10, en medio para generar una solución de 100 milimolares.

Genere la placa maestra compuesta agregando primero el medio más el 10% de vehículo en los pozos de B a F, y la solución de 100 milimolares en el pozo A. Realice una dilución en serie de cinco pasos, del uno al 10, para obtener las soluciones de trabajo 5x. Para la dosificación, detenga el instrumento RTCA, abra la base para quitar la placa de exposición y coloque la placa en la herramienta de temperatura RTCA para evitar enfriar las celdas, lo que podría afectar la medición de impedancia. Agregue 25 microlitros de solución 5x de la placa maestra de compuesto a las celdas por triplicado, manteniendo el mismo orden de dosificación que en la placa maestra de compuesto.

No retire el medio de cultivo celular existente. A continuación, añada 25 microlitros de solución de control positivo 5x a las células de la mitad derecha de la fila inferior, sin eliminar el medio de cultivo existente. Del mismo modo, agregue 25 microlitros de medio a las celdas de la mitad izquierda de la fila inferior.

Después de sellar la placa con el sellador de placas, vuelva a colocar la placa en la cuna RTCA y bloquéela. Reinicie la grabación de datos para el tiempo de exposición deseado. Después del registro de datos, analice los datos de viabilidad de la célula RTCA para determinar qué sustancia de prueba utilizar en el análisis de HCS.

En este experimento, se seleccionan 1-aminonaftaleno, arsénico, cromo y crotonaldehído para el análisis de HCS. Para ver las células NHBE, agregue 100 microlitros de una suspensión celular a 120.000 células por mililitro a cada pocillo de una placa negra de 96 pocillos. Después de dejar la placa HCS a temperatura ambiente durante 30 minutos, para permitir que las células se adhieran a los pocillos, incube a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante 24, más o menos dos horas, antes de la dosificación.

Para el control positivo, dispense 40 microlitros de la solución madre de cada control positivo en la columna dos. Luego, dispense 20 microlitros del vehículo en las columnas tres y cinco. Y 40 microlitros del vehículo en la columna cuatro.

Extraiga 12 microlitros de los pocillos de la columna dos, expíndalos a los pocillos de la columna tres y mezcle. Continuar hasta obtener una dilución final en serie con tres dosis y vehículo para cada compuesto de control positivo. Para generar la placa de control positivo, prepare una dilución de uno a 40 en medio de las tres dosis y vehículo.

Para hacer la placa maestra compuesta, vuelva a suspender y diluya cada solución madre de la sustancia problema, de una a 10 pulgadas en medio para una concentración de 100 milimolares. Realizar diluciones utilizando medio con un vehículo del 10% para obtener las dosis 5x seleccionadas para cada sustancia problema. Tanto los controles positivos como la placa compuesta ya están listos para ser dosificados sobre la placa de exposición.

A continuación, agregue 25 microlitros de soluciones 5x de la placa maestra compuesta a las celdas por triplicado, manteniendo el mismo orden de dosificación que en la placa maestra compuesta. No retire el medio de cultivo celular existente. A continuación, añada 25 microlitros de la solución 5x de la placa de control positivo a las celdas de la fila inferior, manteniendo el mismo orden de dosificación que en la placa de control positivo.

Prepare un volumen suficiente de la solución de tinción de células vivas como se describe en el protocolo de texto. A continuación, diluya tanto el colorante de mitocondrias como el colorante de permeabilidad de membrana en la solución de tinción de células vivas, de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Agregue 50 microlitros de la solución de tinción de células vivas a cada pocillo de la placa designada como ensayo de citotoxicidad.

No retire el medio de cultivo celular e incube durante 30 minutos a 37 grados centígrados, 5% de CO2. Aspire suavemente el medio y la solución de tinción y agregue 100 microlitros de solución de fijación a cada pocillo. Luego, incube la placa durante 20 minutos a temperatura ambiente, en la oscuridad.

Después de la incubación, aspire suavemente la solución de fijación y lave una vez con 100 microlitros por pocillo de tampón de lavado. Retire el tampón de lavado y agregue 100 microlitros por pocillo de tampón de permeabilización 1x a cada pocillo, antes de incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente, en la oscuridad. Aspirar el tampón de permeabilización y lavar la placa dos veces con 100 microlitros, por pocillo, de tampón de lavado.

A continuación, aspire el tampón de lavado y añada 100 microlitros de 1x tampón de bloqueo a cada pocillo. Luego, incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente, en la oscuridad. Diluir el anticuerpo anti-citocromo C, de uno a 250, en la solución de anticuerpo primario.

A continuación, aspire el tampón de bloqueo y añada 50 microlitros, por pocillo, de solución primaria de anticuerpos a cada pocillo, antes de incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente, en la oscuridad. Diluir el anticuerpo anti-ratón, de uno a 500, en anticuerpo secundario y solución nuclear. Además, diluya el tinte nuclear, de uno a 1, 000, en anticuerpo secundario y solución nuclear.

Después de aspirar la solución primaria de anticuerpos, lave la placa tres veces con 100 microlitros, por pocillo, de tampón de lavado, utilizando la arandela de placas. Aspire el tampón de lavado y agregue 50 microlitros, por pocillo, de anticuerpo secundario y solución nuclear a cada pocillo de la placa. Ahora, incuba la placa durante 60 minutos a temperatura ambiente, en la oscuridad.

Después de la aspiración del anticuerpo secundario y la solución nuclear, lave la placa tres veces con 100 microlitros de tampón de lavado por pocillo utilizando la arandela de placas. Luego, agregue 100 microlitros, por pocillo, de tampón de lavado. La placa ya está lista para ser evaluada en el instrumento HCS y se inicia la adquisición.

Se muestran los resultados representativos de la viabilidad de las células RTCA del tratamiento con la sustancia problema. Se obtiene un efecto tóxico dependiente de la dosis durante 24 horas de exposición solo con 1-aminonaftaleno, arsénico, cromo y crotonaldehído, ya que todos mostraron una DL50 calculada de menos de 20 milimolares. No se obtuvo ningún efecto tóxico con los otros compuestos.

Aquí se muestran los resultados representativos de HCS solo para el tratamiento con 1-aminonaftaleno. El efecto tóxico del 1-aminonaftaleno está induciendo un daño severo de la membrana celular, lo que conduce a un aumento de la permeabilidad de la membrana celular de manera dependiente de la dosis, después de cuatro horas de exposición. El compuesto también está afectando a las mitocondrias, induciendo un aumento de masa después de cuatro horas de exposición, junto con la liberación de citocromo C, que luego es detectable en los núcleos después de cuatro y 24 horas de exposición.

Una vez dominada, esta técnica se puede ejecutar en dos o tres días, ya que la mayoría de ellos requieren aproximadamente una hora al día de tiempo manual para el ajuste y la dosificación. Dependiendo del protocolo seleccionado, el Cribado de Alto Contenido requiere un máximo de tres horas y media para la ejecución de todo el procedimiento de tinción. Al intentar este procedimiento, tenga en cuenta que, aunque la selección de una gama más amplia de puntos de conexión agrega complejidad al flujo de trabajo, no aumentará sustancialmente el tiempo.

De hecho, con un flujo de trabajo óptimo, se pueden evaluar varias placas en paralelo. El desarrollo continuo de la plataforma de cribado de alto contenido, que incluye el ajuste de células totalmente automatizado, la dilución de compuestos, la dosificación y la tinción, y la adición de un nuevo punto final, ampliará aún más la capacidad de la plataforma de cribado de alto contenido como una poderosa herramienta para la elaboración de perfiles toxicológicos. Además, la combinación de múltiples criterios de valoración toxicológicos únicos en un rendimiento tan alto nos llevará un paso más allá en nuestro esfuerzo por reducir las pruebas químicas en animales.