Name: Análisis alta Content Screening para evaluar los efectos toxicológicos de nocivo Componentes y potencialmente perjudicial (HPHC) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Aprende a evaluar la toxicidad de componentes nocivos del humo de cigarrillo mediante análisis de impedancia y cribado de alto contenido en células epiteliales bronquiales humanas.

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Los autores desean agradecer a Karsta Luettich y Grégory Vuillaume para su revisión del manuscrito.

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Todos los autores son empleados de Philip Morris International. Philip Morris International es la única fuente de financiación y patrocinador de este proyecto.

La necesidad de alternativas a la experimentación animal y para los nuevos enfoques de pruebas de alto rendimiento han sido ampliamente discutido en los últimos años. Esto ha llevado a los científicos y las autoridades reguladoras para investigar métodos alternativos para los ensayos de toxicidad estándar, utilizando ensayos celulares que imitan estrechamente la fisiología de los tejidos diana. En este estudio, hemos demostrado la aplicabilidad de la combinación de un analizador de células en tiempo real (RTCA) con una plataforma de alto contenido de cribado (HCS) para evaluar el impacto de la exposición a los componentes individuales de CS en las células epiteliales de pulmón humano. Esta configuración se puede aplicar de forma análoga para evaluar la citotoxicidad inducida por diversos otros contaminantes transportados por el aire, partículas en el aire, y nanopartículas. Por otra parte, los resultados obtenidos se pueden combinar con los de la transcriptómica de todo el genoma y los métodos de cálculo basado en redes biológicas causales. Como se informó anteriormente, este enfoque nos permitió corroborar datos sobre el mecanismo molecularperturbación tras la exposición CS 5 con puntos finales de HCS, frente a estas perturbaciones vía también fenotípicamente. Como un ensayo de diagrama de flujo, análisis de células en tiempo real proporciona información relacionada con la viabilidad celular en una resolución de la dosis y dependiente del tiempo, lo que permite una mejor toma de decisiones que la exposición punto de tiempo de la dosis y pueden ser favorables para el análisis de aguas abajo 14. El principio del analizador se basa en cambios en la impedancia eléctrica generada por las células, ya que se unen y se extendió sobre una superficie de pocillo de cultivo cubierto con un microelectrodo de oro. La impedancia se convierte en un parámetro adimensional denominada célula-índice, que puede ser utilizado para controlar la adhesión celular, la difusión, la morfología y en última instancia, la viabilidad celular. Aunque esta técnica no proporciona información sobre los mecanismos citotóxicos, su sensibilidad permite la detección de cambios celulares morfológicos incluso a dosis muy bajas en la que el HCS no es informativo (datos no mostrados). Basado en Previsos experimentos, hemos observado que la metodología RTCA es capaz de detectar cambios morfológicos en dosis más bajas en comparación con los criterios de valoración de HCS. Tras el cribado inicial con el analizador de células en tiempo real, se utilizó una plataforma HCS para obtener información más detallada sobre el tipo de citotoxicidad provocada por cada HPHC. El panel de ensayo de HCS permitido al perfil HPHC hacia su potencial impacto en compartimentos celulares / orgánulos, así como para identificar las encontradas para la genotoxicidad o el estrés oxidativo. El análisis reveló distintos perfiles mediante el cual los HPHC seleccionados inducen citotoxicidad en células NHBE. En general, todos los compuestos, excepto de fenol, se encontraron para inducir la necrosis en las dosis más altas ensayadas. De acuerdo con un posible papel en el desarrollo del cáncer de la fosforilación inducida por 1-aminonaphtalene de H2AX como un marcador para la genotoxicidad, sin embargo, el panel de HCS también actividad no cubierta de este HPHC en la lectura de la toxicidad mitocondrial (aumento de la masa y el citocromo C releaSE) y el estrés oxidativo (agotamiento GSH). Del mismo modo, como se describió anteriormente, el fenol se identificó para inducir la disfunción mitocondrial, y causar daño en el ADN, así como el agotamiento de GSH. El cromo (VI), uno de los compuestos clasificados como carcinógenos del grupo I, y crotonaldehído fueron también los dos, identificados como genotóxico, en particular, el cromo (VI) la apoptosis inducida también (activación cascada de caspasas) y crotonaldehído causó una mayor generación de ROS. Finalmente arsénico (V), se encontró para inducir la fosforilación de cJun, que es un marcador de la activación de la vía estrés quinasa. En este estudio, hemos utilizado células NHBE como un modelo para las células epiteliales del pulmón in vitro. El uso de estas células en un entorno HCS no tiene precedentes y permitió a la investigación de una gama más amplia de puntos finales, incluyendo los marcadores de genotoxicidad y el estrés oxidativo. Tanto células en vivo y enfoques de tinción de células fijadas se describen dentro de nuestros protocolos, lo que demuestra la flexibilidad de la técnica en general. en facto, los mismos protocolos se puede aplicar a una gama más amplia de objetivos, que puede ser abordado por el uso de cualquier colorante fluorescente o anticuerpo. Para la ejecución con éxito de los protocolos de tinción en vivo, es importante respetar el tiempo de incubación, ya que algunos de los colorantes tienen una vida media limitada y la señal de fluorescencia puede disminuir antes de que se completó la adquisición de la imagen. También es importante tener en cuenta que si se utiliza un tipo de célula diferente, todas las condiciones de tinción deben ser re-evaluado, ya que la concentración óptima de colorante y el tiempo de incubación pueden ser diferentes. En el presente trabajo hemos descrito un escenario en el que sólo cinco compuestos en los que seleccionaron con la metodología de HCS. Teniendo en cuenta la disposición de la placa descrita previamente, que fueron dosificados más de 2 diferentes conjuntos de placas para un total de 24 placas (6 ensayos y 2 puntos de tiempo) .El número de placas también se podría aumentar, permitiendo así la detección simultánea de más compuestos o los Invesgación de más puntos finales. Antes de hacerlo, sin embargo, se debe tener en cuenta que ciertos criterios de valoración (GSH y ROS) requieren la adquisición inmediata, y como consecuencia, la dosificación de las placas debe ser realizado de forma escalonada para permitir la adquisición de la placa anterior. Por otro lado, el uso de un protocolo de tinción celular fijo representa una ventaja ya que las placas pueden ser apiladas, interrumpiendo el protocolo en cualquier paso después de la fijación, para la realización del procedimiento de tinción en una etapa posterior. Este enfoque, por ejemplo, podría proporcionar al operador el tiempo para completar todas las placas de tinción de células vivas sin comprometer la calidad de los datos. Para optimizar aún más el flujo de trabajo al disminuir el número de placas, que también sería posible multiplexar más puntos finales juntos. Por ejemplo en este contexto daño del ADN y el estrés quinasa podría ser investigado juntos el simple uso de dos anticuerpos secundaria con fluorocromos que emiten en diferentes channels. El desarrollo continuo de la plataforma de HCS, incluyendo la siembra totalmente automatizado de células, la dilución del compuesto, la dosificación y la tinción, así como la adición de nuevos criterios de valoración serán ampliar aún más la capacidad de la plataforma de HCS como una herramienta de perfilado de gran alcance para HPHC en epiteliales y otros tipos de células .

Evaluación del riesgo toxicológico históricamente se ha basado en el uso de modelos animales que, aunque fundamental en las ciencias de la vida, también están vinculados con deficiencias tales como la traducibilidad inconsistente para los seres humanos y de alto costo. Por otra parte, ha habido un creciente esfuerzo para encontrar alternativas a la experimentación con animales en el espíritu de &quot;Las 3R&quot; 2 (reemplazo, reducción y refinamiento). Este esfuerzo se ha acelerado en los últimos años, no sólo debido a los recientes avances tales como técnicas de alto rendimiento y los enfoques de biología de sistemas, sino también debido a la legislación que restringe el uso de la experimentación con animales, especialmente en la Unión Europea. La complejidad de las vías de señalización celular que regulan la respuesta a los insultos tóxicos hace que sea evidente que el uso de criterios de valoración toxicológicos individuales no será suficiente para describir la base toxicológica de ciertos compuestos. Para esto, la interacción de cientos de interactuar pTambién tendrá que ser tenido en cuenta roteins que contribuyen a una red biológica. Para estudiar el efecto de las sustancias tóxicas en dichas redes, un enfoque toxicología sistema combinado con mediano fenotípicas y ensayos de selección de alto rendimiento es útil para inferir potencias y, al mismo tiempo, proporcionar más información sobre el mecanismo de acción de sustancias tóxicas individuales. En este estudio, hemos empleado HCS como una poderosa herramienta de detección, que se compone de un microscopio automatizado y una aplicación de software biológica, que se puede adquirir, procesar y analizar datos de imagen obtenidos a partir de ensayos celulares específicos basados ​​en fluorescencia. Esto permite cambios visuales dentro de una célula a ser cuantificado, en una única célula o nivel subcelular, y muchos parámetros a analizar de forma simultánea. 3 Por ejemplo, el ADN doble filamento se rompe se evaluaron utilizando una identificación basada en anticuerpos de la fosforilación de la histona H2AX y especies reactivas del oxígeno (ROS) se cuantificaron utilizando una célula-permsuperóxido eable colorante sensible. Dado que las células epiteliales del pulmón representan la primera barrera biológica contra la inhalación de sustancias tóxicas, como el humo del cigarrillo, que utilizó las células epiteliales bronquiales primarias como un modelo in vitro para perfilar el efecto de HPHC publicados por la Food and Drug Administration. 4 Este manuscrito es un seguimiento -up en un estudio anterior 5 en el que se evaluó el impacto biológico de un subconjunto diferente de HPHC. Como parte de nuestro flujo de trabajo para evaluar la citotoxicidad in vitro, que inicialmente se evaluaron las potencias de una selección de 15 HPHC de, mediante un análisis celular en tiempo real basado en la impedancia del sistema (RTCA), que permitió establecer dosis-rangos, adecuados para su posterior HCS análisis (Figura 1). Una evaluación toxicológica HCS continuación, se llevó a cabo utilizando nueve puntos terminales multi-paramétricas de toxicidad celular, cada uno controla a dos puntos de tiempo (4 y 24 h). Los marcadores utilizados fueron indicativos de toxicidad mitocondrial, el daño del ADN, el estrés quinasa, especies reactivas de oxígeno (ROS), contenido de glutatión (GSH), caspasa 3 - actividad 7, la liberación de citocromo C y permeabilidad de la membrana celular, como se describe en la Tabla 1. Nuestro enfoque permitido la identificación y caracterización de los efectos de los componentes del humo del cigarrillo a través del muestreo de la dosis y dependiente del tiempo. En última instancia, esto produjo un perfil toxicológico in vitro para cada HPHC. enfoques Multi-ómicas también se pueden utilizar para complementar aún más el análisis de HCS. Esto finalmente también proporcionar una comprensión más profunda de los efectos en la señalización celular y / o de transcripción.

<table><tbody><tr><td>Celofoncias ArrayScan VTI HCS Reader</td><td>Thermo</td><td>N01-0002B</td><td></td></tr><tr><td>xCelligence RTCA MP</td><td>ACEA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>05331625001 Screener (HCS)</td><td>Genedata</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>contador CASY TTC</td><td>Roche</td><td>05 651 719 001</td><td></td></tr><tr><td>e-Plates VIEW 96</td><td>ACEA</td><td>06 472 451 001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA Frame 96</td><td>ACEA</td><td>05232392001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA Cardio Temperature Tool</td><td>ACEA</td><td>2801171</td><td></td></tr><tr><td>Sellador de placas breathseal</td><td>Greiner bio-one</td><td>676051</td><td></td></tr><tr><td>Células epiteliales bronquiales humanas normales (NHBE)</td><td>Lonza</td><td>CC-2540</td><td>no fumador Donante masculino caucásico de 60 años&nbsp;</td></tr><tr><td>BEGM BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>Cálido a 37 &deg; C antes de usar</td></tr><tr><td>ReagentPack Subculture Reagents kit</td><td>Lonza</td><td>CC-5034</td><td>Warm at 37 &deg; C antes de usar</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina (100x)</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Easy Flask tapón de filtro 75&nbsp; cm2</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-565-349</td><td></td></tr><tr><td>placa de ensayo de 96 pocillos&nbsp; negro&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-62249</td><td></td></tr><tr><td>Draq5 (para tinción nuclear en rojo lejano)</td>Estado <td>biológico</td><td>DR50200</td><td></td></tr><tr><td>Tinte mitocondrial: MitoTracker Red CMXRos</td><td>Life technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Tinte mitocondrial: MitoTracker Red CM-H2XRos</td><td>Life technologies</td><td>M-7513</td><td></td></tr><tr><td>ROS Colorante: Dihidroetidio</td><td>Sigma</td><td>D7008</td><td></td></tr><tr><td>ROS Dye: CellROX</td><td>Life technologies</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>ROS Colorante: MitoSOX</td><td>Life technologies</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>GSH Colorante: Monoclorobimana</td><td>Sigma</td><td>69899</td><td>Tinte</td></tr><tr><td>tóxico GSH: Monobromobimane</td><td>Life technologies</td><td>M-1378</td><td>Tinte de</td></tr><tr><td>permeabilidad a la membrana tóxica: YO-PRO-1&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>Y3603</td><td>Irritante&nbsp;</td></tr><tr><td>Tinte de permeabilidad de la membrana: TO-PRO-1&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>T3602</td><td>Irritante&nbsp;</td></tr><tr><td>Tinte de permeabilidad de la membrana: TOTO-1&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>T3600</td><td>Irritante&nbsp;</td></tr><tr><td>Tinte de caspasa: Cellevent Caspasa 3/7 green</td><td>Life technologies</td><td>C10423</td><td>Irritante&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-citocromo C (Ratón)</td><td>Thermo</td><td>MA5-11823</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-fosfo-c-Jun (Ratón)</td><td>Thermo</td><td>MA5-15889</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-fosfo-H2AX (Ratón)</td><td>Thermo</td><td>MA1-2022</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-Ratón IgG DyLight 650&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab96878</td><td></td></tr><tr><td>10x tampón de permeabilización</td><td>Fisher</td><td>8408400</td><td></td></tr><tr><td>4% Solución de formaldehído</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td>Tóxico</td></tr><tr><td>10x tampón de bloqueo</td><td>Fisher</td><td>8408500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hanks</td><td>Sigma</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>Staurosporina</td><td>Sigma</td><td>S4400</td><td></td></tr><tr><td>Valinomicina</td> Tóxica <td>Sigma</td><td>V0627</td><td></td></tr><tr><td>Paraquat</td> Tóxico <td>Sigma</td><td>36541</td><td></td></tr><tr><td>Anisomicina</td> Tóxica <td>Sigma</td><td>A9789</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Etamrínico</td> Tóxico <td>Sigma</td><td>E4754</td><td>Tóxico</td></tr><tr><td>1-Aminonaphtaleno</td><td>Sigma</td><td>34390</td><td>Tóxico</td></tr><tr><td>2-Nitropropano</td><td>Sigma</td><td>130265</td><td></td></tr><tr><td>Acetamida</td> Tóxica <td>Sigma</td><td>695122</td><td></td></tr><tr><td>Acetona Tóxica</td><td>Sigma</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td> Tóxica <td>Sigma</td><td>A9099</td><td></td></tr><tr><td>Arsénico Tóxico (V)</td><td>Sigma</td><td>A6756</td><td>nocivo</td></tr><tr><td>Benceno</td><td>Sigma</td><td>12540</td><td>Cromo tóxico</td></tr><tr><td>(VI)</td><td>Sigma</td><td>216623</td><td>Tóxico</td></tr><tr><td>Crotonaldehído</td><td>Sigma</td><td>262668</td><td>Tóxico</td></tr><tr><td>Metiletilcetona</td><td>Sigma</td><td>34861</td><td>Níquel tóxico</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>203866</td><td></td></tr><tr><td>Tóxico Nitrobenceno</td><td>Sigma</td><td>48547</td><td>Tóxico</td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Sigma</td><td>P5566</td><td>Tóxico</td></tr><tr><td>Quinolina</td><td>Sigma</td><td>241571</td><td>Tóxico</td></tr><tr><td>Tolueno</td><td>Sigma</td><td>34866</td><td>Tóxico</td></tr></tbody></table>

análisis alta content screening para evaluar los efectos toxicológicos de nocivo componentes y potencialmente perjudicial (hphc)

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

El humo del cigarrillo (CS) es un importante factor de riesgo para las enfermedades cardiovasculares y pulmonares. Debido a que CS es un aerosol complejo que contiene más de 7.000 sustancias químicas 1 es un reto para evaluar las contribuciones de los componentes individuales a su toxicidad general. Perfiles toxicológicos de los componentes individuales así como las mezclas se pueden sin embargo establecieron in vitro, mediante la aplicación de alto rendimiento de procesamiento herramientas de evaluación, que permiten determinar las características de nocivo Componentes y potencialmente perjudicial (HPHC) del humo del tabaco, tal como se define por la Food and Drug Administration (FDA). 2 Para una evaluación inicial, se utilizó un instrumento basado en la impedancia para un tiempo real, la evaluación etiqueta libre de la toxicidad del compuesto. La lectura de instrumento se basa en la adhesión celular, la viabilidad y la morfología que todos juntos proporcionan una visión general del estado de las células. Un parámetro adimensional, llamada índice de células, se utiliza para la cuantificación. Un conjunto de DIFrentes protocolos de tinción fue desarrollado para una investigación basada en imágenes de fluorescencia y se utilizó una plataforma HCS para obtener información más detallada sobre el tipo de citotoxicidad provocada por cada HPHC. De los 15 componentes al control, sólo cinco fueron seleccionados para el análisis basado en HCS, ya que registraron un LD computable 50 (&lt;20 mm). Estos incluyen 1-aminonaphtalene, arsénico (V), cromo (VI), crotonaldehído y fenol. Sobre la base de su efecto en el HCS, 1-aminonaphtalene y fenol pueden ser identificados para inducir la disfunción mitocondrial, y, junto con el cromo (VI) como genotóxico basada en el aumento de la fosforilación de la histona H2AX. El crotonaldehído se identificó como un inductor de estrés oxidativo y arsénico como un activador de la vía estrés quinasa. Este estudio demuestra que una combinación de tecnologías basadas en la impedancia y HCS proporciona una herramienta robusta para la evaluación in vitro de los componentes de CS.

RTCA Debido a que los puntos finales de HCS no ser informativo cuando se detecta ningún efecto tóxico, aquellos compuestos que no muestran disminución de la viabilidad celular hasta la concentración más alta en el RCTA no son probados por HCS (Figura 3b, c, d, g, k, l, m , p). Los compuestos que muestran disminución de la viabilidad celular en la más alta concentración (Figura 3e, o) están también anula la selección de HCS. Por último, sólo los constituyentes con una LD computable 50 (&lt;20 mM) se seleccionan para su posterior análisis HCS (Figura 3a, f, h, j, n). HPHC cumplen los criterios anteriores son: 1-aminonaphtalene, arsénico (V), cromo (VI), crotonaldehído y fenol. HCS Como comprobación de la calidad (QC), controles positivos son fiprimero analizada para asegurar que el procedimiento de tinción se lleva a cabo correctamente. Imágenes representativas de las células de control tratadas con positivos se muestran en la Figura 6. Los valores de datos se normalizan para vehículo como se describe anteriormente. No hay curvas de dosis-respuesta se representan como sólo tres dosis son probados y no todas las tres dosis se consideran en cada punto de tiempo. dosis del control positivo se seleccionan (en base a los experimentos anteriores, datos no mostrados) de manera que las respuestas apropiadas se observan para cada punto final, tanto en 4 hr y 24 hr. En dosis particulares 1 y 2 se utilizan para evaluar el efecto en 4 hr mientras que las dosis de 2 y 3 se utilizan para evaluar el efecto a las 24 horas. Las placas se descartan si no se observa respuesta para las dosis de control positivo. Tenga en cuenta que para todos los puntos finales, a excepción de potencial de membrana mitocondrial y el contenido de GSH, se espera un incremento de la intensidad de la señal. Todos los compuestos, con excepción de fenol, inducen un fenotipo necrótico<html> tipo, basado en aumento de la permeabilidad de la membrana celular (Figura 7a, f, h, l). 1-aminonaphtalene, el cromo (VI), crotonaldehído y fenol se identificaron como genotóxicos basado en aumento de la fosforilación de la histona H2AX (Figura 7e, j, n, p). Se encontraron fenol y 1-aminonaphtalene para inducir disfunción mitocondrial grave (Figura 7b, o) el cual, con 1-aminonaphtalene, dio lugar a un aumento de la liberación de citocromo C (Figura 7c). La detección del aumento de la actividad caspasa 3/7 proporcionó evidencia de eventos apoptóticos tras la exposición de cromo. Inducción de estrés oxidativo (ROS o GSH) también se detectó después del tratamiento con 1-aminonaphtalene, crotonaldehído y fenol (Figura 7d, m, q). Finalmente, arsénico induce estrés celular como se demuestra por el aumento de la fosforilación del factor de transcripción cJun (Figura 7 g). carga / 53987 / 53987fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Compuesto Tox-Profiler de flujo de trabajo. A) Representación esquemática del flujo de trabajo seguido en este estudio. En primer lugar, la constatación intervalo de dosis se realizó utilizando la plataforma RTCA para seleccionar las dosis apropiadas para su posterior HCS para caracterizar los perfiles específicos de toxicidad. B) Diseño experimental del estudio. 24 horas después de la siembra, se dosificaron células y los valores de impedancia monitoreados continuamente durante 24 horas la siguiente, mientras que los puntos finales de HCS se investigaron 4 y 24 horas después de la dosificación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig2.jpg" /> Figura 2. RTCA exposición de la plancha. Compuesto placa principal se generó por primera vez mediante la realización de una serie de dilución 1:10 de cinco pasos. Cada compuesto,incluyendo el control del vehículo (dosis 0) se añade a continuación por triplicado a la placa de la exposición, junto con medio y estaurosporina como controles. Tenga en cuenta que las dosis secuencia se mantiene después de la transferencia, las dosis más altas están en la fila número 1, mientras que los controles del vehículo están en la fila número 7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig3.jpg" /> Figura 3. Representante RTCA de viabilidad de la célula Resultados. A) 1-aminonaphtalene, b) 2-nitropropano, c) acetamida, d) Acetona, e) acrilamida, f) Arsénico (V), g) benceno, h) de cromo (VI) , j) crotonaldehído, k) de metil etil cetona, l) Nickel (II), m) nitrobenceno, n) fenol, o) quinolina, p) tolueno. A las 24 h después de la dosificación, el área bajo la curva (AUC) se calculó para cada dosis (incluido el control positivo y el vehículo) y normalizado en un intervalo de 0 a la actividad -100% (eje y), donde 0 refleja la actividad de el vehículo y -100 del control positivo. Los valores se representan a continuación y ajustaron mediante una ecuación de Hill de cuatro parámetros y, cuando sea posible, se calculó la DL50. Las concentraciones se expresan en una escala logarítmica (eje x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig4.jpg" /> Figura 4. Esquema de dilución para los Compuestos control positivo para ensayos de HCS. A) La adición de controles positivos y cincohículo a la dilución en serie de placas. b) dilución de serie de los controles positivos. c) 200X controles positivos dosis. de) Dilución de los 200x controles positivos en dosis media (01:40) para generar la placa de control positivo que contiene las dosis de 5x. Tenga en cuenta que cada dosis se diluye por triplicado para reflejar la disposición final en la placa de la exposición). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig5.jpg" /> Figura 5. HCS exposición de la plancha. Compuesto placa principal se generó por primera vez mediante la realización de una dilución de cinco pasos. Se añadió cada compuesto, incluyendo el control del vehículo (dosis 0) y luego por triplicado a la placa de la exposición, junto con los controles positivos. Tenga en cuenta que el orden de las dosis se mantiene después de la transferencia,Las dosis más altas están en la fila número 1, mientras que los controles del vehículo están en la fila número 7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig6.jpg" /> Figura 6. Representante fluorescentes Fotos de anticuerpo o tinte-células teñidas a) Parámetros nucleares - tinte nuclear: un colorante. Permeables que se une al ADN de las células vivas o fijas. Esta mancha se utiliza para identificar las células individuales de etiquetado de la región nuclear b) Necrosis - colorante permeabilidad de la membrana celular:. Detección basada en tinte de integridad de la membrana celular. Reactivo es intrínsecamente impermeable a la membrana celular. Durante necrosis, la membrana se hace permeable y el colorante penetra en la célula y se une al ADN produciendo un fuerte s fluorescente. ignal c) Apoptosis - citocromo C: la detección basada en anticuerpos de la liberación del citocromo C, una característica bien conocida de la apoptosis temprana. Tras la inducción de la apoptosis, el citocromo c se libera desde la mitocondria y se difunde en el núcleo d) Daño del ADN - pH2AX:.. Detección basada en anticuerpos de la fosforilación de la histona H2AX, una característica bien conocida de roturas de doble cadena de ADN e) quinasa de estrés - cJun:. detección basada en anticuerpos de la fosforilación en Ser-73 de cJun, un sello bien conocido de estrés celular f) estrés oxidativo - DHE: la detección basada en tinte de radicales superóxido. Sí dihydroethidium presenta fluorescencia azul en el citoplasma mientras que la forma oxidada de etidio fluorescencia roja al ADN intercalación g) GSH - CMBC:. Detección basada en tinte de moléculas libres de GSH. CMBC reacciona con GSH agenerar un producto altamente fluorescente h) La apoptosis - Caspasa 3/7 de activación:. detección basada en tinte de la caspasa 3/7 actividad. Reactivo es no fluorescente con un péptido de cuatro aminoácidos que inhibe la unión al ADN. Tras la activación de la caspasa-3/7, el péptido se escinde permitiendo que el tinte de unirse al ADN y producir una respuesta brillante, fluorogénico. BH paneles muestran las células de control tratadas positivos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig7.jpg" /> Figura 7. Representante HCS Resultados. 1-aminonaphtalene (ae), arsénico (V) (F y G), cromo (VI) (HK), crotonaldehído (ln) y fenol (OQ). 4 horas (línea azul) y24 hr (línea naranja) las señales se calcularon para cada dosis y se normalizó a la actividad del vehículo (0%). Los valores que no están incluidos en los cálculos de la curva de ajuste se muestran en gris. Las concentraciones se expresan en una escala logarítmica (eje x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig7large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Ensayo </td><td> punto final # </td><td> punto final biológico </td><td> compartimento celular </td><td> La función de salida </td></tr><tr><td rowspan="4"> citotoxicidad </td><td> 1 </td><td> La masa mitocondrial 6 </td><td> Citoplasma </td><td> el área promedio de entrega inmediata </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Potencial de membrana mitocondrial 6 </td><td> Citoplasma </td><td> la intensidad promedio de entrega inmediata </td></tr><tr><td> 3 </td><td> la liberación del citocromo C <sup&gt; 7 </td><td> Núcleo </td><td> intensidad media </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Permeabilidad de la membrana celular 8 </td><td> Núcleo </td><td> intensidad media </td></tr><tr><td> Daño en el ADN </td><td> 5 </td><td> fosfo-H2AX 9 </td><td> Núcleo </td><td> intensidad media </td></tr><tr><td> El estrés quinasa </td><td> 6 </td><td> fosfo-10 cJun </td><td> Núcleo </td><td> intensidad media </td></tr><tr><td> ROS </td><td> 7 </td><td> ROS 11 </td><td> Núcleo </td><td> intensidad media </td></tr><tr><td> el contenido de GSH </td><td> 8 </td><td> GSH 12 </td><td> Citoplasma </td><td> la intensidad promedio de entrega inmediata </td></tr><tr><td> La apoptosis </td><td> 9 </td><td> La caspasa 3 13 </td><td> Citoplasma </td><td> la intensidad promedio de entrega inmediata </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Lista de HCS unassays y puntos finales. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"></td><td rowspan="2"> Vehículo </td><td colspan="6" rowspan="2"> RTCA dosis (M) </td><td rowspan="2"> LD 50 </td><td colspan="5"> dosis HCS </td></tr><tr><td colspan="2"></td><td colspan="4"> Cell viabilidad-seleccionado (M) </td><td> 3R4F (nM) </td></tr><tr><td colspan="2"> 1-Aminonaphtalene </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 280 M </td><td> 2.000 </td><td> 500 </td><td> 200 </td><td> 150 </td><td> 0.27 </td></tr><tr><td colspan="2"> 2-nitropropano </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> acetamida </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Acetona </td><td> Agua </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> acrilamida </td><td> Agua </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Arsénico (V) </td><td> Agua </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 160 M </td><td> 200 </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 25 </td> &lt;td&gt; 0,17 </td></tr><tr><td colspan="2"> Benceno </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> El cromo (VI) </td><td> Agua </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 20 M </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 20 </td><td> 10 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td colspan="2"> crotonaldehıdo </td><td> Agua </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 200 micras </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2.000 </td></tr><tr><td colspan="2"> Metil etil cetona </td><td> Agua </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt;20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Níquel </td><td> Agua </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Nitrobenceno </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Fenol </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 2.300 M </td><td> 5,000 </td><td> 2.000 </td><td> 1000 </td><td> 500 </td><td> 240 </td></tr><tr><td colspan="2"> quinolina </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td&gt; <td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> tolueno </td><td> Agua </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 2. Lista de compuestos HPHC Probado con relativa LD 50 a las 24 horas de tratamiento. Los compuestos seleccionados para el análisis HCS se resaltan en color naranja y también se dan las dosis probadas. La dosis 3R4F es equivalente a la cantidad de constituyente presente en el humo de un palo de la 3R4F cigarrillo de referencia. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Ensayo </td><td> Compuesto </td><td> Solución de reserva </td><td> Solvente </td&gt; <td colspan="3"> Dosis (s) (M) </td></tr><tr><td> Viabilidad celular </td><td> estaurosporina </td><td> 10 mM </td><td> DMSO </td><td colspan="3"> 50 </td></tr><tr><td> citotoxicidad </td><td> valinomycin </td><td> 10 mM </td><td> DMSO </td><td> 50 </td><td> 20 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Daño en el ADN </td><td> El paraquat </td><td> 100 mM </td><td> DMSO </td><td> 500 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> El estrés quinasa </td><td> anisomicina </td><td> 2 mM </td><td> DMSO </td><td> 10 </td><td> 4 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ROS </td><td> rotenona </td><td> 200 mM </td><td> DMSO </td><td> 1000 </td><td> 400 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> el contenido de GSH </td><td> ácido etacrínico </td><td> 200 mM </td><td> DMSO </td><td> 1000 </td><td> 400 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> La apoptosis </td><td> estaurosporina </td><td> 40 mM </td><td> DMSO </td><td> 200 &lt;/ Td&gt; <td> 50 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table> Tabla 3. Lista de controles positivos y concentraciones utilizadas para cada ensayo.

El objetivo del estudio fue evaluar el impacto biológico de 15 componentes del humo de cigarrillo utilizando una combinación de un analizador de células en tiempo real basado en impedancia y una plataforma basada en cribado de alto contenido (HCS) para la evaluación toxicológica in vitro. Este estudio proporciona información sobre las dosis efectivas, la toxicidad y los modos de acción de los compuestos probados.

Análisis alta Content Screening para evaluar los efectos toxicológicos de nocivo Componentes y potencialmente perjudicial (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...

El objetivo general de este enfoque, que combina un analizador de células en tiempo real basado en impedancia y una plataforma basada en cribado de alto contenido, es proporcionar información sobre las dosis efectivas, la toxicidad y los efectos biológicos, para obtener el perfil tóxico de los compuestos probados. Este enfoque puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la toxicología. Abordando, por ejemplo, la citotoxicidad, la genotoxicidad y las respuestas al estrés celular.Además, no solo proporciona información sobre múltiples parámetros bioquímicos y morfológicos simultáneamente, sino que también se puede aplicar a una gama diferente de tipos de células y modelos de cultivo celular. Debido a la jurisdicción y la limitación, todo el enfoque se realizará evaluando solo una pequeña parte del compuesto. Por la misma razón, solo se mostrará un protocolo para demostrar la Evaluación de Cribado de Alto Contenido.Los encargados de demostrar el procedimiento serán Stefano Acali y Alexander Laurent, técnicos de mi laboratorio. Para ver las células epiteliales bronquiales humanas normales, o células NHBE, programe el instrumento para definir el número y la duración de las mediciones de impedancia. En este estudio, los datos se registran cada 15 minutos, durante 48 horas.Mida el fondo de la placa pipeteando 50 microlitros de medio precalentado en cada pocillo de una placa RTCA de 96 pocillos. Este paso representa un requisito técnico para que el instrumento calcule la resistencia eléctrica del medio para utilizarla como referencia de referencia para los cálculos basados en celdas. A continuación, agregue 50 microlitros de suspensión celular a una concentración de 144, 000 células por mililitro al medio que ya está en cada pocillo de la placa RTCA.Una vez que la célula se ha calentado, es muy importante dejar la placa a temperatura ambiente durante 40 minutos para permitir que las células se adhieran y obtengan una distribución celular homogénea. Incube las placas RTCA en la cuna de la incubadora y comience a registrar los datos durante las próximas 24, más o menos dos horas, antes de la dosificación. Para el control positivo, diluir la solución madre de estaurosporina de 10 milimolares, de uno a 10, en DMSO.Agregue cinco microlitros de la dilución a 195 microlitros de medio para obtener una solución de trabajo 5x. Para los componentes dañinos y potencialmente dañinos, disuelva cada uno de ellos en el vehículo para generar una solución madre de un molar. A continuación, diluir cada solución madre de la sustancia problema, de una a 10, en medio para generar una solución de 100 milimolares.Genere la placa maestra compuesta agregando primero el medio más el 10% de vehículo en los pozos de B a F, y la solución de 100 milimolares en el pozo A. Realice una dilución en serie de cinco pasos, del uno al 10, para obtener las soluciones de trabajo 5x. Para la dosificación, detenga el instrumento RTCA, abra la base para quitar la placa de exposición y coloque la placa en la herramienta de temperatura RTCA para evitar enfriar las celdas, lo que podría afectar la medición de impedancia. Agregue 25 microlitros de solución 5x de la placa maestra de compuesto a las celdas por triplicado, manteniendo el mismo orden de dosificación que en la placa maestra de compuesto.No retire el medio de cultivo celular existente. A continuación, añada 25 microlitros de solución de control positivo 5x a las células de la mitad derecha de la fila inferior, sin eliminar el medio de cultivo existente. Del mismo modo, agregue 25 microlitros de medio a las celdas de la mitad izquierda de la fila inferior.Después de sellar la placa con el sellador de placas, vuelva a colocar la placa en la cuna RTCA y bloquéela. Reinicie la grabación de datos para el tiempo de exposición deseado. Después del registro de datos, analice los datos de viabilidad de la célula RTCA para determinar qué sustancia de prueba utilizar en el análisis de HCS.En este experimento, se seleccionan 1-aminonaftaleno, arsénico, cromo y crotonaldehído para el análisis de HCS. Para ver las células NHBE, agregue 100 microlitros de una suspensión celular a 120.000 células por mililitro a cada pocillo de una placa negra de 96 pocillos. Después de dejar la placa HCS a temperatura ambiente durante 30 minutos, para permitir que las células se adhieran a los pocillos, incube a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante 24, más o menos dos horas, antes de la dosificación.Para el control positivo, dispense 40 microlitros de la solución madre de cada control positivo en la columna dos. Luego, dispense 20 microlitros del vehículo en las columnas tres y cinco. Y 40 microlitros del vehículo en la columna cuatro.Extraiga 12 microlitros de los pocillos de la columna dos, expíndalos a los pocillos de la columna tres y mezcle. Continuar hasta obtener una dilución final en serie con tres dosis y vehículo para cada compuesto de control positivo. Para generar la placa de control positivo, prepare una dilución de uno a 40 en medio de las tres dosis y vehículo.Para hacer la placa maestra compuesta, vuelva a suspender y diluya cada solución madre de la sustancia problema, de una a 10 pulgadas en medio para una concentración de 100 milimolares. Realizar diluciones utilizando medio con un vehículo del 10% para obtener las dosis 5x seleccionadas para cada sustancia problema. Tanto los controles positivos como la placa compuesta ya están listos para ser dosificados sobre la placa de exposición.A continuación, agregue 25 microlitros de soluciones 5x de la placa maestra compuesta a las celdas por triplicado, manteniendo el mismo orden de dosificación que en la placa maestra compuesta. No retire el medio de cultivo celular existente. A continuación, añada 25 microlitros de la solución 5x de la placa de control positivo a las celdas de la fila inferior, manteniendo el mismo orden de dosificación que en la placa de control positivo.Prepare un volumen suficiente de la solución de tinción de células vivas como se describe en el protocolo de texto. A continuación, diluya tanto el colorante de mitocondrias como el colorante de permeabilidad de membrana en la solución de tinción de células vivas, de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Agregue 50 microlitros de la solución de tinción de células vivas a cada pocillo de la placa designada como ensayo de citotoxicidad.No retire el medio de cultivo celular e incube durante 30 minutos a 37 grados centígrados, 5% de CO2. Aspire suavemente el medio y la solución de tinción y agregue 100 microlitros de solución de fijación a cada pocillo. Luego, incube la placa durante 20 minutos a temperatura ambiente, en la oscuridad.Después de la incubación, aspire suavemente la solución de fijación y lave una vez con 100 microlitros por pocillo de tampón de lavado. Retire el tampón de lavado y agregue 100 microlitros por pocillo de tampón de permeabilización 1x a cada pocillo, antes de incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente, en la oscuridad. Aspirar el tampón de permeabilización y lavar la placa dos veces con 100 microlitros, por pocillo, de tampón de lavado.A continuación, aspire el tampón de lavado y añada 100 microlitros de 1x tampón de bloqueo a cada pocillo. Luego, incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente, en la oscuridad. Diluir el anticuerpo anti-citocromo C, de uno a 250, en la solución de anticuerpo primario.A continuación, aspire el tampón de bloqueo y añada 50 microlitros, por pocillo, de solución primaria de anticuerpos a cada pocillo, antes de incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente, en la oscuridad. Diluir el anticuerpo anti-ratón, de uno a 500, en anticuerpo secundario y solución nuclear. Además, diluya el tinte nuclear, de uno a 1, 000, en anticuerpo secundario y solución nuclear.Después de aspirar la solución primaria de anticuerpos, lave la placa tres veces con 100 microlitros, por pocillo, de tampón de lavado, utilizando la arandela de placas. Aspire el tampón de lavado y agregue 50 microlitros, por pocillo, de anticuerpo secundario y solución nuclear a cada pocillo de la placa. Ahora, incuba la placa durante 60 minutos a temperatura ambiente, en la oscuridad.Después de la aspiración del anticuerpo secundario y la solución nuclear, lave la placa tres veces con 100 microlitros de tampón de lavado por pocillo utilizando la arandela de placas. Luego, agregue 100 microlitros, por pocillo, de tampón de lavado. La placa ya está lista para ser evaluada en el instrumento HCS y se inicia la adquisición.Se muestran los resultados representativos de la viabilidad de las células RTCA del tratamiento con la sustancia problema. Se obtiene un efecto tóxico dependiente de la dosis durante 24 horas de exposición solo con 1-aminonaftaleno, arsénico, cromo y crotonaldehído, ya que todos mostraron una DL50 calculada de menos de 20 milimolares. No se obtuvo ningún efecto tóxico con los otros compuestos.Aquí se muestran los resultados representativos de HCS solo para el tratamiento con 1-aminonaftaleno. El efecto tóxico del 1-aminonaftaleno está induciendo un daño severo de la membrana celular, lo que conduce a un aumento de la permeabilidad de la membrana celular de manera dependiente de la dosis, después de cuatro horas de exposición. El compuesto también está afectando a las mitocondrias, induciendo un aumento de masa después de cuatro horas de exposición, junto con la liberación de citocromo C, que luego es detectable en los núcleos después de cuatro y 24 horas de exposición.Una vez dominada, esta técnica se puede ejecutar en dos o tres días, ya que la mayoría de ellos requieren aproximadamente una hora al día de tiempo manual para el ajuste y la dosificación. Dependiendo del protocolo seleccionado, el Cribado de Alto Contenido requiere un máximo de tres horas y media para la ejecución de todo el procedimiento de tinción. Al intentar este procedimiento, tenga en cuenta que, aunque la selección de una gama más amplia de puntos de conexión agrega complejidad al flujo de trabajo, no aumentará sustancialmente el tiempo.De hecho, con un flujo de trabajo óptimo, se pueden evaluar varias placas en paralelo. El desarrollo continuo de la plataforma de cribado de alto contenido, que incluye el ajuste de células totalmente automatizado, la dilución de compuestos, la dosificación y la tinción, y la adición de un nuevo punto final, ampliará aún más la capacidad de la plataforma de cribado de alto contenido como una poderosa herramienta para la elaboración de perfiles toxicológicos. Además, la combinación de múltiples criterios de valoración toxicológicos únicos en un rendimiento tan alto nos llevará un paso más allá en nuestro esfuerzo por reducir las pruebas químicas en animales.

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