Name: En Vivo biosensor Pistas de apoptosis no caspasa actividad en Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Aprende a detectar actividad de caspasas no apoptóticas en Drosophila melanogaster usando el biosensor CaspaseTracker. Este método permite rastrear células sanas con caspasas activas en animales vivos.

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Agradecemos a Polan Santos y Darren Obbard para las ilustraciones de Drosophila en la Fig. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena para el uso del insectario JHMRI. Este trabajo fue apoyado por la beca de la Fundación de Investigación de Ciencias de la Vida (HLT), Comité de Becas de la Universidad de Hong Kong AOE / B-07/99 (MCF), y el NIH subvenciones NS096677, NS037402 y NS083373 (JMH). Ho Lam Tang es una Fundación Shurl y Kay Curci miembro de la Fundación de Investigación de Ciencias de la Vida.

1. Preparación de las moscas CaspaseTracker <ol><li> Para preparar CaspaseTracker (DQVD) vuela de experimentos, realice esta cruz: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-RFP; UAS-FLP; Ubi&gt; Stop&gt; GFP-nls), mediante la transferencia de 7-10 hembra virgen (o macho) las moscas que lleva el sustrato de la caspasa-biosensor mCD8 DIAP1-Gal4 impulsada por el promotor de ubiquitina 35 junto con el mismo número de hombres (o mujeres) moscas G-TRACE, que tienen el segundo cromosoma equilibrador CyO para evitar la letalidad de la combinación homocigótica del G- TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP, y Ubi&gt; Stop&gt; GFP-nls) 34. Lugar vuela en un vial de alimentos frescos con pasta de levadura fresca como fuente de proteínas. </li><li> Incubar los archivos a 18 ° C durante 5 a 7 días (máximo 2 semanas) y luego retire el padre vuela desde el vial para evitar el hacinamiento con la nueva progenie, y la creación de nuevos viales de cría. </li><li> Continuar la incubación a 18 ° C hasta que la progenie vuela eclose. Seleccione la no CyO [no-cURLy ala] progenie del genotipo correcto de CaspaseTracker, que son transgénicos para los elementos CaspaseTracker y G-35 TRACE. </li><li> Al mismo tiempo, generar control parental W118 moscas no transgénicas y la caspasa-insensibles (DQVA) vuela en paralelo para verificar RFP CaspaseTracker específica y la fluorescencia de GFP. </li><li> Realizar el genotipado por PCR para confirmar los archivos con CaspaseTracker utilizando los cebadores: 5&#39;-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3&#39;-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, producir un producto de 3897 pb. Para la genotipificación los loci G-Trace, utilice los siguientes cebadores para GFP (474 ​​pb), 5&#39;-GAC CAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC G, 3&#39;-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GAG GCC GAT AGT C; para la solicitud de propuestas (258 pb), 5&#39;-GGC TGC TTC ATC TAC AAG AAG GTG TTC ATC GG, 3&#39;-GAT GTC GTC CAG CTT GGA CAC GTA GTA GTA GC; y para Flpase (655 pb), 5&#39;-CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3&#39;-CCG TAC TAA CGC TTG TTG TCT TCT CTG TCA C. Para la genotipificación de Gal4 en el vector pUWR (554 pb), 5&#39;-GAA GCA CAC CTT CGC ATC TCG CAGTCA CGC, 3&#39;-TGG AAT TGG GGT ACG TCT AGA. </li></ol> 2. Preparación del tejido, tinción y montaje <ol><li> Para las disecciones de moscas, evitar que los tejidos disecados se peguen a las puntas de pipeta de plástico y tubos de centrífuga, puntas de la capa y tubos con albúmina de suero bovino al 1% (BSA) disueltos en agua. </li><li> Dissect vuela sobre un cojín de silicona con fórceps. <ol><li> Para evitar daños en la punta de pinzas sobre una superficie dura cuando se realiza la disección del tejido, realice la disección en una superficie de silicio. Para la fabricación de placas de disección de silicona, fundir el silicio en el kit comercial de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Lista de Materiales). Después de fundir la silicona, añadir de 3 a 4 ml a una placa de cultivo tisular de diámetro 60 mm. platos de silicio pueden ser reutilizados. </li><li> Anestesiar a una mosca con CO 2, y la transfiere a una placa de silicona con 1 ml de PBS frío. Introducir el CO 2 a un vial que contiene la marcha usando una pistola de aire, y luego transferir la mosca t anestesiadasOA cojín que tiene un suministro de CO2. </li><li> Use un par de pinzas para sujetar la cabeza de la mosca, y un segundo par de pinzas para tirar del tórax en la dirección opuesta para desconectar la cabeza mosca del cuerpo que cubre sin dañar la conexión entre la cabeza y el intestino anterior. </li><li> Use 2 pares de pinzas para quitar las alas y las patas del tórax. </li><li> Use un par de pinzas para sostener el tórax, y otro par de pinzas para tirar del abdomen para separarlo del tórax de nuevo sin dañar la conexión entre el intestino anterior y del intestino medio. </li><li> Diseccionar los órganos internos, incluyendo cerebro, intestino, tubos de Malpighi y los ovarios como se ha demostrado anteriormente. 39-41 </li><li> Retire todas las piezas de la cutícula y los cuerpos grasos con unas pinzas, ya que estos tejidos producen fuertes autofluorescencia. La paciencia y la práctica se requieren para preparar un sistema de órgano completo, como se muestra. </li></ol></li><li> Transferir los tejidos disecados a 1,5 mL tubos de centrífuga, y fijar tejidos wiTH 0,5 ml de paraformaldehído al 4% en PBS (solución salina tamponada con fosfato) a TA durante 20 a 30 minutos con rotación en la oscuridad para evitar RFP blanqueo y GFP en los tejidos. Evitar la fijación prolongada que puede comprometer los resultados de tinción posteriores. </li><li> Retire el paraformaldehído por pipeteo suave y lavar 3 veces con 0,5 ml de PBST (PBS + 0,1% de Triton X-100) a TA. </li><li> Permeabilizar los tejidos con 0,5 ml de PBST a 4 ° C durante la noche con agitación suave. incubaciones cortas pueden causar permeabilización y el compromiso de tinción resultados incompletos. <ol><li> Si es necesario para reducir la tinción de fondo, considere la incubación de los tejidos en 0,5 ml de PBST con 1% de BSA, en lugar de PBS. </li></ol></li><li> Lavar los tejidos 3 veces con 0,5 ml de PBST. </li><li> Para la tinción de los núcleos y la actina filamentosa (F-actina), aplicar 0,5 ml de PBST con 10 mg / ml de Hoechst 33342 tinte nuclear azul y 0,3 M Alexa Fluor mancha 633 faloidina F-actina y se incuba de forma simultánea con los tejidos durante 1 h a TA wITH rotación suave en la oscuridad. Evitar las manchas prolongado ya que esto aumentará el fondo. <ol><li> Para la inmunotinción, incubar fija y permeabilizadas tejidos con 0,1% Triton X-100 en 0,5 ml de PBS durante la noche a 4 ° C, tinción con dilución 1: 100 de anticuerpo anti-ELAV o con dilución 1: 200 de anti-caspasa-3 durante la noche a 4 ° C (300 l). Siga por el correspondiente anticuerpo secundario diluido 1: 100 y se incuba durante 1-3 h a TA. Ver Lista de Materiales para obtener información anticuerpo específico. </li></ol></li><li> Lavar los tejidos 3 veces, cada una durante 5 minutos en 0,5 ml de PBST con rotación suave. </li><li> Con una pipeta, retire todo el PBST, y luego añadir 200 l anti-blanqueador de un medio de montaje (ver materiales) para cubrir completamente los tejidos durante 1-3 horas a temperatura ambiente, o 4 ° C durante la noche. tejidos óptimas que han absorbido plenamente el agente de montaje se hundirá hasta el fondo del tubo. </li><li> Pre-limpiar el portaobjetos de vidrio con agua o etanol al 70% y transferir los tejidos con el agente de montaje a los glass de diapositivas. </li><li> Con cuidado, coloque una hoja de cubierta de vidrio sobre los tejidos. Aplique vaselina en el portaobjetos de vidrio y la hoja de la cubierta para evitar la destrucción del tejido por compresión excesiva. Eliminar los agentes de montaje adicional con papel de seda. </li><li> Sellar la hoja de la cubierta mediante la aplicación de esmalte de uñas a lo largo de los bordes de la hoja de la cubierta para evitar la fuga de agentes de montaje de los tejidos. </li></ol> 3. Microscopía Confocal <ol><li> Utilizar un microscopio de epi-fluorescencia confocal invertido. Sin embargo, microscopios arriba-derecha también se pueden utilizar. Para tejidos de imagen utilizando suelo de baldosas, mantener estable a temperatura ambiente para evitar la deriva de enfoque y el desplazamiento de plano xy debido a la expansión y contracción térmica de los componentes. sistemas de control ambiental y sistemas de compensación de deriva enfoque ayudan a evitar este problema debido a la pérdida de termo-equilibrio del sistema de microscopio. </li><li> Colocar el portaobjetos en la platina del microscopio. Tome algunas imágenes de prueba usando baja resolución (125 x 125 píxeles) de unad determinar el número adecuado de azulejos necesarios para cubrir toda la región de interés (ROI). </li><li> Establecer el sistema de barrido microscopio para capturar imágenes con una resolución de escaneo tales como 500 x 500 píxeles. Seleccione el objetivo tales como 20X NA 0,8 o un 1,4 NA objetivo 63X Plan-Apocromático para el análisis de tejidos a través de cubreobjetos de vidrio, de manera que cada una de las imágenes (azulejos) se solapa en un 20% en todos los lados. </li><li> Establecer la secuencia de imágenes de largo al más corto longitudes de onda de excitación, como la luz de longitud de onda larga provoca menor de foto-blanqueo. La secuencia del más largo al más corto de longitud de onda de excitación es de: (i) 633 nm para faloidina F-actina y para el anticuerpo a caspasas activadas, (ii) 561 nm para RFP, (iii) 488 nm para GFP, y (iv) 405 nm para Hoechst tinción nuclear. </li><li> Durante estas pruebas, minimizar la exposición de las células a excitación láser fluorescente durante el proceso de obtención de imágenes para evitar la foto-blanqueo mediante la reducción de la intensidad del láser para obtener imágenes de alta calidad de los tejidos. </li><li> Despues de que yomagos se recogen, fusionar las imágenes utilizando el software de microscopio. </li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

A continuación se ilustra la construcción y el funcionamiento interno de CaspaseTracker que facilitan la detección de la actividad de caspasa basal generalizada en los tejidos sanos. Los pasos críticos para la detección de la actividad de caspasa no apoptótica in vivo son: 1) la generación de moscas con el transgén biosensor, 2) verificar la función reportero-caspasa específico con controles apropiados, 3) la práctica de técnicas de disección para observar todos los sistemas de órganos internos de adulto Dr...

Las caspasas son proteasas de cisteína que median la muerte celular por apoptosis mediante la escisión de muchas proteínas intracelulares después de residuos de aspartato clave. Por ejemplo, caspasas iniciadoras activan las caspasas efectoras, nucleasas de ADN derepress, componentes del citoesqueleto escinden y alteran la composición de lípidos de las membranas celulares para desmantelar rápidamente las células y estimular su reconocimiento y la inmersión por las células que disponen de los cadáveres célula vecina. 1-4 Se estima que miles de millones de células mueren por día en el cuerpo humano, y la apoptosis es un mecanismo importante de la muerte de células tumorales inducida por la quimioterapia. 5 un conjunto diferente de las caspasas puede causar la muerte celular por procesos no apoptóticas distintas para estimular la inmunidad innata. 6 por lo tanto, mayoría de las investigaciones sobre las caspasas se ha centrado en sus funciones a favor de la muerte. Curiosamente, las primeras pruebas en el campo reveló que los mismos caspasas responsables de promover la muerte de las células también tienen no la muerte funciones. Estudios pioneros han demostrado que las caspasas están implicadas en diversas funciones celulares en las células sanas, incluyendo la regulación de la proliferación celular y la migración durante la embriogénesis. 7-9 se requieren caspasas para la individualización spermatid en Drosophila 10,11, para el bloqueo de una vía de la muerte celular necroptotic alternativa en ratones 12,13, y para el procesamiento de microARN en C. . elegans 14,15 En quizás los más longevos células, las neuronas, las caspasas y otra maquinaria apoptótica están implicados en la regulación de la actividad neuronal mediante la poda de terminaciones sinápticas, un proceso que se cree que es esencial para el fortalecimiento de otras sinapsis para el aprendizaje y la memoria 16-. 18 es posible que las caspasas facilitar la poda sináptica por un tipo de mini-apoptosis de las proyecciones neuronales diminutas sin muerte de células enteras. 19 sin embargo, las caspasas pueden tener funciones alternativas no relacionadas con eventos de apoptosis similares. 20,21 papel Duals en la vida y la muerte no son exclusivos de las caspasas; BCL-2 y proteínas de la familia del citocromo c tienen papeles en la energética celular en las células sanas, pero también son parte de la ruta apoptótica núcleo que se activa por muchos tipos de estrés celular. 22-25 Aunque no está comprobado, parece lógico que la evolución ha vinculado día -Jobs hasta la muerte, puestos de trabajo en las mismas moléculas para asegurar la eliminación oportuna de las células no aptas o no deseables. En la actualidad, los mecanismos moleculares de la actividad de caspasa no apoptótico no se entienden, y el grado de actividad de la caspasa no apoptótico durante el desarrollo embrionario y en los tejidos adultos también no se conoce. Un reto importante es la dificultad de distinguir día-trabajos desde death-puestos de trabajo de las caspasas. En contraste con la apoptosis y pyroptosis, cuando la actividad de caspasa se amplifica por una cascada proteolítica, se espera que los trabajos diurnos de las caspasas se produzca a niveles mucho más bajos de actividad enzimática, probablemente por debajo de la detección por muchos tecn disponiblesgías. Antes del trabajo presentado aquí, otros desarrollaron una variedad de biosensores de caspasa para diferentes propósitos. Los biosensores de SCAT (por ejemplo, ECFP-DEVD-Venus) detectar rápidamente la actividad de caspasa en tiempo real en células cultivadas y tejidos animales utilizando FRET. 26,27 Tras la escisión de la caspasa, la fracción GFP dirigido al núcleo de Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) sufre relocalización subcelular dentro de minutos cuando su membrana de sujeción plasma es escindido por las caspasas. 28 del mismo modo, ApoAlert-pCaspase3-sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) relocaliza desde el citosol al núcleo tras la escisión de la caspasa. 29,30 Más recientemente, el cromóforo en iCasper fue diseñado inteligentemente a emitir fluorescencia cuando se escinde por caspasas, lo que permite la detección de la actividad de biosensor en tiempo real en las neuronas de embriones de Drosophila, pero principalmente en asociación con la muerte celular de desarrollo. muerte 31 dependiente de caspasa de las neuronas olfativas durante el envejecimiento estaba demonstclasificado por inmuno-detección de la forma de la caspasa-escindido de biosensores CPV (por ejemplo, mCD8-PARP-Venus). 32,33 Es importante destacar que, se detectó la forma activada de la caspasa-3 en ausencia de muerte celular por inmunotinción sensible en espinas de neuronas cultivadas, y en el soma usando la fluorescencia dependiente de caspasa del colorante indicador CellEvent nuclear, pero se encontraron dificultades debido a la foto-toxicidad, aunque la muerte celular se retrasa hasta después de la eliminación columna vertebral. 19 por lo tanto, se necesitan nuevos biosensores caspasas para detectar y realizar un seguimiento de las células con actividad de caspasa basal in vivo. Para superar estas dificultades, hemos generado un nuevo biosensor de color caspasa doble, designado CaspaseTracker. Esta estrategia combina una versión modificada del biosensor Apoliner Drosophila caspasa-sensible 28 con el sistema FRT recombinasa Drosophila G-TRACE 34 para etiquetar y rastrear células en vivo de forma permanente. &lt;sup&gt; 35 El sistema G-TRACE activado-Gal4 permite que los niveles muy bajos de caspasas para activar CaspaseTracker, lo que resulta en la expresión de RFP en el citoplasma y la expresión de GFP dirigido al núcleo permanente en cualquier célula que nunca ha experimentado la actividad de caspasa. 35 Este sistema puede etiquetar las células durante toda la vida en animales enteros utilizando Drosophila melanogaster, un sistema modelo tratable y ampliamente utilizado para el estudio de las caspasas y la muerte celular. 36-38

<table><tbody><tr><td colspan="4">Consumibles y reactivos</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Products</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de</td> medio de montaje <td>Ted Pella</td><td>#505 (110mm, #5)</td><td>Pinza Dumont grado de biología, acero inoxidable</td></tr><tr><td>Portaobjetos colgantes</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565B</td><td>Portaobjetos de vidrio</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sondas moleculares</td><td>Tinción de ADN H1399</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633</td><td>Sondas moleculares de</td> faloidina <td>A22284</td><td>Tinción de actina</td></tr><tr><td>Rat-Elav-7E8A10 anticuerpo anti-elav</td><td>Estudios del desarrollo Banco de hibridomas (DSHB)ID del</td> <td>registro de anticuerpos:&nbsp; AB_528218&nbsp;</td><td>Tinción para Drosophla pan-neuronal ELAV</td></tr><tr><td>Anticuerpo de caspasa-3 (Asp175) escindido</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>#9661</td><td>Tinción para fragmento activo de caspasa-3</td></tr><tr><td>ProLong Gold reactivo antidecoloración</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td>para preservar fluoróforos&nbsp;</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant Life</td><td>Technologies</td><td>P36961</td><td>para preservar los fluoróforos&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de elastómero de silicona SylGard 182</td><td>Dow Corning&nbsp;</td><td>Código de producto: 0001023934</td><td>para placas de</td></tr><tr> disección<td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>LSM780 microscopio confocal</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Drosophila disección</td></tr><tr><td>AmScope Fiber Optic Dual Swanneck Microscope Illuminator, 150&nbsp; W</td><td>AmScope</td><td>WBM99316</td><td>Fuente de luz</td></tr></tbody></table>

en vivo biosensor pistas de apoptosis no caspasa actividad en drosophila

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Las caspasas son los mediadores clave de la muerte celular apoptótica a través de su actividad proteolítica. Cuando las caspasas se activan en las células a niveles detectables por las tecnologías disponibles, generalmente se supone que la apoptosis ocurre poco después. Las caspasas pueden escindir muchos componentes funcionales y estructurales para causar una destrucción celular rápida y completa en unos pocos minutos. Sin embargo, la evidencia acumulada indica que en las células sanas normales las mismas caspasas tienen otras funciones, presumiblemente a niveles enzimáticos más bajos. Los estudios de la actividad de las caspasas no apoptóticas se han visto obstaculizados por las dificultades para detectar niveles bajos de actividad de las caspasas y para rastrear el destino final de las células in vivo. Aquí, ilustramos el uso de un indicador de caspasa ultrasensible, CaspaseTracker, que etiqueta permanentemente las células que han experimentado actividad de caspasa en animales enteros. Este biosensor CaspasaTracker de doble color in vivo para Drosophila melanogaster expresa transitoriamente la proteína fluorescente roja (RFP) para indicar la actividad reciente o en curso de la caspasa, y expresa permanentemente la proteína fluorescente verde (GFP) en células que han experimentado actividad de caspasa en cualquier momento en el pasado pero que no murieron. Es importante destacar que este biosensor in vivo dependiente de caspasas revela fácilmente la presencia de actividad de caspasas no apoptóticas en los tejidos de los sistemas de órganos de toda la mosca adulta. Esto se demuestra utilizando disecciones de montura completa de moscas individuales para detectar la actividad de los biosensores en células sanas en todo el cerebro, el intestino, los túbulos de Malpighi, el cardias, los conductos ováricos y otros tejidos. CaspasaTracker detecta la actividad de las caspasas no apoptóticas en las células de larga vida, ya que la actividad de los biosensores se detecta en las neuronas adultas y en otros tejidos al menos 10 días después de la activación de las caspasas. Este biosensor sirve como una herramienta importante para descubrir las funciones y los mecanismos moleculares de la actividad de las caspasas no apoptóticas en animales vivos.

Existen dos componentes clave que permiten CaspaseTracker para detectar la actividad de la caspasa en las células sanas normales (Figura 1A). El primero de ellos es un polipéptido de la caspasa-escindible 146 amino ácido el modelo de la caspasa biosensor Apoliner (Figura 1b). 28 Este polipéptido se deriva de DIAP1 (inhibidor de Drosophila de apoptosis) que contiene un único sitio de la caspasa natural que se escinde durante la apoptos...

Para detectar las células sanas en animales enteros que contienen niveles bajos de actividad caspasa, el biosensor altamente sensible designado CaspaseTracker se generó para Drosophila. se detecta actividad biosensor dependiente de caspasa en las células sanas de larga vida a través de los órganos internos de los animales adultos criados en condiciones optimizadas en ausencia de estímulos de muerte.

En Vivo biosensor Pistas de apoptosis no caspasa actividad en Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

El objetivo general de este experimento es detectar y rastrear la actividad de caspasas no apoptóticas en animales vivos utilizando Drosophila Melanogaster como modelo. Las caspasas son proteasas que escinden muchos componentes celulares para provocar la muerte celular apoptótica. Por lo tanto, la presencia de caspasas activas en las células a menudo se interpreta como un indicio de muerte celular inminente.Sin embargo, hay evidencia creciente que indica que las mismas caspasas que causan la muerte celular también tienen funciones normales en células sanas. Y estas funciones diarias de las caspasas incluyen la regulación de la actividad neuronal, funciones mitocondriales e incluso la supresión de vías alternativas de muerte celular. Existen dos dificultades principales para estudiar las funciones diarias de las caspasas.Primero, los niveles basales normales de actividad de caspasa suelen estar por debajo de los límites de detección de las tecnologías disponibles. Y segundo, incluso cuando la actividad basal de caspasa es detectable, es difícil distinguirla de la actividad de caspasa que conducirá a la muerte celular en un futuro próximo. Para resolver este problema, desarrollamos un rastreador de caspasa: un biosensor de caspasa más sensible que puede marcar de forma permanente las células que han sobrevivido a la activación de caspasa.Este biosensor nos permitirá detectar y rastrear las células con actividades de caspasa no apoptóticas y estudiar sus funciones en animales vivos. El sistema biosensor de rastreo de caspasas en *Drosophila* en vivo consta de dos componentes: el transcriptor de levadura Gal4 activable por caspasa y el reportero fluorescente activado por Gal4 conocido como G-Trace.Se cruzan moscas con biosensores de caspasa con moscas G-Trace para generar moscas CaspaseTracker que informan de la actividad de la caspasa mediante fluorescencia roja y verde. La actividad de la caspasa se detecta en las moscas descendientes cuando el biosensor es escindido por caspasas activas en la secuencia DQVD, liberando Gal4 de la membrana plasmática. Gal4 liberado se transloca al núcleo e induce la expresión de la proteína fluorescente roja, RFP, hasta que las caspasas dejan de estar activas.Sin embargo, Gal4 también induce la expresión de la recombinasa FLP, lo que lleva a una expresión continua de GFP dirigida al núcleo durante toda la vida de la célula. Un biosensor de control presenta una mutación, DQVA, en el sitio de escisión por caspasa. Para comenzar, cruce moscas transgénicas que portan el biosensor sensible a caspasa Gal4 con moscas que portan el reportero fluorescente G-Trace.Aparee siete a 10 hembras vírgenes del biosensor con siete a 10 machos recién emergidos de las moscas G-Trace en un vial con alimento fresco. Un control negativo importante es la versión insensible a caspasa de este biosensor, que presenta una mutación puntual única en el residuo de aspartato necesario para la escisión por caspasa. Utilice el mismo procedimiento de apareamiento para estas moscas de control.Después de establecer los cruces, mantenga los viales a 18 grados Celsius. Cuando las larvas estén desarrollándose y antes de que emergan nuevas moscas descendientes, transfiera las moscas parentales a viales nuevos para continuar produciendo nueva descendencia. Cuando las moscas descendientes emergen, recolecte aquellas con alas rectas, no rizadas.Este fenotipo indica que estas moscas portan transgenes para el biosensor de caspasa y para el reportero fluorescente G-Trace. A continuación, siguiendo protocolos establecidos, diseccionar las moscas para aislar tejidos blandos internos intactos tanto de las moscas con el rastreador de caspasa como de las moscas de control. Para comenzar, preparar puntas de pipeta y tubos de centrífuga que no se adhieran a los tejidos diseccionados.Para hacer esto, recubra las puntas y los tubos con albúmina de suero bovino al uno por ciento disuelta en agua. Para fijar los tejidos diseccionados, cargue los tubos transparentes recubiertos con punto cinco mililitros de paraformaldehído fresco al cuatro por ciento en PBS y transfiera los tejidos recién diseccionados a estos tubos. A continuación, coloque los tejidos a temperatura ambiente en la oscuridad para evitar la fotodegradación e incube durante 20 a 30 minutos con rotación suave para bañar los tejidos con el fijador evitando dañarlos.Las fijaciones más largas pueden provocar una tinción subóptima de los tejidos. Para eliminar el paraformaldehído e iniciar la permeabilización de membrana de los tejidos fijados, retire suavemente la solución de paraformaldehído con una punta de pipeta recubierta y lave los tejidos tres veces con 0,5 mL de PBST. Para completar la permeabilización de los tejidos y bloquear la unión no específica en los procedimientos posteriores de tinción, incube los tejidos en 0,5 mL de PBST que contenga 1% de BSA a 4 °C durante la noche en la oscuridad con rotación suave.Al día siguiente, elimine la solución de PBST con BSA lavando los tejidos permeabilizados tres veces con punto cinco mililitros de PBST. Para ayudar a visualizar diferentes estructuras tisulares, realice una tinción conjunta del ADN nuclear y la F-actina citoplasmática incubando los tejidos preparados en punto cinco mililitros de PBST que contienen el colorante nuclear azul Hoechst 33342 y la fijación de F-actina con Alexafluor 633 por una hora a temperatura ambiente con rotación suave. Elimine el exceso de colorante lavando los tejidos tres veces con punto tres mililitros de PBST.Incubar cada lavado durante cinco minutos a temperatura ambiente con rotación suave. Eliminar cuidadosamente todo el medio de los tejidos en el tubo mediante una punta de pipeta fina. Para preservar la señal fluorescente durante la imagen, añadir 200 microlitros de agente de montaje anti-fade que cubra completamente los tejidos.Incube los tejidos de una a tres horas a temperatura ambiente, o durante la noche a cuatro grados Celsius. Óptimamente, los tejidos que hayan absorbido completamente el medio de montaje se hundirán hasta el fondo del tubo. Antes de montar los tejidos, limpie el portaobjetos con agua o etanol al 70 %.Aplique vaselina al portaobjetos de vidrio y al cubreobjetos para evitar destruir los tejidos por excesiva compresión. Luego, transfiera los tejidos con el medio de montaje al portaobjetos de vidrio. Retire cualquier medio de montaje sobrante utilizando papel de tejido.Finalmente, selle el cubreobjetos aplicando esmalte de uñas a lo largo de todos los bordes. Para comenzar, coloque el portaobjetos en la platina de un microscopio invertido y capture imágenes de las células utilizando un objetivo Plan-Apocromático de 20x con una apertura de punto ocho.Tome algunas imágenes de prueba a baja resolución para verificar un plan de teselado de imagen que cubra la región de interés, que en este caso es el sistema completo de órganos internos de la mosca. Configure la secuencia de imágenes comenzando con la longitud de onda de excitación más larga y finalizando con la longitud de onda de excitación más corta. Esto minimizará el fotodesvanecimiento, que aumenta a longitudes de onda más cortas.Luego, tome imágenes con una resolución adecuadamente alta. Cada imagen debe superponerse un 10% con la siguiente para lograr un mosaico exitoso. Recolecte de dos a ocho escaneos de imagen por mosaico para reducir el ruido de fondo.Para eliminar la sombra entre los mosaicos de imagen provocada por el contraste de interferencia diferencial (DIC), tome una imagen de referencia DIC en una región vacía. Luego, realice la corrección de sombra en la imagen de mosaico utilizando la imagen de referencia DIC. Este es un mosquito caspasa marcador recién eclosionado diseccionado, que muestra las piezas bucales, el foregut, el buche, el intestino medio, el intestino posterior, el ano, el oviducto y los ovarios.Mediante microscopía confocal, la actividad de caspasa se visualiza como fluorescencia de RFP, que indica actividad reciente de caspasa, y como fluorescencia de GFP, que indica actividad pasada de caspasa. Imágenes ampliadas revelan la actividad del biosensor RFP y GFP en el lóbulo óptico, la cárdia, el intestino medio, el intestino posterior y el oviducto. Células específicas a lo largo de los túbulos de Malpighian muestran prominentemente tanto RFP como GFP, lo que indica actividad persistente de caspasa.En contraste, no se expresó actividad del biosensor RFP ni GFP en las cámaras ovulares, aunque el biosensor se expresó en células musculares entre las cámaras ovulares según tinción simultánea con tinte de F-actina. Sin embargo, las células de las cámaras ovulares son capaces de activar caspasas si las moscas se tratan con un estímulo de muerte celular, como ayuno o choque por frío, lo que provoca la destrucción nuclear y una activación masiva de caspasas según inmunotinción. Es probable que el rastreador de caspasas aparezca temprano y posteriormente sea destruido durante la muerte celular.En el lóbulo óptico del cerebro de mosca portador del sensor de caspasa sano, se detecta actividad del biosensor en células sanas que parecen ser neuronas, según la costinción con un marcador pan-neuronal, el anticuerpo anti-ELAVI. Esto sugiere un papel para la actividad de caspasa no apoptótica en las neuronas. Otras estrategias pueden utilizarse para demostrar la supervivencia a largo plazo de células con actividad de caspasa, como apagar la expresión del biosensor mediante herramientas genéticas.Por ejemplo, GalADTS que inhibe Gal4. El rastreador de caspasa informa específicamente de la actividad de la caspasa, mientras que el biosensor de control no escindible, DQVA, no se activa. La única señal en los controles se debe a la autofluorescencia del exoesqueleto residual en la pieza bucal y el ano, y de la comida ingerida, levadura, en la molleja y el estómago cardíaco.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar el biosensor rastreador de caspasas para seguir la actividad de caspasas no apoptóticas en moscas de la fruta. Al intentar este procedimiento, es importante incluir controles negativos para distinguir las señales del biosensor de caspasas de la autofluorescencia. Por ejemplo, la cutícula y los cuerpos grasos producen una autofluorescencia intensa en moscas con o sin el biosensor.La versión actual del biosensor rastreador de caspasas está diseñada para detectar la caspasa activa DRICE. Otras aplicaciones podrían incluir biosensores específicos para diferentes caspasas, reemplazando el sitio de escisión reconocido por DRICE con el sitio de escisión reconocido por otras caspasas.

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Aquí se describe un método eficaz para estudiar la dinámica de aclaramiento celular...

Imágenes de Apoptotic Liquidación de células vivas durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogénesis

La epidermis de embriones de fase muy tardía embriones de Drosophila ofrece un sistema in vivo para el análisis de la respuesta herida de punción rápida y se pueden combinar con las manipulaciones genéticas o tratamientos químicos de microinyección para avanzar los estudios en la curación de heridas para la traducción en modelos de mamíferos.

Microinyección de Heridas Ensayo y<em&gt; In vivo</em&gt; Localización de la herida epidérmica Reporteros de respuesta en<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriones.

Ciertas perturbaciones genéticas o la exposición a toxinas pueden interrumpir los procesos normales de desarrollo y provocar la muerte de tipos específicos de células. El análisis de la caspasa 3 activada por inmunofluorescencia de montaje completo en embriones de pez cebra revela la localización específica de la etapa y el tejido de las células que experimentan específicamente la apoptosis.

Análisis de la apoptosis en embriones de pez cebra en Todo el montaje de inmunofluorescencia para detectar la caspasa 3 activada

El término anástasis se refiere al fenómeno en el que las células moribundas revierten un proceso de suicidio celular en una etapa tardía, se reparan a sí mismas y, finalmente, sobreviven. Aquí demostramos protocolos para detectar y rastrear células que se someten a anastasis.

Estrategias para Anastasis Seguimiento, una célula de supervivencia Fenómeno que Invierte Apoptosis

Anastasis es técnicamente difícil de detectar en vivo porque las células que se han invertido el proceso de muerte celular pueden ser morfológicamente indistinguibles de las células sanas normales. Aquí se describen los protocolos para la detección y seguimiento de las células que se someten a la anastasis en animales vivos mediante nuestro sistema de biosensor desarrollado recientemente en vivo CaspaseTracker.

Detección de Anastasis en Vivo por CaspaseTracker Biosensor

En el presente documento se describe un ensayo de fagocitosis utilizando las células embrionarias dispersas de Drosophila . Nos permite cuantificar con facilidad y precisión los niveles de fagocitosis in vivo , e identificar nuevas moléculas necesarias para la fagocitosis de las células apoptóticas.

Ensayo de Fagocitosis para Células Apoptóticas en Drosophila Embriones

Aquí ilustramos cómo sola molécula de microscopía de localización foto-activado puede llevarse a cabo en la terminal del nervio motor de un vivo Drosophila melanogaster tercer instar de la larva.

En Vivo Una sola molécula de seguimiento en la Terminal presináptica del nervio Motor del Drosophila

Este protocolo describe caspasa complementación Bimolecular de la fluorescencia (centro); un método basado en la proyección de imagen que se puede utilizar para visualizar la proximidad inducida de las caspasas de iniciador, que es el primer paso para su activación.

Iluminación de las vías para la activación de caspasas mediante complementación Bimolecular de la fluorescencia

Aquí presentamos un protocolo para la reparación de herida de imágenes en vivo y la respuesta inflamatoria asociada a alta resolución espacio-temporal en vivo. Este método utiliza la etapa pupal de Drosophila desarrollo para permitir la proyección de imagen a largo plazo y seguimiento de poblaciones celulares específicas en el tiempo y es compatible con la inactivación del gene de RNAi-mediada eficiente.

Seguimiento en Vivo a largo plazo de la dinámica de la célula inflamatoria dentro de pupas de Drosophila

Aquí presentamos un protocolo para expresar y purificar las caspasas recombinantes de Drosophila Dronc y Drice, y su uso en ensayos de escisión in vitro .

In vitro Ensayos de escisión utilizando Caspasas de Drosophila recombinantes purificadas para cribado de sustrato

Aprende a detectar actividad de caspasas no apoptóticas en Drosophila melanogaster usando el biosensor CaspaseTracker. Este método permite rastrear células sanas con caspasas activas en animales vivos.

En Vivo biosensor Pistas de apoptosis no caspasa actividad en Drosophila

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