Multicolor detección por fluorescencia de la gotita de microfluídica el uso de fibras ópticas

El objetivo general de este procedimiento es demostrar una aplicación sencilla de la detección de fluorescencia de microfluídica de gotas utilizando fibras ópticas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el cribado biológico de alto rendimiento, como la identificación de fenotipos raros y la evolución dirigida de las enzimas. La principal ventaja de esta técnica es que permite una aplicación sencilla y económica de la detección de fluorescencia en la microfluídica de gotas.

Para comenzar, coloque una oblea de silicona de tres pulgadas de diámetro prelimpia en el mandril de vacío de un recubridor giratorio. Luego, aplique un mililitro de SU-8 3050 en el centro de la oblea y gire la oblea para proporcionar una capa de fotorresistencia de 80 micrómetros de grosor. Retire la oblea recubierta del recubridor giratorio y colóquela en una placa calefactora precalentada a 135 grados centígrados.

Después de 30 minutos, retire la oblea y deje que se enfríe hasta la temperatura ambiente. A continuación, coloque la oblea sobre una superficie plana y alinee la máscara de la primera capa con la oblea. Exponga la oblea bajo un LED colimado de 190 milivatios y 365 nanómetros durante tres minutos.

Después de la exposición, coloque la oblea en una placa calefactora de 135 grados centígrados durante un minuto y luego deje que se enfríe a temperatura ambiente. Una vez que se enfríe, vuelva a colocar la oblea en el recubridor giratorio y péguela al mandril. Aplique un mililitro adicional de SU-8 3050 en el centro de la oblea y centrifugue durante 20 segundos a 500 r.p.m.

seguido de 30 segundos a 5.000 r.p.m. A continuación, hornee la oblea en una placa caliente. Deje que se enfríe a temperatura ambiente y luego vuelva a colocarlo en la superficie de alineación de la mascarilla.

Utilice el ámbito de disección para alinear manualmente la máscara de la segunda capa con las marcas de alineación con patrón de la oblea. Una vez alineada correctamente, exponga la oblea recubierta durante 4-1/2 minutos utilizando las mismas condiciones que antes. Después de la exposición, coloque la oblea en una placa calefactora a 135 grados centígrados durante un minuto, luego enfríe la oblea y vuelva a colocarla en el recubridor giratorio.

Aplique un mililitro de SU-8 3050 a la oblea por tercera vez y gire para agregar 100 micrómetros adicionales de fotorresistencia. Retire la oblea y hornee en una placa calefactora a 135 grados centígrados durante 30 minutos. Luego, enfríelo a temperatura ambiente y colóquelo sobre la superficie de alineación.

Alinee la máscara de la tercera capa con la geometría anterior y exponga la oblea recubierta utilizando las condiciones anteriores durante nueve minutos. Después de la exposición, coloque la oblea en una placa calefactora de 135 grados centígrados durante un minuto y luego enfríela a temperatura ambiente. Una vez frías, desarrolle las mascarillas sumergiendo la oblea en un baño agitado de revelador durante 30 minutos.

Finalmente, lave la oblea en isopropanol y luego hornee por última vez durante un minuto en una placa calefactora a 135 grados centígrados. Guarde el maestro desarrollado en una placa de Petri de 100 milímetros hasta el moldeo. Prepare una mezcla 10:1 de PDMS combinando 50 gramos de base de silicona con cinco gramos de agente de curado en un vaso de plástico.

Mezcle el contenido con una herramienta rotativa y luego desgasifique la mezcla dentro del desecador durante 30 minutos, o hasta que se eliminen todas las burbujas de aire. Vierta el PDMS desgasificado sobre el maestro preparado para dar un grosor de tres milímetros. Luego, vuelva a colocar la placa de Petri en el desecador para una mayor desgasificación.

Una vez que se hayan eliminado todas las burbujas, hornee el dispositivo a 80 grados centígrados durante 80 minutos. Una vez enfriado, corte el dispositivo del molde con un bisturí para que las telegeometrías de 120 micrómetros y 220 micrómetros sean accesibles desde el lateral del dispositivo. A continuación, perfore las entradas y salidas fluídicas con un punzón de biopsia de 0,75 mm.

Trate el dispositivo con el lado de la función hacia arriba junto con un portaobjetos de vidrio prelimpiado y plasma de oxígeno de 1 milibar durante 20 segundos en un limpiador de plasma de 300 vatios. Adhiera el dispositivo colocando firmemente el lado estampado del dispositivo PDMS en el lado tratado con plasma del portaobjetos de vidrio. Luego, coloque el dispositivo en un horno de 80 grados centígrados y vuelva a ensamblar el dispositivo durante 40 minutos.

Una vez horneado, use una jeringa para enjuagar el dispositivo con un fluido de tratamiento de superficie fluorado para hacer que los canales sean hidrofóbicos. Luego, hornee inmediatamente el dispositivo a 80 grados centígrados durante 10 minutos para evaporar el solvente. Prepare dos fibras de excitación láser quitando el aislamiento de los últimos cinco milímetros de las fibras ópticas.

Además, prepare la fibra para recoger la señal fluorescente quitando el aislamiento de los últimos cinco milímetros de una fibra óptica más grande. Inspeccione las puntas de todas las fibras bajo un microscopio. Si las puntas no terminan en una superficie plana, vuelva a atar los extremos con un trazador de fibra.

A continuación, conecte un acoplador de fibra láser a un láser de 50 milivatios y 405 nanómetros y conecte una de las fibras del núcleo de 105 micrómetros al láser. Dirija el extremo pelado del sensor de un medidor de potencia láser y utilice los ajustes finos del acoplador láser para maximizar la potencia del láser. Realice el mismo proceso para sintonizar la otra fibra utilizando un láser de 50 milivatios y 473 nanómetros.

A continuación, monte un filtro de paso de banda cuádruple en el tubo fotomultiplicador utilizando tubos de lente para bloquear la luz láser y transmitir la fluorescencia emitida. Conecte un acoplador de fibra para que la luz viaje a través de los filtros antes de golpear el tubo fotomultiplicador. A continuación, conecte la fibra colectora al acoplador de fibra.

Coloque el chip microfluídico fabricado en la platina de un microscopio invertido junto con una cámara digital capaz de alcanzar velocidades de obturación de al menos 100 microsegundos. Trabajando cuidadosamente desde los lados, inserte la fibra acoplada al láser de 473 nanómetros en el canal de 120 micrómetros más lejano aguas arriba. Tenga cuidado de no perforar el canal de flujo principal.

A continuación, inserte la fibra acoplada al láser de 405 nanómetros en el canal lateral más lejano de 120 micrómetros de altura, proporcionando un espaciado de fibra de 300 micrómetros. Por último, inserte la fibra acoplada al tubo fotomultiplicador más grande en el canal de 220 micrómetros de altura normal a las dos fibras de excitación láser. Llene una jeringa de cinco mililitros llena de HFE 7500 que contenga un 2% de tensioactivo fluorado iónico y móntela en la entrada de aceite espaciador del dispositivo de detección utilizando un tubo de PE2.

A continuación, llene una jeringa con una emulsión mixta de FITC y colorante azul y móntela en una bomba de jeringa orientada verticalmente acoplada al dispositivo como entrada de reinyección de gotas utilizando un tubo de PE2. Conecte un tramo de tubo de PE desde la salida del dispositivo hasta un contenedor de residuos. Luego, cebe el dispositivo haciendo funcionar cada una de las bombas a 1.000 microlitros por hora hasta que se vea que tanto el aceite como las gotas se combinan regularmente en el dispositivo y fluyen aguas abajo.

Ajuste los caudales de modo que el aceite espaciador funcione a 6.000 microlitros por hora y las gotas a 100 microlitros por hora, proporcionando un espacio significativo entre las gotas que viajan a través de la región de detección. Luego, encienda los láseres e inicie el programa de adquisición de datos. A continuación, ajuste la ganancia del tubo del multiplicador fotográfico para proporcionar señales que sean más de 100 veces el ruido de fondo de referencia.

Por último, ajuste la potencia del láser para que todos los picos del doblete sean claramente visibles en una única traza de tiempo a escala lineal. Una gota que fluye a través del canal de detección encuentra regiones de excitación discretas frente a cada una de las fibras ópticas acopladas con láser. La fibra de detección registra la fluorescencia emitida con un desplazamiento temporal con una separación de picos que se correlaciona con el tiempo que tarda una gota en pasar de una región de excitación a la siguiente.

Esto elimina la necesidad de un mayor filtrado de luz y tubos fotomultiplicadores separados. La eficacia del esquema de detección se probó mediante la detección de una emulsión mixta de gotas que contienen colorantes que excitan a 405 nanómetros y a 473 nanómetros. Este gráfico muestra una clara separación entre los cuatro tipos de gotas reinyectadas cuando fluyen a aproximadamente 50 hercios.

El rango dinámico y la sensibilidad absoluta del detector se investigaron midiendo las gotas de fluoresceína solamente. Los datos muestran la capacidad del sistema para detectar concentraciones de colorante que oscilan entre 0,1 y 100 nanomolares. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo implementar un sistema de detección de fluorescencia simple y compacto mediante la utilización de una matriz de fibras ópticas insertadas y un solo fotodetector.