Name: Multicolor detección por fluorescencia de la gotita de microfluídica el uso de fibras ópticas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Aprende a implementar detección de fluorescencia multicolor en microfluídica de gotitas utilizando fibras ópticas. Este método compacto permite el cribado biológico de alto rendimiento y la evolución dirigida de enzimas de forma económica.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención de DARPA número 84389.01.44908, un premio NSF CAREER (DBI-1253293), una beca de investigación exploratoria/de desarrollo de los NIH (CA195709) y los premios NIH New Innovator Awards (HD080351, DP2-AR068129-01), y una subvención New Directions del programa de asignación de recursos de UCSF.

Fabricación 1. Maestro SU8 <ol><li> Diseñar las estructuras de microfluidos para la fabricación de tres capas utilizando software de diseño y tienen los diseños impresos por un proveedor en la película placa de circuito con 10 micras de resolución. Los detalles del diseño del dispositivo se dan en una referencia vinculada 6 y las geometrías del canal se muestra en la Figura 1. Las capas deben incluir marcas de alineación para ayudar a collocate características de cada capa de la fabricación 8. </li><li> Coloque una oblea de silicio de diámetro previamente limpiadas de 3 pulgadas en una recubridora de rotación y encienda el vacío para pegarla en el mandril. Aplicar 1 ml de SU8-3050 en el centro de la oblea y centrifugado durante 20 segundos a 500 rpm, a continuación, 30 segundos a 1750 rpm, proporcionando un espesor de capa de 80 micras. </li><li> Retire la oblea y hornear en una placa de cocción de 135 ° C durante 30 minutos. Dejar que la oblea de enfriar a ta antes de pasar a la siguiente etapa. </li><li> Exponer el disco recubierto con la capa de máscara 1 st bajo un colimado 190 mW, 365 nm LED durante 3 min. Después de la exposición, colocar la oblea en una placa de cocción C 135 ° durante 1 min, después se enfría a RT, antes de proceder al siguiente paso. </li><li> Colocar la oblea en la recubridora de rotación y encienda el vacío para pegarla en el mandril. Aplicar 1 ml de SU8-3050 en el centro de la oblea y centrifugado durante 20 segundos a 500 rpm, a continuación, 30 segundos a 5000 rpm, lo que resulta en una capa que proporciona un espesor adicional de 40 micras. </li><li> Retire la oblea y hornear en una placa de cocción de 135 ° C durante 30 minutos, dejar enfriar a temperatura ambiente antes de pasar al siguiente paso. </li><li> Alinear la máscara de capa 2 o en la geometría modelada en 1.3 y exponer la oblea recubierta a un colimado 190 mW, 365 nm LED durante 3 min. Después de la exposición, colocar en un 135 ° C placa de 4 min 30 seg, y luego se enfría hasta TA antes de proceder al siguiente paso. </li><li> Colocar la oblea en la recubridora de rotación y encienda el vacío para pegarla en el mandril. Aplicar 1 ml de SU8-3050 en el centro de la oblea y centrifugado durante 20 segundos a 500 rpm, a continuación, 30segundos a 1000 rpm, lo que resulta en una capa que proporciona un espesor adicional de 100 micras. </li><li> Retire la oblea y hornear en una placa de cocción de 135 ° C durante 30 minutos, dejar enfriar a temperatura ambiente antes de pasar al siguiente paso. </li><li> Alinear la máscara de capa 3 rd en la geometría modelada en 1.3 y exponer la oblea recubierta a un colimado 190 mW, 365 nm LED durante 3 min. Después de la exposición, colocar en un 135 ° C placa de cocción para 9 min, después se enfría a RT, antes de proceder al siguiente paso. </li><li> Desarrollar las máscaras por inmersión en un baño de agitación de propileno glicol monometil éter acetato durante 30 minutos. Lavar la oblea en isopropanol y se cuece al horno en una placa caliente a 135 ° C durante 1 min. Coloque el maestro desarrollado en una placa de Petri de 100 mm para el moldeo de polidimetilsiloxano (PDMS). </li></ol> 2. PDMS fabricación de dispositivos <ol><li> Preparar 10: 1 PDMS mediante la combinación de 50 g de base de silicona con 5 g de agente de curado en un vaso de plástico. Mezclar el contenido con una herramienta rotativa dotada de una varilla de agitación. degcomo la mezcla dentro de un desecador durante 30 min, o hasta que todas las burbujas de aire se eliminan. </li><li> Verter el PDMS para dar un espesor de 3 mm sobre el maestro y colocar de nuevo en el desecador durante más de desgasificación. Una vez que se eliminan todas las burbujas, hornear el dispositivo a 80 ° C durante 80 minutos. </li><li> Cortar el dispositivo del molde utilizando un bisturí y el lugar sobre una superficie limpia con el lado estampado y perforar las entradas y salidas de fluidos con un punzón de biopsia de 0,75 mm. El dispositivo debe ser cortada de manera que las 120 micras y 220 micras geometrías altos son accesibles desde el lado del dispositivo. </li><li> Plasma trata a un dispositivo, con la cara hacia arriba función, junto con un pre-limpiadas 2 pulgadas por 3 pulgadas portaobjetos de vidrio a 1 mbar plasma de O2 durante 20 segundos en un limpiador de plasma de 300 W. Unir el dispositivo de PDMS colocando el lado estampado del dispositivo de PDMS en el lado tratado con plasma de la lámina de vidrio. Coloque el dispositivo en un horno a 80 ° C y hornear el dispositivo montado durante 40 minutos. </li><li> Prestar los canaleshidrófoba mediante el uso de una jeringa para enjuagar el dispositivo con un fluido de tratamiento de superficie fluorada. Inmediatamente hornear el dispositivo a 80 ° C durante 10 min para evaporar el disolvente. </li></ol> 3. Preparación de los componentes ópticos <ol><li> Preparar la fibra láser de excitación mediante la eliminación del aislamiento de la última 5 mm de un 105 micras núcleo, revestimiento 125 m, NA = 0,22 fibra óptica. </li><li> Preparar el color de láser de fibra de excitación 2º repitiendo 3.1 para una fibra idéntica 2º. </li><li> Preparar la fibra para recoger la señal de fluorescencia mediante la repetición de un 3,1 por 200 micras núcleo, revestimiento 225 m, NA = 0,39 fibra óptica. </li><li> Inspeccionar las puntas de todas las fibras - si la punta no terminan en una superficie plana, vuelva a escindir los extremos con un escriba fibra. </li><li> Adjuntar un acoplador de fibra láser a un 50 mW, 405 nm láser y adjuntar una de las 105 micras fibras del núcleo al láser. Dirigir el extremo pelado en el sensor de la potencia del lásermetro, y el uso de los ajustes finos del acoplador de láser para maximizar la potencia del láser. </li><li> Repita 3,5 para un láser de 50 mW, 473 nm. </li><li> Montar una 446/510/581/703 filtros de paso de banda cuádruple nm en el PMT utilizando tubos de lentes para bloquear la luz láser y transmitir la fluorescencia emitida. Adjuntar acoplador de fibra de modo que la luz viaja a través de los filtros antes de golpear el PMT. </li><li> Coloque la fibra de 3,3 a la unidad ensamblada en 3.7. </li></ol> 4. Fuera de línea mixta Generación Emulsión <ol><li> Obtener un dispositivo de microfluidos dropmaker flujo foco con un 60 micras x 60 micras orificio. </li><li> Llene una jeringa de 1 ml con HFE 7500 aceites con 2% fluorado iónica 9. </li><li> Llene una serie de jeringas de 1 ml con las siguientes combinaciones de fluoresceína (FITC) y tintes de color azul de dextrano conjugado (CB) en PBS: 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM FITC / 10 nM CB, 1 nM FITC / 100 nM CB, y 10 nM FITC / 100 nM CB. </li><li> Montar el dispositivo dropmaker en el escenario de un micros invertidashacer frente y las jeringas acuosas y de aceite en bombas de jeringa. Acoplar las jeringas a los dispositivos que utilizan PE-2 tubos. </li><li> Ejecución de bombas de jeringa a 500 l / h para el aceite y 250 l / h para las soluciones acuosas, crear una mezcla de 80 micras gotitas que contienen las soluciones de 4,3. Para cada tipo de muestra acuosa, utilice un dispositivo dropmaker fresca para eliminar la contaminación cruzada. Recoger ~ 200 l de emulsión de cada combinación de medio de contraste en una jeringa vacía. </li><li> Después de los 4 tipos de las gotitas se han recogido en una sola jeringa colección, mezclar la emulsión por repetidamente la rotación de la jeringa. </li><li> Repetir los pasos 4.2 a 4.6 con las soluciones acuosas que contienen 0,1, 1, 10, y 100 nM FITC en PBS. </li></ol> 5. La inserción de fibra óptica <ol><li> Coloque el chip de microfluidos fabricado en el paso 2 en el escenario de un microscopio invertido, junto con una cámara digital capaz de &lt;100 microsegundos velocidades de obturación. </li><li> Trabajar con cuidado desde el lado, inseta la fibra acoplado al láser 473 nm en el canal 120 micras más alejado aguas arriba, teniendo cuidado de no perforar a través de al canal de flujo principal. </li><li> Insertar la fibra acoplado al láser 405 nm en el canal micras alta lado más alejado aguas abajo 120, proporcionando espaciamiento fibra de 300 micras. </li><li> Insertar la fibra acoplado a PMT en el canal de altura 220 micras normal a las dos fibras de excitación láser. </li></ol> 6. Detección de la fluorescencia de las emulsiones mixtas <ol><li> Montar una jeringa de 5 ml lleno de HFE 7500 con tensioactivo fluorado iónico 2% a la entrada de aceite espaciador del dispositivo de detección con PE-2 tubos. </li><li> Montar la jeringa que contiene la emulsión mixta / CB FITC en una bomba de jeringa orientada verticalmente y la pareja a la entrada de gotas de reinyección del dispositivo mediante PE-2 tubos. Conectar un tramo de tubo PE-2 de la salida de dispositivo a un recipiente de residuos. </li><li> El primer dispositivo mediante la ejecución de cada una de las bombas a 1.000 l / h hasta tantoaceite y las gotitas se observa que son la combinación de regularidad en el dispositivo y que fluye aguas abajo. </li><li> Ajustar los caudales de tal manera que el aceite espaciador ejecuta a 6.000 l / hr y las gotas en 100 l / h, proporcionando separación significativa entre las gotas que viajan a través de la región de detección. </li><li> Encienda el láser, inicie el programa de adquisición de datos, y ajustar la ganancia del PMT para proporcionar señales que son más de 100 veces el ruido de la línea de base. Ajustar la potencia del láser de modo que todos los picos doblete son claramente visibles en un solo timetrace, linealmente a escala. </li><li> Adquirir 60 seg de la timetrace voltaje PMT en al menos 20 kHz. Importar los datos en el programa de computación tales como Matlab y medir las alturas de los picos de los dobletes grabados utilizando la secuencia de comandos del programa de computación personalizado. NOTA: Esto se proporciona como información complementaria. </li><li> Repita los pasos 6.2 a 6.7 utilizando la única FITC-emulsión mixta creada en 4.7, con el láser de 405 nm apagado. </li></ol>

<ol><li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 198-220 (2008).</li>
<li>Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+and+sorting+using+droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocol%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics.</a> Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).</li>
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<li>Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+encoded+multicolor+fluorescence+detection+in+a+microfluidic+flow+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer.</a> Lab Chip. 12 (23), 5057-5062 (2012).</li>
<li>Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+fabrication+of+a+microfluidic+device+with+integrated+optical+waveguides+for+DNA+fragment+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis.</a> Lab Chip. 7 (10), 1280-1287 (2007).</li>
<li>Martinez Vazquez, R., Osellame, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sensing+in+microfluidic+lab-on-a-chip+by+femtosecond-laser-written+waveguides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides.</a> Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).</li>
<li>Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+control+of+microchannels+fabricated+in+fused+silica+by+femtosecond+laser+irradiation+and+chemical+etching%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching.</a> Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

detección de fibra óptica requiere la alineación de las fibras ópticas con respecto a los canales de fluido. Debido a que nuestro dispositivo utiliza canales de guía fabricados con múltiples capas de fotolitografía, la colocación de máscaras con respecto a la otra es de gran importancia. Si los canales de guía de la fibra son demasiado cerca del canal de fluido, existe un potencial de fugas de fluido; Si los canales de guía se encuentran demasiado lejos o mal alineados, la señal de fluorescencia recogida por la fibra de...

Microfluídica Droplet proporcionan una plataforma para alta biología rendimiento por compartimentar experimentos en un gran número de gotitas acuosas suspendidas en un aceite portador 1. Las gotitas se han utilizado para aplicaciones tan diversas como el análisis de células individuales 2, reacción en cadena de la polimerasa digital (PCR) 3, y la enzima evolución 4. ensayos fluorescentes son el modo estándar de detección para microfluidos de gotitas, ya que sus señales luminosas y tiempo de respuesta rápido son compatibles con la detección de volúmenes de gotitas sub-nanolitros a tasas kilohercios. Muchas aplicaciones requieren la detección de fluorescencia de al menos dos colores simultáneamente. Por ejemplo, nuestro laboratorio realiza comúnmente PCR activadas por la clasificación de gotitas experimentos que utilizan un canal de detección para el resultado de un ensayo, y se utiliza un colorante de fondo secundario para hacer gotita ensayo negativo contable 5. estaciones de detección típicos para microfluidos de gotas son based en los microscopios de epifluorescencia, y requieren complicados esquemas de manipulaciones de luz para introducir luz de excitación de láseres de espacio libre en el microscopio estar centrado en la muestra. Después de fluorescencia es emitida desde una gota, la luz fluorescente emitida se filtra de modo que cada canal de detección utiliza un tubo fotomultiplicador (PMT) centrada en una banda de longitud de onda. Los sistemas de detección óptica de epifluorescencia a base de microscopio proporcionan una barrera a la entrada, debido a su costo, la complejidad y requieren mantenimiento. Las fibras ópticas proporcionan los medios para la construcción de un esquema de detección simplificada y robusta, ya que las fibras se pueden insertar manualmente en los dispositivos de microfluidos, eliminando la necesidad para el enrutamiento de la luz a base de espejo, y permitir trayectorias de la luz para ser interconectados mediante conectores de fibra óptica. En este trabajo se describe el montaje y validación de un sistema compacto y modular para realizar la detección de fluorescencia multicolor mediante la utilización de una matriz de fibras de una ópticada fotodetector solo 6. Las fibras ópticas están acopladas a los láseres individuales y se insertan normal a un canal de flujo en forma de L en desplazamientos espaciales regulares. Una fibra de captación de fluorescencia está orientado paralelo a las regiones de excitación y está conectado a un único PMT. Debido a que una gota pasa a través de los haces de láser en diferentes momentos, los datos registrados por el PMT muestra un desplazamiento temporal que permite al usuario distinguir entre la fluorescencia emitida después de la gotita es excitado por cada haz de láser distinto. Este cambio temporal elimina la necesidad de separar la luz emitida a PMT separados utilizando una serie de espejos dicroicos y los filtros de paso de banda. Para validar la eficacia del detector, que cuantificar la fluorescencia en las poblaciones de gotitas que encapsulan tintes de diferente color y la concentración. La sensibilidad del sistema se investiga para la detección de un solo color de fluoresceína, y muestra la capacidad de detectar gotitas con concentraciones de hasta 0,1 nM, un impr sensibilidad 200xovement en comparación con los enfoques basados ​​en fibra recientes en la literatura 7.

<table><tbody><tr><td>Fotomascarillas</td><td>CadArt Servcies Obleas de silicona</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de 3", tipo P, virgen grado de prueba</td><td>University Wafers</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3035</td><td>Microchem</td><td>Y311074</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>Microchem</td><td>Y111072</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 kit de elastómero de silicona</td><td>Krayden 4019862</td><td></td><td></td></tr><tr><td>jeringas de 1 ml</td><td>BD</td><td></td><td></td>309628</tr><tr><td>Jeringas de 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>27 agujas de gaga</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>PE 2 tubo de polietileno</td><td>Scientific Commodities, Inc.</td><td>B31695-PE/2</td><td></td></tr><tr><td>Novec 7500</td><td>Fisher Scientific</td><td>98-0212-2928-5</td><td>Comúnmente conocido como HFE 7500</td></tr><tr><td>Ionic Krytox Surfactant</td><td></td><td></td><td>Instrucciones de síntesis en ref #10</td></tr><tr><td>Colorante azul en cascada conjugado con dextrano</td><td>Life Technologies</td><td>D-1976</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceína sal</td><td>Sigma</td><td>28803</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td> <td>de paso de banda cuádrupleSemrock</td><td>FF01-446/510/581/703-25</td><td></td></tr><tr><td>PMT</td><td>Thorlabs</td><td>PMM02</td><td></td></tr><tr><td>Puerto de fibra</td><td>Thorlabs</td><td>PAFA-X-4-A</td><td></td></tr><tr><td>tubo de lente</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td><td></td></tr><tr><td>Cable de conexión con 200 &#956; m núcleo / 225 &#956; m revestimiento de fibra óptica con un extremo pelado y un conector FC/PC</td><td>Thorlabs</td><td>Cable</td> de conexión personalizado <td></td></tr><tr><td>con 105 &#956; m núcleo / 125 &#956; m revestimiento de fibra óptica con un extremo pelado y un conector FC/PC</td><td>Thorlabs</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>125 &#956; m peladora</td><td>de fibra Thorlabs</td><td>T08S13</td><td></td></tr><tr><td>225 &#956; m herramienta de pelado de fibra</td><td>Thorlabs</td><td>T10S13</td><td></td></tr><tr><td>adaptador de fibra láser</td><td>OptoEngine</td><td>FC/PC Adaptador</td><td></td></tr><tr><td>405 nm CW láser a 50&nbsp; mW</td><td>OptoEngine</td><td>MDL-III-405</td><td>Distribuidor para láseres CNI</td></tr><tr><td>473 nm CW láser a 50&nbsp; mW</td><td>OptoMotor</td><td>MLL-FN-473-50</td><td></td></tr></tbody></table>

multicolor detección por fluorescencia de la gotita de microfluídica el uso de fibras ópticas

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Los ensayos de fluorescencia son las lecturas más comunes utilizadas en la microfluídica de gotas debido a sus señales brillantes y su rápida respuesta temporal. Aplicaciones como los ensayos múltiples, la evolución de enzimas y la clasificación celular mejorada en biología molecular requieren la detección de dos o más colores de fluorescencia. Los sistemas de detección multicolor estándar que acoplan láseres de espacio libre a microscopios de epifluorescencia son voluminosos, caros y difíciles de mantener. En este artículo, describimos un esquema para realizar la detección multicolor mediante la excitación de regiones discretas de un canal microfluídico con láseres acoplados a fibras ópticas. La luz emitida es recogida por una fibra óptica acoplada a un único fotodetector. Debido a que la excitación ocurre en diferentes ubicaciones espaciales, la identidad de la luz emitida se puede codificar como un cambio temporal, lo que elimina la necesidad de esquemas de filtrado de luz más complicados. El sistema se ha utilizado para detectar poblaciones de gotas que contienen cuatro combinaciones únicas de colorantes y para detectar concentraciones subnanomolares de fluoresceína.

La fabricación de un dispositivo de PDMS que permite la inserción de fibras ópticas requiere un procedimiento de fotolitografía de varios pasos para crear canales de altura variable (Figura 1). En primer lugar, un 80 micras de altura de capa de SU-8 se hace girar sobre una oblea de silicio y se modela usando una máscara para crear la geometría de manejo de fluidos. A continuación, un 40 micras capa adicional de SU-8 se hace girar sobre la oblea, y se modela mediante una ...

La detección de fluorescencia multicolor en microfluídica de gotas suele implicar sistemas de detección basados en microscopio de epifluorescencia voluminosos y complejos. Aquí describimos un esquema de detección multicolor compacto y modular que utiliza una matriz de fibras ópticas para codificar temporalmente los datos multicolor recopilados por un solo fotodetector.

Multicolor detección por fluorescencia de la gotita de microfluídica el uso de fibras ópticas

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar una aplicación sencilla de la detección de fluorescencia en microfluidica de gotas utilizando fibras ópticas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en cribados biológicos de alto rendimiento, como la identificación de fenotipos raros y la evolución dirigida de enzimas. La principal ventaja de esta técnica es que permite una aplicación sencilla y económica de la detección de fluorescencia en microfluidica de gotas.Para comenzar, coloque una oblea de silicio de tres pulgadas de diámetro previamente limpiada sobre el platillo de vacío de un centrifugador. Luego, aplique un mililitro de SU-8 3050 en el centro de la oblea y haga girar la oblea para obtener una capa de resistencia fotosensible de 80 micrómetros de espesor. Retire la oblea recubierta del centrifugador y colóquela sobre una placa calefactora precalentada a 135 grados Celsius.Después de 30 minutos, retire la oblea y déjela enfriar nuevamente hasta la temperatura ambiente. A continuación, coloque la oblea sobre una superficie plana y alinee la máscara de la primera capa sobre la oblea. Exponga la oblea bajo un LED colimado de 190 milivatios y 365 nanómetros durante tres minutos.Después de la exposición, coloque la oblea sobre una placa caliente a 135 grados Celsius durante un minuto y luego déjela enfriar hasta la temperatura ambiente. Una vez fría, coloque la oblea nuevamente en el cubo giratorio y fíjela al portamuestras. Aplique un mililitro adicional de SU-8 3050 en el centro de la oblea y gire durante 20 segundos a 500 r.p.m.seguido de 30 segundos a 5.000 r.p.m. A continuación, hornee la oblea en una placa calefactora. Deje que se enfríe nuevamente hasta la temperatura ambiente y luego colóquela de nuevo sobre la superficie de alineación de la máscara.Utilice el microscopio estereoscópico para alinear manualmente la máscara de la segunda capa con las marcas de alineación impresas en la oblea. Una vez alineada correctamente, exponga la oblea recubierta durante 4-1/2 minutos utilizando las mismas condiciones que antes. Después de la exposición, coloque la oblea sobre una placa calefactora a 135 grados Celsius durante un minuto, luego enfríe la oblea y colóquela nuevamente en el centrífugo de recubrimiento.Aplique un mililitro de SU-8 3050 sobre la oblea por tercera vez y centrifugue para añadir otros 100 micrómetros de resistencia fotosensible. Retire la oblea y hornee en una placa caliente de 135 grados Celsius durante 30 minutos. Luego, enfríela hasta temperatura ambiente y colóquela sobre la superficie de alineación.Alinee la máscara de la tercera capa con la geometría anterior y exponga la oblea recubierta utilizando las mismas condiciones anteriores durante nueve minutos. Después de la exposición, coloque la oblea sobre una placa caliente a 135 grados Celsius durante un minuto y luego enfríela a temperatura ambiente. Una vez fría, revele las máscaras sumergiendo la oblea en un baño agitado de revelador durante 30 minutos.Finalmente, lave la oblea con isopropanol y luego sométala a cocción por última vez durante un minuto en una placa calefactora a 135 grados Celsius. Almacene el molde maestro desarrollado en una placa de Petri de 100 milímetros hasta el moldeado. Prepare una mezcla de PDMS en proporción 10:1 combinando 50 gramos de base de silicona con cinco gramos de agente de curado en un vaso de plástico.Mezcle los contenidos con una herramienta rotativa y luego desgasifique la mezcla dentro de un desecador durante 30 minutos, o hasta que se eliminen todas las burbujas de aire. Vierta el PDMS desgasificado sobre el molde preparado para obtener un espesor de tres milímetros. A continuación, coloque la placa de Petri nuevamente en el desecador para una mayor desgasificación.Una vez eliminadas todas las burbujas, hornee el dispositivo a 80 grados Celsius durante 80 minutos. Una vez enfriado, corte el dispositivo del molde utilizando un escalpelo de modo que tanto las telegeometrías de 120 micrómetros como las de 220 micrómetros sean accesibles desde el lateral del dispositivo. A continuación, perfore las entradas y salidas de fluidos con un punzón de biopsia de 0,75 mm.Someta el dispositivo a un tratamiento de plasma con el lado de las características hacia arriba, junto con una lámina de vidrio previamente limpiada y un plasma de oxígeno a 1 milibar durante 20 segundos en un limpiador de plasma de 300 vatios. Una el dispositivo colocando firmemente el lado grabado del dispositivo de PDMS sobre el lado del portaobjetos de vidrio tratado con plasma. Luego, coloque el dispositivo en un horno de 80 grados Celsius y hornee el dispositivo ensamblado durante 40 minutos.Una vez horneado, utilice una jeringa para enjuagar el dispositivo con un fluido de tratamiento superficial fluorado para hacer que los canales sean hidrofóbicos. Luego, hornee inmediatamente el dispositivo a 80 grados Celsius durante 10 minutos para evaporar el disolvente. Prepare dos fibras de excitación láser retirando el aislamiento de los últimos cinco milímetros de las fibras ópticas.Además, prepare la fibra para recolectar la señal fluorescente retirando el aislamiento de los últimos cinco milímetros de una fibra óptica más grande. Inspeccione las puntas de todas las fibras bajo un microscopio. Si las puntas no terminan en una superficie plana, vuelva a cortar los extremos con un trazador de fibras.A continuación, conecte un acoplador láser de fibra a un láser de 50 milivatios y 405 nanómetros y conecte una de las fibras de núcleo de 105 micrómetros al láser. Dirija el extremo pelado del sensor de un medidor de potencia láser y utilice los ajustes finos del acoplador láser para maximizar la potencia del láser. Realice el mismo procedimiento para ajustar la otra fibra utilizando un láser de 50 milivatios y 473 nanómetros.Luego, monte un filtro de paso cuádruple en el tubo fotomultiplicador utilizando tubos para lentes con el fin de bloquear la luz láser y transmitir la fluorescencia emitida. Conecte un acoplador de fibra para que la luz atraviese los filtros antes de llegar al tubo fotomultiplicador. A continuación, conecte la fibra colectora al acoplador de fibra.Coloque el chip microfluídico fabricado sobre la platina de un microscopio invertido acoplado a una cámara digital capaz de velocidades de obturación de al menos 100 microsegundos. Trabajando cuidadosamente desde los lados, inserte la fibra acoplada al láser de 473 nanómetros en el canal de 120 micrómetros más aguas arriba. Tenga cuidado de no perforar hasta el canal de flujo principal.Luego, inserte la fibra acoplada al láser de 405 nanómetros en el canal lateral más aguas abajo de 120 micrómetros de altura, proporcionando un espaciado entre fibras de 300 micrómetros. Por último, inserte la fibra acoplada al tubo fotomultiplicador más grande en el canal de 220 micrómetros de altura, normal a las dos fibras de excitación láser. Llene una jeringa de cinco mililitros con HFE 7500 que contiene 2% de surfactante fluorado iónico y móntela en la entrada de aceite espaciador del dispositivo de detección utilizando tubo PE2.A continuación, llene una jeringa con una emulsión mixta de FITC y colorante azul y colóquela en una bomba de jeringa orientada verticalmente acoplada al dispositivo como entrada de reinyección de gotas mediante un tubo PE2. Conecte un tramo de tubo de PE desde la salida del dispositivo hasta un recipiente de desecho. Luego, prepare el dispositivo haciendo funcionar cada una de las bombas a 1.000 microlitros por hora hasta observar que el aceite y las gotas se combinen regularmente dentro del dispositivo y fluyan aguas abajo.Ajuste los caudales de manera que el aceite espaciador fluya a 6.000 microlitros por hora y las gotas a 100 microlitros por hora, lo que proporciona un espaciado significativo entre las gotas que viajan a través de la región de detección. Luego, encienda los láseres e inicie el programa de adquisición de datos. A continuación, ajuste la ganancia del tubo fotomultiplicador para obtener señales que sean más de 100 veces superiores al nivel de ruido de fondo.Finalmente, ajuste la potencia del láser de modo que todos los picos dobles sean claramente visibles en un único trazo temporal con escala lineal. Una gota que fluye a través del canal de detección encuentra regiones discretas de excitación frente a cada una de las fibras ópticas acopladas al láser. La fibra de detección registra la fluorescencia emitida con un desplazamiento temporal cuya separación de picos se correlaciona con el tiempo que tarda una gota en desplazarse de una región de excitación a la siguiente.Esto elimina la necesidad de un filtrado adicional de luz y de tubos fotomultiplicadores separados. La eficacia del sistema de detección se probó detectando una emulsión mixta de gotas que contienen colorantes que se excitan a 405 nanómetros y a 473 nanómetros. Este gráfico muestra una separación clara entre los cuatro tipos de gotas reinyectadas cuando fluyen a aproximadamente 50 hercios.Se investigó el rango dinámico y la sensibilidad absoluta del detector mediante la medición de gotas que contenían solo fluoresceína. Los datos muestran la capacidad del sistema para detectar concentraciones de colorante que varían desde 0,1 hasta 100 nanomolares. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo implementar un sistema de detección de fluorescencia sencillo y compacto utilizando un arreglo de fibras ópticas insertadas y un único detector fotónico.

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