Name: Generación de medios y aplicaciones acondicionado de órganos para el estudio de las influencias específicas de órganos en el seno cáncer metastásico Comportamiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Aprenda a generar medios acondicionados de órganos de ratón para estudiar factores solubles específicos y su influencia en el comportamiento metastásico de células de cáncer de mama. Este modelo ex vivo permite investigar el tropismo de órganos.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Canadiense de Cáncer de Mama-Región de Ontario, la Fundación Canadiense para la Innovación (No. 13199), y el apoyo de donantes de John y Donna Bristol a través de la Fundación de Ciencias de la Salud de Londres (a A.L.A.). El programa de becas de posgrado de Ontario (provincia de Ontario, a G.M.P. y J.E.C.), el programa de becas de posgrado de Canadá (a M.M.P.), el Programa de Capacitación Estratégica de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) (a M.M.P., G.M.P y J.E.C.) y la Unidad de Investigación Traslacional de Cáncer de Mama Pamela Greenaway-Kohlmeier en el Programa Regional de Cáncer de Londres (a M.M.P., G.M.P., J.E.C. e Y.X.). A.L.A. cuenta con el apoyo de un Premio al Nuevo Investigador del CIHR y un Premio al Investigador Temprano del Ministerio de Investigación e Innovación de Ontario.

Se llevaron a cabo todos los estudios con animales de acuerdo con las recomendaciones del Consejo Canadiense de los Animales, en virtud de los protocolos aprobados por la Universidad de Western Uso de Animales Subcomité. 1. Aislamiento de órganos (pulmón, cerebro, hueso, de ganglios linfáticos) <ol><li> Prepare cuatro estéril de 50 ml tubos cónicos (uno para cada órgano a ser aislado) que contiene aproximadamente 30 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). Pre-sopesar cada tubo de PBS utilizando una balanza electrónica. </li><li> La eutanasia de 6-12 semanas de edad ratones por inhalación de CO2. Los ratones se deben dejar en la cámara de CO 2 durante aproximadamente 1 - 2 min o hasta que el ratón deja de moverse y la respiración. la eutanasia exitosa puede confirmarse aún más por la falta de latidos del corazón cuando está marcada de forma manual con un dedo. Evitar la dislocación cervical ya que este método puede romper los vasos sanguíneos del cuello que lleva a dificultades para retirar los ganglios linfáticos axilares. Nota: El trabajo previo ha utilizado específicamenteratones desnudos femeninos sanos, Hsd: atímicos nu Nude- Foxn1 13. </li><li> En una campana de cultivo de tejido estéril, colocar el ratón sobre su espalda en un cojín de espuma de poliestireno, difundir las extremidades y el uso de alfileres para mantenerlas en su lugar. </li><li> El uso de pinzas y tijeras estériles, cortar la piel abdominal en la línea media en los genitales y cortar hacia arriba, hacia la boca. Tire suavemente la piel abdominal de los músculos abdominales y el pin en su lugar en la almohadilla de espuma de poliestireno. </li><li> Busque la axilar, braquial, y los ganglios linfáticos inguinales. Nota: Los ganglios linfáticos suelen estar rodeados de tejido graso. Los ganglios linfáticos inguinales son los más fáciles de localizar ya que se encuentran superficialmente en la unión de dos vasos sanguíneos en la piel abdominal retirado. Axilares y ganglios linfáticos braquial se encuentran más profundamente dentro del tejido y requieren maniobras suaves del tejido. <ol><li> Después de haber localizado los ganglios linfáticos, usar las tijeras para cortar con mucho cuidado la linfa sindes de la piel, la grasa y los vasos y eliminarlas del ratón. Para confirmar la disección adecuada, rodar el fórceps sobre el tejido extirpado. Si existe un bulto duro al rodar el fórceps sobre el tejido, a continuación, un ganglio linfático ha probablemente ha eliminado con éxito. </li><li> Coloque los ganglios linfáticos en PBS frío. </li></ol></li><li> Usando las pinzas y tijeras, abrir la cavidad abdominal mediante incisión en la pared abdominal expuesta en un movimiento ascendente hacia el pecho. Corte con cuidado a través del esternón, exponiendo la cavidad torácica. </li><li> Situar la membrana debajo de los pulmones y cortar el diafragma. Se debe tirar hacia las costillas debido a la tensión. </li><li> Levantar los pulmones desde abajo y cortar el tejido subyacente hacia la tráquea. Esto permite que los pulmones para ser removidos libremente de la cavidad torácica. Quitar el corazón y los pulmones en bloque y colocar en PBS frío. El corazón puede ser retirado de los pulmones aquí o simplemente antes de la pesada en el paso 2. </li><li> Eliminar elpasadores, manteniendo el ratón en su lugar en la almohadilla de espuma de poliestireno. Ponga el ratón y cortar la piel de la espalda baja todo el camino al otro lado de flanco a flanco. </li><li> Con un trozo de gasa estéril para mantener el torso del ratón, pelar la piel hacia atrás del ratón sobre las piernas y los pies del ratón. </li><li> Utilizando el mismo trozo de gasa estéril, mantenga la pierna en su lugar, cuidadosamente romper la articulación del tobillo del pie del ratón y pelar la piel sobre la articulación proximal hacia la articulación de la rodilla. </li><li> Con unas tijeras, retire la tibia libre de la articulación de la rodilla y colocar en PBS frío. </li><li> Repetir los pasos 1,11) a 1,12) con el miembro opuesto. </li><li> Con unas pinzas, mantenga el fémur en su lugar, cortar el tejido circundante muscular usando las tijeras y retire el fémur, colocándolo en PBS frío. </li><li> Repita el paso 1.14) con el miembro opuesto. </li><li> El uso de un nuevo trozo de gasa estéril, mantenga la cabeza del ratón en su lugar. El uso de pinzas y tijeras, retire suavemente la piel para exponer los sKull. Con unas tijeras, cortar cuidadosamente el cráneo occipital del centro de la parte superior en una línea recta y hacia abajo para exponer el cerebro posterior. </li><li> Con unas pinzas, cuchara debajo del cerebro hacia la parte anterior y remover todo el cerebro. Coloque el cerebro en PBS enfriado en hielo. </li><li> Repetir los pasos 1.1) a 1,17) durante al menos cuatro ratones. </li></ol> 2. Con un peso de órganos <ol><li> Después del aislamiento de órganos, pesar cada tubo de PBS que contiene de pulmón y tejido cerebral usando una balanza electrónica. </li><li> Calcular la diferencia de peso restando el peso pre-aislamiento (PBS) a partir del peso del tubo de PBS + órganos (pulmón y cerebro). </li><li> Determinar la cantidad de medios de comunicación necesarios para volver a suspender los fragmentos de tejido a partir de la diferencia de peso calculada. Nota: pulmón y el tejido cerebral son de peso normalizado por resuspensión en una relación 4: 1 los medios de comunicación: relación de tejido (vol / peso). </li></ol> 3. Generación de Medios Lung-neuronas del asta posterior acondicionado <ol><li> En un t estériltema cultura capó, invertir los tubos de PBS que contiene los pulmones o el cerebro tres veces para eliminar la sangre residual de órganos y aspirado de PBS que contenía la sangre. Repita con PBS frío fresco hasta que la solución aparece clara, sin evidencia de sangre. </li><li> Coloque los pulmones y el cerebro en separadas 60 mm 2 placas de Petri de vidrio. El uso de dos hojas de bisturí estériles, los pulmones de carne picada o cerebros por corte repetidamente hacia atrás y adelante hasta que los fragmentos de tejido son aproximadamente ~ 1 mm 3 en tamaño. </li><li> fragmentos de tejido Resuspender en volumen apropiado (determinado previamente en el paso 2.3) de Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM): medio F12 suplementado con 1x concentró suplemento mitógeno y penicilina (50 mg / ml) / estreptomicina (50 mg / ml). </li><li> Añadir pulmonares o tejido cerebral fragmentos resuspendidos a un pocillo de una placa de 6 pocillos. </li><li> Incubar los fragmentos de tejido en medios durante 24 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. Después de la incubación, recoja acondicionado medios de comunicación para cada tejido y fás diluir mediante la adición de tres volúmenes equivalentes de medio fresco en un tubo cónico de 50 ml. </li><li> Centrifugar a 1000 xg en medio condicionado diluido para cada órgano a 4 ° C durante 15 min para eliminar los residuos de tejido de gran tamaño. Recoger el sobrenadante medios y filtrar a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras. </li><li> Piscina acondicionado medios de comunicación de cada órgano (es decir., Pulmón con cáncer de pulmón y el cerebro con el cerebro) a partir de varios ratones para tener en cuenta la variabilidad-ratón-a-ratón. Alícuota y almacenar los medios condicionados a -80 ° C hasta su uso. </li></ol> 4. Generación de medios acondicionados de la médula ósea <ol><li> En una campana de cultivo de tejido estéril, recortar el exceso de tejido de la médula y quitar epífisis (piezas de terminación) de los huesos con unas tijeras. </li><li> El uso de un 27 ½ G aguja, la cavidad medular de los huesos ras empujando 1 ml de PBS a través del centro de cada hueso. Esto le permitirá tomar muestras de células estromales de la médula ósea (BMSC) en un tubo nuevo que contenía PBS. </li><li> Centrifugar a 1,000 xg durante 5 min a 4 ° C y se lava dos veces con PBS BMSC. Resuspender las células estromales de médula ósea en 20 ml de medio de crecimiento de las células estromales de la médula (DMEM: F12 suplementado con 1x concentran mitógeno suplemento, penicilina (50 mg / ml) / estreptomicina (50 mg / ml) y 10% de suero Boven fetal (FBS) ). </li><li> Placa 10 ml de células estromales de médula ósea se resuspendieron en un matraz T75. Nota: Combinar y células de la placa de cada 2 ratones en cada matraz T75; de cuatro ratones, dos matraces T75 se necesitan (aproximadamente 1 x 10 7 células / frasco). </li><li> Se incuban las células estromales de médula ósea en los medios de crecimiento de las células estromales de la médula durante 24 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. Después de la incubación, quitar el medio de los dos matraces T75 y poner en frasco nuevo T75, etiquetar este matraz como &quot;flotador Frasco&quot;. Añadir medio de cultivo de células estromales de la médula fresca de 2 frascos anteriores e incubar los 3 matraces a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Después de células alcanzan aproximadamente el 70% de confluencia (aproximadamente 5-7días) las células pasaje. Para ello, retire medio y lavar las células dos veces con PBS (3 ml cada lavado). Retirar PBS y añadir 3 ml de solución de tripsina / EDTA, asegurando que la tripsina cubre toda la superficie del matraz. Después las células se levantan del matraz (~ 2-3 min), deje de tripsinización reacción mediante la adición de 3 estroma medio de crecimiento de células ml hueso). Centrifugar 900 xg durante 5 min a 4 ° C, tirar medios de comunicación, y volver a suspender las células en 10 ml de medio de crecimiento de células estromales de la médula fresca. </li><li> Las células de la piscina de todos los frascos y el paso 1: 5 en tres nuevos matraces T75 y se incuba a 37 ° C y 5% de CO2. Después las células lleguen de nuevo a 70%, repita el paso 4.6 y piscina y de paso todas las células adherentes por segunda vez. Re-placa de todas las células a cuatro matraces T75 e incubar 37 ° C y 5% de CO2. medios de cultivo de células estromales de médula se debe utilizar para todas las medidas. </li><li> Permitir que las células alcanzan la confluencia, las células se lavan tres veces con PBS y se añaden estroma medio de recolección de células óseas (DMEM: F12 medios + 1x mitógeno concentrado dopplement + penicilina (50 mg / ml) / estreptomicina (50 mg / ml); 10 ml / T75), asegurándose de que este medio está libre de FBS. Recoger los medios de médula ósea acondicionado 72 horas más tarde, se filtra a través de un filtro de 0,22 micras, piscina, alícuota y se almacena a -80 ° C hasta su uso. </li><li> Si se desea, confirmar el fenotipo de las células del estroma de la médula ósea aisladas (BMSC) utilizando anticuerpos contra Sca-1 de ratón, CD105, CD29, y CD73, CD44, usando citometría de flujo estándar técnicas como se ha descrito previamente 13. </li></ol> 5. Generación de Medios acondicionado Linfonodular <ol><li> En una campana de cultivo de tejido estéril, invertir tubo de PBS que contenía ganglios linfáticos tres veces para eliminar sangre residual de los ganglios linfáticos y el aspirado sangrienta PBS. Repita con PBS frío fresco hasta que la solución aparece clara, sin evidencia de sangre. </li><li> Coloque los ganglios linfáticos en placas de Petri de 60 mm 2 de vidrio. El uso de dos hojas de bisturí estériles, picadillo de ganglios linfáticos por corte repetidamente hacia atrás y adelante hasta que tissufragmentos de correos son de aproximadamente 1 mm 3 en tamaño. </li><li> En un tubo cónico, fragmentos de tejido se resuspende en 10 ml de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) medio suplementado con penicilina (50 mg / ml) / estreptomicina (50 mg / ml), 5 x 10 -5 M β-mercaptoetanol (estéril 1,75 l / 500 ml de medio) y 10% de FBS. </li><li> Centrifugar a 900 xg durante 5 min a 4 ° C y volver a suspender todas las células en 30 ml de medio. Añadir 5 ml de medio / pocillo en una placa de 6 pocillos y se incuban durante 7 días a 37 ° C y 5% de CO2. </li><li> Después de la incubación de 7 días, descartar los medios de comunicación, lavar las células adherentes con 5 ml de PBS caliente y añadir 5 ml de medio fresco a cada pocillo. Permitir que las células crecen hasta la confluencia (aproximadamente 5 - 7 días), trypsinize, piscina para todas las células, y el paso como se describe en el paso 4.6. células re-placa a placa de 6 pocillos. Repita este paso tres veces. </li><li> Después de tres pasajes, permiten que las células crezcan hasta confluencia, se lavan los pocillos tres veces con PBS y añadir 2 ml / pocillo de DMEM: F12 + 1xsuplemento concentrado mitógeno y penicilina (50 mg / ml) / estreptomicina (50 mg / ml), asegurándose de que este medio está libre de FBS. Recoger los medios de comunicación con ganglios linfáticos acondicionado después de 72 horas, piscina, alícuota y se almacena a -80 ° C hasta su uso. </li><li> Si se desea, confirmar el fenotipo de las células de los ganglios linfáticos estromales aisladas (LNSC) utilizando anticuerpos contra CD45 de ratón y GP38, utilizando citometría de flujo estándar técnicas como se ha descrito previamente 13. </li></ol> 6. El uso de los medios de comunicación acondicionado de órganos para los ensayos intermedios relacionados con el comportamiento metastásico de células de cáncer <ol><li> Una vez que los medios de comunicación de órganos acondicionado se ha generado como se describe en los pasos 1 - 5, lo utilizan para llevar a cabo diferentes células de aguas abajo y los ensayos de biología molecular con el fin de determinar la influencia de los factores de órganos derivados solubles en el comportamiento metastásico de las células cancerosas. Ejemplos de ensayos convencionales (descritas en otra parte en la literatura) incluyen arrays de proteínas, 13 ensayos de crecimiento celular &lt;sup&gt; Ensayos 13, la migración celular 13, tumorsphere formación 14, y RT-PCR 15. Los medios de comunicación de base original usada para generar los medios de órgano-acondicionado (es decir, no condicionado DMEM:. Medio F12 suplementado con 1x concentró suplemento mitógeno y penicilina (50 mg / ml) / estreptomicina (50 mg / ml) se debe utilizar como un control negativo . </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

La metástasis es un proceso complejo por el cual una serie de eventos celulares que son en última instancia responsable de la invasión de tejidos y tumores distantes establecimiento 4,30,31. El sistema modelo ex vivo que aquí se presenta puede ser utilizado para estudiar dos aspectos importantes de la progresión metastásica: vivienda de células de cáncer o de migración a un órgano específico ( &quot;llegar allí&quot;) y el crecimiento en dicho órgano ( &quot;creciendo allí&quot;). Muchos estudios se ...

El cáncer de mama es el cáncer más frecuentemente diagnosticado en mujeres y la segunda causa principal de muertes relacionadas con el cáncer 1. alta tasa de mortalidad de cáncer de mama se debe principalmente a la falta de la terapia convencional para mitigar y eliminar la enfermedad metastásica; aproximadamente el 90% de las muertes relacionadas con el cáncer se deben a la metástasis 2. La comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes de la cascada metastásica es de suma importancia para el desarrollo de terapias eficaces tanto en temprano y el cáncer de seno en etapa tardía. Las investigaciones anteriores han ayudado a aclarar la naturaleza de múltiples etapas de la metástasis del cáncer de mama y se plantea la hipótesis de que el resultado de la progresión de cáncer y la metástasis depende en gran medida de las interacciones entre las células cancerosas y el entorno de acogida 3. Las observaciones clínicas indican que muchos tipos de cáncer presentan tropismo de órganos, es decir., La tendencia a la metástasis preferentemente a lo específico organs.In el case de cáncer de mama, la enfermedad de un paciente típicamente se extiende o metástasis a 5 sitios principales, incluyendo el hueso, los pulmones, los ganglios linfáticos, el hígado y el cerebro 4-6. Muchas teorías se han desarrollado para explicar este proceso, pero sólo unos pocos han resistido la prueba del tiempo. La teoría de Ewing de metástasis, se propone en la década de 1920, la hipótesis de thatthe distribución de la metástasis era estrictamente debido a factores mecánicos; por el que las células tumorales se llevan a través del cuerpo por los patrones de flujo de la sangre fisiológica definidos normales y simplemente detienen en el primer lecho capilar que encuentran 7. Por el contrario, &quot;semilla y del suelo&quot; hipótesis de Stephen Paget 1889 sugirió que las interacciones moleculares adicionales fueron responsables de la supervivencia y el crecimiento de metástasis, en el que las células cancerosas ( &quot;semillas&quot;) sólo pueden establecerse y microambientes de órganos proliferatein que producen factores moleculares apropiados ( &quot;suelo &quot;) 8. Casi un siglo más tarde, Leonard Weiss bajotomó un meta-análisis de los datos publicados anteriormente de la autopsia y se confirmó la predicción de Ewing que muchos tumores metastásicos detectados en el momento de la autopsia se encontraron en las proporciones previstas que se esperarían si metastásico tropismo órgano fue determinado por patrones de flujo sanguíneo solo. Sin embargo, en manyinstances hubo menos o más metástasis formadas en ciertos sitios a continuación, se podría esperar por factores mecánicos propuestos 9 de Ewing. Estas cuentas y teorías sugieren que los microambientes de órganos específicos desempeñan un papel fundamental en los patrones de difusión y posterior crecimiento y la supervivencia de muchos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de mama. Últimos esfuerzos de investigación se han centrado principalmente en los factores derivados de células del tumor y su contribución al tropismo de órganos observado en la metástasis del cáncer de mama 10-12, factores sin embargo pocos estudios han explorado derivados del microambiente de órganos que pueden proporcionar un nicho favorable para el establecimientode metástasis de cáncer de mama. Esto se debe en gran parte a las dificultades técnicas de estudio de los componentes del microambiente de órganos in vitro. El presente artículo describe un sistema ex vivo integral modelo para el estudio de la influencia de los componentes solubles de los ganglios linfáticos, hueso, pulmón, cerebro y en el comportamiento metastásico de células de cáncer de mama humano. Estudios anteriores han validado este modelo de sistema mediante la demostración de que las diferentes líneas celulares de cáncer de mama muestran un comportamiento maligno de células línea específica y órgano-específica en respuesta a los medios de comunicación de órganos acondicionado que corresponde a su in vivo potencial metastásico 13. Este sistema modelo se puede utilizar para identificar y evaluar los factores solubles de órganos derivados específicos que pueden desempeñar un papel en el comportamiento metastásico de mama y otros tipos de células cancerosas, incluyendo las influencias sobre el crecimiento, la migración, el comportamiento y la expresión de genes como tallo, así como la identificación deposibles nuevas dianas terapéuticas para el cáncer. Este es el primer sistema de modelo ex vivo que se puede utilizar para estudiar el comportamiento metastásico de órganos específicos en detalle y para evaluar el papel de los factores solubles derivados de órganos en la conducción del proceso de la metástasis del cáncer.

<table><tbody><tr><td>Tubos cónicos de 50 ml</td><td>Thermo Scientific (Nunc)</td><td>339652</td><td>Mantener estéril</td></tr><tr><td>1x Solución salina tamponada con fosfato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010-023</td><td>Mantener estériles</td></tr><tr><td>Ratones desnudos</td><td>Harlan Laboratories</td><td>Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu</td><td>Uso a las 6 - 12 semanas de edad</td></tr><tr><td>Almohadilla de espuma de poliestireno</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>La tapa desechada (~ 4 x 8 pulgadas o más) de un contenedor de envío de espuma de poliestireno se puede usar para este propósito. Esterilizar limpiando con etanol.</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td>Mantener estériles</td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td>Mantener estériles</td></tr><tr><td>almohadillas de gasa</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-246069</td><td>Mantener estériles</td></tr><tr><td>60 mm2 placas de Petri de vidrio</td><td>Sigma-Aldrich CLS7016560</td><td></td><td>Mantener estériles</td></tr><tr><td>Hojas de bisturí</td><td>Fisher Scientific</td><td>S95937A</td><td>Mantenga estéril</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Life Technologies</td><td>21331-020</td><td>Warm in 37 &deg; C baño de agua antes de usar, mantener estéril &nbsp;</td></tr><tr><td>1x Mito + Serum Extender</td><td>BD Biosciences 355006</td><td></td><td>Referido como "suplemento concentrado de mitógenos" en el manuscrito. Mantener estéril</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Mantener estéril</td></tr><tr><td>Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Caliente en 37 &deg; C baño de agua antes de usar, mantener estéril &nbsp;</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051-500ML</td><td>Mantenga la solución estéril</td></tr> de <tr><td>tripsina/EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R-001-100</td><td>caliente en 37 &deg; C baño de agua antes de usar, mantener estéril &nbsp;</td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos</td><td>Thermo Scientific (Nunc)</td><td>140675</td><td>Mantener estéril</td></tr><tr><td>0,22 &mu; m filtros de jeringa</td><td>Sigma-Aldrich Z359904</td><td></td><td>Mantener estériles</td></tr><tr><td>Matraces de cultivo de tejidos T75</td><td>Thermo Scientific (Nunc)</td><td>178905</td><td>Mantener estériles</td></tr><tr><td>Transwells</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3464</td><td>Mantener estéril, uso para ensayos</td></tr><tr><td>de migración Anti-ratón Sca-1</td><td>R& D Sistemas</td><td>FAB1226P</td><td>uso en 10 y micro; l/106 pilas</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD105 R</td><td>& D Sistemas</td><td>FAB1320P</td><td>uso en 10 y micro; l/106 células</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD29</td><td>R& D Sistemas</td><td>FAB2405P-025</td><td>uso a las 10 y micro; l/106 pilas</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD73</td><td>R& D Sistemas</td><td>FAB4488P</td><td>uso en 10 y micro; l/106 células</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD44</td><td>R& D Sistemas</td><td>MAB6127 uso de SP</td><td>a 0,25 y micro; g/106 células</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD45</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-81</td><td>uso a 5 &micro; l/106 células</td></tr><tr><td>Anti-ratón gp38</td><td>eBioscience</td><td>12-5381-80</td><td>uso a las 10 y micro; l/106 células</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250&nbsp;</td><td>Mantener estéril</td></tr><tr><td>Matrices de proteínas</td><td>RayBiotech Inc.</td><td>AAM-BLM-1-2</td><td>Utilice 1 matriz por condición de medio (incluido el control negativo), por triplicado</td></tr></tbody></table>

generación de medios y aplicaciones acondicionado de órganos para el estudio de las influencias específicas de órganos en el seno cáncer metastásico comportamiento

Generation of Organ-conditioned Media and Applications for Studying Organ-specific Influences on Breast Cancer Metastatic Behavior

El cáncer de mama hace metástasis preferentemente en los ganglios linfáticos, los huesos, los pulmones, el cerebro y el hígado en pacientes con cáncer de mama. Los esfuerzos de investigación anteriores se han centrado en identificar los factores inherentes a las células de cáncer de mama que son responsables de este patrón metastásico observado (denominado tropismo de órganos), sin embargo, se sabe mucho menos sobre los factores presentes dentro de órganos específicos que contribuyen a este proceso. Esto se debe en parte a la falta de sistemas de modelos in vitro que recapitulen con precisión el microambiente de los órganos. Para abordar esto, se ha establecido un sistema modelo ex vivo que permite el estudio de los factores solubles presentes en diferentes microambientes orgánicos. Este modelo consiste en generar medios condicionados a partir de órganos (ganglios linfáticos, huesos, pulmones y cerebro) aislados de ratones atímicos normales desnudos. El sistema modelo se ha validado demostrando que diferentes líneas celulares de cáncer de mama muestran un comportamiento maligno específico de la línea celular y del órgano en respuesta a medios condicionados por órganos que corresponden a su potencial metastásico in vivo. Este sistema modelo se puede utilizar para identificar y evaluar factores solubles específicos derivados de órganos que pueden desempeñar un papel en el comportamiento metastásico de las células cancerosas de mama y otros tipos de cáncer, incluidas las influencias en el crecimiento, la migración, el comportamiento similar al tallo y la expresión génica, así como la identificación de posibles nuevos objetivos terapéuticos para el cáncer. Este es el primer sistema modelo ex vivo que se puede utilizar para estudiar en detalle el comportamiento metastásico específico de un órgano y evaluar el papel de factores solubles específicos derivados de órganos en el proceso de metástasis del cáncer.

Generación de Medios de órganos acondicionado Un diagrama general / esquemático del proceso de aislamiento de órganos y generación de medios acondicionados se presenta en la Figura 1, con las imágenes fotográficas representativas del procedimiento que se muestra en la Figura 2. Debe tenerse en cuenta que cuando este protocolo era primera fase de desarrollo, se incluyó hígado e...

Este manuscrito describe un sistema modelo ex vivo compuesto por medios condicionados por órganos derivados del ganglio linfático, hueso, pulmón y cerebro de ratones. Este sistema modelo se puede utilizar para identificar y estudiar los factores solubles derivados de órganos y sus efectos sobre el tropismo de órganos y el comportamiento metastásico de las células cancerosas.

Generación de medios y aplicaciones acondicionado de órganos para el estudio de las influencias específicas de órganos en el seno cáncer metastásico Comportamiento

Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused ...

El objetivo general de este procedimiento es generar medios acondicionados utilizando nódulos linfáticos, huesos, pulmones y cerebros de ratón para identificar y estudiar factores solubles derivados de órganos y sus efectos sobre el comportamiento metastásico de las células cancerosas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la metástasis, como, ¿cómo influyen los factores específicos de cada órgano en el crecimiento, la migración y la expresión génica de las células cancerosas? Esta técnica proporciona una plataforma ex vivo sencilla que representa los factores solubles específicos de cada órgano in vivo que influyen en el fenotipo y el comportamiento de las células cancerosas.Para aislar los ganglios linfáticos, comience colocando un ratón de seis a doce semanas de edad sobre una almohadilla de espuma de poliestireno dentro de una cabina de cultivo tisular estéril, y asegure las extremidades en posición extendida. A continuación, use pinzas y tijeras para realizar una incisión media en la piel abdominal, desde la zona genital hasta la boca. Luego, tire suavemente de la piel separándola de los músculos abdominales y sujétela a la almohadilla de disección.Con tijeras, retire cuidadosamente los ganglios linfáticos de la piel, la grasa y los vasos, colocando los ganglios en 30 mililitros de PBS frío con hielo a medida que se recolectan. Cuando se hayan recolectado todos los ganglios linfáticos, use la pinza y las tijeras para cortar cuidadosamente la pared abdominal expuesta en dirección ascendente a través del esternón, exponiendo la cavidad torácica. Corte el diafragma.Levante los pulmones desde debajo y corte el tejido subyacente hacia la tráquea. Luego, transfiera los pulmones a un nuevo recipiente con PBS frío con hielo. El corazón puede retirarse de los pulmones durante este paso o antes de pesar el órgano.Para obtener los huesos de las patas, coloque el ratón en posición prona y corte la piel a través de la parte baja de la espalda de un flanco al otro. A continuación, use una pieza estéril de gasa para sujetar el torso y la piel sobre las patas y los pies. Usando la misma pieza de gasa, sostenga la pata inferior mientras rompe cuidadosamente la articulación del tobillo de uno de los pies y retire la piel sobre la articulación en dirección proximal hacia la rodilla.Luego, utilizando tijeras, retire el hueso de la tibia desde la articulación de la rodilla y coloque el hueso en PBS frío con hielo. Después de extraer la segunda tibia, sostenga el fémur en su lugar con pinzas y use tijeras para cortar el tejido muscular circundante. A continuación, coloque el hueso de la pierna en PBS frío con hielo.Para extraer el cerebro, use una nueva pieza de gasa estéril para sostener la cabeza y retire suavemente la piel con tijeras y pinzas para exponer el cráneo. A continuación, use tijeras para cortar cuidadosamente el hueso occipital desde el centro superior del cráneo en una línea recta y descendente para exponer la región posterior del cerebro. Luego, introduciendo la herramienta por debajo del tejido hacia la parte anterior del cráneo, transfiera todo el cerebro a PBS frío con hielo.Para generar el medio acondicionado de pulmón, invierta los tubos de tejido pulmonar tres veces para eliminar cualquier sangre residual de los órganos. Luego, reemplace el lavado con PBS frío fresco y repita hasta que la solución salina esté libre de sangre. A continuación, transfiera los pulmones a un plato de vidrio Petri de 60 milímetros cuadrados por ratón, y utilice dos hojas de escalpelo estériles para picar los tejidos mediante cortes repetidos de adelante hacia atrás.Cuando los fragmentos de tejido tengan aproximadamente un milímetro cúbico de tamaño, volver a suspender los fragmentos en el volumen adecuado de medio DMEM:F12 suplementado con antibióticos, e incubar los tejidos en un pocillo de una placa de seis pocillos por ratón a 37 grados Celsius y cinco por ciento de CO2. Tras 24 horas, transferir todo el contenido de cada pocillo a tubos cónicos individuales de 50 mililitros, y diluir el medio condicionado con tres volúmenes equivalentes de medio DMEM:F12 fresco por tubo. Centrifugar los tubos para eliminar cualquier resto grande de tejido.Luego, reúna los medios condicionados a través de un filtro de jeringa de 0,22 micrones en un solo tubo cónico de 50 mililitros. Para generar medio condicionado de médula ósea, transfiera los huesos bajo una campana de cultivo de tejidos estéril y corte los tejidos excesivos del hueso. Use tijeras para eliminar las epífisis.Luego, utilice una aguja de calibre 27 y media para lavar un mililitro de PBS a través de la cavidad medular de cada hueso hacia un tubo con PBS fresco. Una vez que se hayan recolectado todas las células estromales de médula ósea, lave las células tres veces con PBS. Después del último lavado, re-suspenda el precipitado en 20 mililitros de medio de crecimiento para células estromales óseas suplementado con 10% de suero bovino fetal y siembre 10 mililitros de células por matraz T75.Cuando las células hayan alcanzado aproximadamente el 70 % de confluencia, lave las culturas dos veces con tres mililitros de PBS. A continuación, separe las células con tres mililitros de solución de tripsina/EDTA al 0,025 %, asegurándose de que la tripsina cubra toda la superficie del frasco. Después de dos a tres minutos, detenga la reacción enzimática con tres mililitros de medio de crecimiento para células estromales óseas y reúna las células en un tubo de 50 mililitros.Centrifugar las células. A continuación, re-suspender el precipitado en 10 mililitros de medio fresco. Ahora, pase los cultivos a una relación de uno a cinco en tres matraces T75 nuevos hasta que alcancen una confluencia del 70 %.Luego, lave las células tres veces con PBS tal como se acaba de demostrar, y alimente los cultivos con medio de recolección de células estromales óseas sin suero, suplementado con mitógeno y antibióticos durante 72 horas. Después del tercer día de cultivo, reúna los medios a través de un filtro de 0,22 micrones. Las células estromales deben adherirse al cultivo con una morfología alargada y fibroblástica observada en los cultivos de células estromales de ganglios linfáticos, y una morfología más pequeña y redondeada exhibida por los cultivos de células estromales de médula ósea.El análisis citométrico de flujo confirma que las células estromales del ganglio linfático son principalmente negativas para CD45 y positivas para gp38. Las células estromales de médula ósea deben ser positivas para CD-44 y CD-29, débilmente positivas para CD-105 y Sca-1, y negativas para CD-73. Las células de cáncer de mama humanas con diferentes antecedentes genéticos exhiben patrones diferenciales de migración y crecimiento hacia condiciones específicas de órganos.Por ejemplo, en este experimento representativo, la variante ósea 231-BoM migra preferentemente hacia el medio acondicionado de médula ósea en comparación con los medios acondicionados de cerebro y pulmón. De manera similar, la variante pulmonar 231-LM2 migra preferentemente hacia el medio acondicionado de pulmón en lugar de los medios acondicionados de médula ósea y cerebro. Además, el análisis por RT qPCR demuestra que la exposición de las células madre de cáncer de mama MDA-MB-231 al medio acondicionado de hueso o pulmón induce una regulación al alza de los genes asociados con metástasis específicas de hueso o pulmón de las células de cáncer de mama in vivo.Una vez dominadas, la recolección del tejido y el montaje del medio acondicionado pueden completarse en dos o tres horas si se realizan adecuadamente. Los pasos de subcultivo en los días posteriores toman entre 15 y 30 minutos por día. Al intentar estos procedimientos, es importante recordar mantener todo estéril.Tras la generación del medio acondicionado, se pueden realizar otros métodos como matrices de proteínas, ensayos de crecimiento y migración celular, formación de tumoresferas y RT-PCR para responder preguntas adicionales sobre el efecto de factores específicos de órganos en el comportamiento de las células cancerosas. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación del cáncer de mama exploraran el comportamiento metastásico específico de órganos en un sistema de modelo ex vivo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar medios acondicionados utilizando los huesos, pulmones y cerebros de ratones.No olvide que trabajar con herramientas de disección afiladas puede ser peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones, como utilizar una técnica de disección precisa y cuidadosa, al realizar este procedimiento.

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Investigación

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Este video describe un método para generar un medio condicionado por órganos derivado del hígado de ratón. Este sistema modelo se puede utilizar para identificar y estudiar los factores solubles derivados de órganos y sus efectos sobre el tropismo de órganos y el comportamiento metastásico de las células cancerosas.

Medio Condicionado de Órganos: Medio Generador de Células de Órganos Recolectadas para Estudios de Cáncer Metastásico

Cultivo de células primarias de tejido intacto utilizando organoides proporciona un sistema modelo que imita el microambiente multi-celular in vivo. Desarrollamos un modelo de cultivo libre de suero primaria tejido epitelio de mama que perpetúa los linajes de cultivo de células mixtas y exposiciones morfología diferenciados, sin interrupción tejido enzimática. Organoides mamarios permanecen viables durante&gt; 6 meses.

No enzimática, libre de suero Cultivo de Tejidos de lesiones de mama pre-invasivas para la generación espontánea de mammospheres

Protocolos se describen para el estudio de la migración de células de cáncer de mama, la proliferación y la colonización en un sistema modelo de explante de tejido óseo humano.

Métodos de explantes de tejidos El cultivo fémur humano para el Estudio de la colonización de la célula del cáncer de pecho de la Niche metastásico

Los organoides desarrollados a partir de glándulas mamarias de ratones fueron irradiados y caracterizados para evaluar rasgos epiteliales e interacciones con las células inmunitarias. Los organoides irradiados se pueden utilizar para evaluar mejor las interacciones de células celulares que pueden conducir al reclutamiento de células tumorales en tejido normal irradiado.

Crecimiento y caracterización de organoides irradiados de glándulas mamarias

Mostramos un método para la necropsia y la disección de modelos de cáncer de próstata de ratón, centrándose en la disección tumoral de próstata. También se presenta un protocolo paso a paso para la generación de organoides tumorales de próstata de ratón.

Generación de organoides tumorales a partir de modelos de ratón de ingeniería genética del cáncer de próstata

Se presenta un protocolo para generar organoides endometriales primarios humanos que consisten en células epiteliales y estromales y retienen las características del tejido endometrial nativo. Este protocolo describe los métodos desde la adquisición de tejido uterino hasta el procesamiento histológico de organoides endometriales.

Generación de organoides endometriales primarios humanos multicelulares

La glándula mamaria es una estructura bicapa, que comprende células epiteliales mioepiteliales externas e internas. Presentado es un protocolo para preparar organoides utilizando la trippsinización diferencial. Este método eficiente permite a los investigadores manipular por separado estos dos tipos de células para explorar preguntas sobre sus funciones en la forma y función de la glándula mamaria.

Generación de organoides mamarios de mosaico por trippsinización diferencial

El manuscrito describe una metodología para el establecimiento y seguimiento longitudinal del crecimiento de las metástasis pulmonares espontáneas de tumores de mama inyectados ortotópicamente, susceptibles de intervención en todas las etapas de la cascada metastásica.

In vivo Diagnóstico por imágenes para medir la metástasis pulmonar espontánea de células tumorales de mama inyectadas ortotópicamente

Este protocolo discute un enfoque para generar organoides epiteliales a partir de tejido mamario primario normal y tumoral a través de centrifugación diferencial. Además, se incluyen instrucciones para el cultivo tridimensional, así como imágenes inmunofluorescentes de organoides incrustados.

Generación y obtención de imágenes de organoides epiteliales humanos y de ratón a partir de tejido mamario normal y tumoral sin pasar

Aquí se proporciona un protocolo detallado para establecer organoides mamarios humanos a partir de resecciones de tumores de mama derivados de pacientes o tejido mamario normal. El protocolo proporciona instrucciones completas paso a paso para el cultivo, la congelación y la descongelación de organoides mamarios derivados de pacientes humanos.

Establecimiento y cultivo de organoides mamarios derivados de pacientes

Aprenda a generar medios acondicionados de órganos de ratón para estudiar factores solubles específicos y su influencia en el comportamiento metastásico de células de cáncer de mama. Este modelo ex vivo permite investigar el tropismo de órganos.

Generación de medios y aplicaciones acondicionado de órganos para el estudio de las influencias específicas de órganos en el seno cáncer metastásico Comportamiento (Video) | JoVE Journal

Generación de medios y aplicaciones acondicionado de órganos para el estudio de las influencias específicas de órganos en el seno cáncer metastásico Comportamiento

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