La inyección de células de melanoma murino singénico para determinar su potencial metastásico en los pulmones

El objetivo general de este procedimiento es demostrar un método para la producción de tumores metastásicos en seis ratones negros. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunoterapia, como la forma en que los agentes de investigación afectan la respuesta inmunitaria en los pulmones. La principal ventaja de esta técnica es que se trata de metástasis experimentales.

Por lo tanto, los resultados son confiables y relativamente consistentes. Para comenzar, coloque los cultivos de células de melanoma B16-BL6, que deben tener aproximadamente un 70% de confluencia, en una campana estéril. A continuación, agregue un mililitro de 05%tripsina EDTA a cada plato y deje las celdas durante un minuto.

Después de aspirar esta solución, proceda a agregar un mililitro de tripsina a cada placa y luego devuelva las células a la incubadora. Después de 10 minutos, mueva las células a una campana estéril y agregue cuatro mililitros de medio RPMI libre de suero a cada placa. A continuación, recoja las células con una pipeta motorizada estéril.

Para romper los grumos que podrían obstruir la aguja de expulsión, presione la punta de la pipeta contra la parte inferior de la placa y expulse las células. Después de repetir este proceso varias veces, recoja las células y transfiéralas a un tubo cónico de 15 milímetros. A continuación, extraiga una muestra de la suspensión celular, introdúzcala en un hemocitómetro y determine la densidad celular.

Distribuya equitativamente la suspensión de la celda en cuatro tubos de 15 mililitros. A continuación, centrifugar los tubos, y después decantar el sobrenadante. Proceda a etiquetar cada uno de los tubos con una densidad de celdas diferente: 0, 0.063, 0.125, 0.25 o 0.5 millones de celdas por mililitro.

A continuación, añada un volumen adecuado de RPMI libre de suero a cada cónico para producir estas concentraciones finales. Confirme las densidades celulares deseadas con un hemocitómetro. A continuación, asigne 500 microlitros de cada suspensión en tubos etiquetados de 1,8 mililitros colocados sobre hielo.

Una vez que se hayan preparado todas las suspensiones de celdas B16-BL6, seleccione un mouse. Sosteniéndolo por la cola, guíe la parte trasera del animal primero hacia un sujetador. Cuando el torso del ratón esté en la cámara principal y su cola fuera del aparato, proceda a tirar del animal hacia el extremo del restricción.

A continuación, inserte el émbolo de restricción y continúe empujando el émbolo hasta que el mouse esté seguro. Una vez que el animal esté en su lugar, gire el ratón 90 grados de modo que una de las venas laterales de la cola quede hacia arriba. Luego, use una almohadilla con alcohol para limpiar vigorosamente el lado de la cola del ratón donde la vena es más visible.

Para prepararse para la inyección, primero recoja 300 microlitros de la suspensión de 0,5 millones de células por mililitro en una jeringa. Luego, expulse las burbujas de la jeringa invirtiéndola, moviendo su lado y empujando el émbolo. Una vez que se hayan eliminado las burbujas, expulse el cultivo celular para obtener un volumen final de 250 microlitros en la jeringa.

Proceda a extender la cola del ratón con la mano no dominante. Sujétalo de manera que el dedo índice eleve el extremo proximal de la cola y el pulgar presione la parte distal. Con la mano dominante, inserte la aguja en la vena hacia el extremo distal de la cola en un ángulo diminuto hacia abajo.

A continuación, inserte la aguja aún más, ajustándola para que coincida con el ángulo de la vena de la cola. Después de que la aguja se haya insertado aproximadamente un centímetro en la vena de la cola, comience a empujar el émbolo mientras sostiene la jeringa firmemente. Detenga cualquier sangrado sosteniendo la gasa contra el sitio de entrada.

Una vez que se haya expulsado la suspensión celular, retire la aguja de la vena y deséchela. A continuación, retire el émbolo del sujetador y coloque el ratón en una jaula receptora. Este protocolo tenía como objetivo identificar el número óptimo de células B16-BL6 a inyectar para crear un modelo útil de melanoma metastásico.

Aquí se muestran focos experimentales indicados por flechas formadas en los pulmones dos o tres semanas después de la inyección de cinco densidades celulares diferentes. Cuando se inyectaron 500.000 células por mililitro, los focos cubrieron completamente los pulmones. En el ejemplo que se muestra aquí, se contaron 102 focos.

Por el contrario, los pulmones solo estaban escasamente cubiertos de focos cuando se inyectaron 62.500 células por mililitro o 125.000 células por mililitro. Respectivamente, estas densidades dieron lugar a recuentos de focos pulmonares de uno y 17. Utilizando este método, se determinó que la concentración óptima de células a inyectar era de 250.000 células por mililitro.

Esta densidad dio lugar a pulmones con unos 65 focos, un número en el que los órganos no estaban ni completamente cubiertos ni demasiado escasamente cubiertos por focos. Una enumeración adicional de estos datos, cuando se grafican, demuestra una relación aproximadamente lineal entre los focos pulmonares y la densidad de cultivo celular por encima de 125.000 células por mililitro, como se muestra aquí. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de una hora, dependiendo del número de ratones, si se realiza correctamente.

Al intentar el procedimiento, es importante recordar que debe intentar inyectar un número equivalente de células por ratón. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la administración de fármacos, para responder a preguntas como cómo las posibles terapias afectan a una serie de focos resultantes. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores del cáncer exploraran los componentes del cáncer metastásico en el melanoma en seis ratones negros.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo recolectar y preparar células B16-BL6, sujetar ratones, preparar agujas e inyectar un número equivalente de células en cada vena de la cola. No olvide que trabajar con cultivos de mamíferos y agujas puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como evitar los pinchazos con agujas y usar equipo de protección.