Name: Promoción de 3-D agregación de células epiteliales del timo FACS purificada con EAK 16-II / EAKIIH6 auto-montaje de hidrogel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Aprende a promover la agregación tridimensional de células epiteliales del timo usando péptidos EAK16-II/EAKIIH6 en hidrogel biodegradable. Este método mejora la supervivencia celular y avanza la bioingeniería del timo.

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Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones R21 AI113000 (WSM) y R01 AI123392 (YF).

Todos los animales utilizados en los experimentos fueron alojados en las instalaciones de animales en Allegheny-Singer Research Institute bajo el protocolo revisado y aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional del / Allegheny cantante Instituto de Investigación de la Red de Salud de Allegheny. 1. Digerir el timo con colagenasa <ol><li> timo cosecha. <ol><li> La eutanasia a los ratones de 3-5 semanas de edad C57BL6 / J en un dióxido de carbono (CO 2) de cámara para cosechar timo. En detalle, colocar los ratones en la cámara bajo CO 2 de inducción para 3-5 min y confirmar la muerte mediante la verificación de paro cardíaco o respiratorio. </li><li> Coloque la carcasa en su parte posterior y humedecer el cuerpo con un 70% de etanol. Hacer una pequeña incisión horizontal con un agudo, tijeras de disección rectas en su abdomen a través de la piel. Tire de la piel en ambos extremos (cabeza y piernas) de manera que se vuelve del revés. </li><li> Haga un corte horizontal con las tijeras de disección poco menos dela última costilla y se corta a través del diafragma hacia los lados. Mantenga la apófisis xifoides con un fórceps y cortar el medio de las costillas procedentes arriba en ambos lados. Tire hacia arriba de las costillas / esternón para que el timo es claramente visible. Nota: timo se encuentra directamente encima del corazón, consta de 2 lóbulos y es de un color blanco translúcido. </li><li> Usando unas pinzas curvas, suavemente y tire de la cucharada de los lóbulos del timo fuera del tejido y la transferencia de solución de lavado conectivo (ver Lista de Materiales). </li></ol></li><li> Preparar la solución de la digestión mediante la mezcla de 9 ml de RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute-medio 1640), 0,025 mg / ml de colagenasa purificada, HEPES 10 mM [4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico], y 0,2 mg / ml DNasa I en un tubo de centrífuga de 50 ml. Mantener la solución de digestión en 37 ° C baño de agua hasta su uso. Nota: La cantidad de la solución de digestión preparado es suficiente para timos ratón hasta cinco adultos, que se pueden incubar en un solo redonda poliestireno 5 mltubo inferior. </li><li> Transferir el timo a una placa de cultivo de tejidos de 60 mm que contiene 5-6 ml RPMI-1640. </li><li> Diseccionar el timo con 28 g aguja de la jeringa de insulina en trozos pequeños (alrededor de 1 mm cuadrado 3) para permitir que los linfocitos fluyen hacia fuera. </li><li> Enjuague las piezas del timo con RPMI-1640 que está en la placa de Petri con pipeta Pasteur de vidrio. Inclinar el plato y dejar que los fragmentos del timo depositan en el fondo. Lentamente Aspirar y descartar el sobrenadante RPMI-1640 usando una pipeta de vidrio. Repita este paso de enjuague con 5-6 ml de RPMI-1640 para 4-5 veces con pipeta de vidrio hasta que la solución es menos opaco. Nota: pipetas de vidrio se recomiendan en este paso, ya que los fragmentos del timo tienden a pegarse al plástico, lo que resulta en una pérdida excesiva de los tejidos del timo. Para el resto del procedimiento, utilizar pipetas de plástico. </li><li> Después del enjuague final, descartar el sobrenadante como se describe en el paso 1.5. Añadir solución de digestión 3 ml y transferir las piezas del timo y la solución en un 5 ml de fondo redondo de polystyrene tubo. </li><li> Se coloca el tubo en un mezclador de tubo y se incuba a 37 ° C durante 6 min a una velocidad de rotación de 12 rpm. </li><li> Después de la incubación, dejar que los fragmentos de timo se depositan en el fondo del tubo por gravedad. Recoger el sobrenadante con pipeta Pasteur y transferir a un tubo de centrífuga de 50 ml con 10 ml de solución de lavado. Centrifugar a 300 xg durante 5 min, descartar el sobrenadante y resuspender las células en solución de lavado 10 ml. Mantener en hielo. </li><li> Repita los pasos 1.6-1.8 dos veces en los fragmentos del timo en los 5 ml de tubos de poliestireno de fondo redondo. En común el sobrenadante en el mismo tubo 50 ml. Nota: La centrifugación no es necesario que el segundo y el tercer lavado. </li><li> Después de la digestión final, pipetear hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica de plástico de 2 ml para descomponer los fragmentos que quedan en el tubo y la transferencia al tubo de centrífuga de 50 ml. </li><li> Centrifugar el tubo 50 ml a 300 xg durante 5 min, aspirar el sobrenadante, resuspender en 10 ml de lavado buffer y filtro a través del tamiz de 100 micras de células. Mantener en hielo. </li></ol> 2. El enriquecimiento de TEC con gradiente de densidad discontinuo <ol><li> Preparar la solución de gradiente de densidad de 21% mediante la mezcla de medio 2.4 ml de gradiente de densidad (60% w / v de iodixanol en agua) y solución de lavado 9,6 ml. </li><li> Centrifugar las células tímicas disociadas en el tubo de 50 ml de recogida desde el paso 1,11 a 300 xg durante 5 min y se resuspenden en tampón de 2,5 ml de lavado. </li><li> Añadir medio de 20 ml de RPMI-1640 a la suspensión celular. </li><li> Llenar 12 ml de solución de gradiente de densidad de 21% en una pipeta serológica de 10 ml con una pipeta electrónica. Coloque la punta de la pipeta serológica en la parte inferior de los 50 ml células tubo de centrífuga que contienen, y permita que la solución de gradiente de densidad para drenar a la parte inferior del tubo a través de la gravedad. <ol><li> expulsar suavemente la solución de gradiente de densidad a partir de la pipeta para terminar la generación de las dos capas de diferentes densidades. </li></ol></li><li> Centrifugar a 600 xg for 20 min a TA en un rotor oscilante-cubo. Ajuste la velocidad de desaceleración en el nivel más lento. </li><li> La transferencia de la capa superior y la interfaz para un nuevo tubo de 50 ml. Nota: La mayoría de los TEC se retienen en la interfaz. Los linfocitos precipitarán a la parte inferior del tubo después de la centrifugación. Si estas células se van a utilizar para otros fines, enjuagar el sedimento con una solución de lavado de 20 ml por tres veces. Resuspender las células en 10 ml de tampón de lavado. </li><li> Añadir solución de lavado hasta 40 ml al tubo en el paso 2.6 y centrifugar a 400 g durante 6 min a 4 ° C. Para eliminar el sobrenadante, aspirado con una pipeta. </li><li> Repetir el lavado y la aspiración 2 veces más como se describe en el paso 2.7. </li><li> Volver a suspender en 2 ml de solución de lavado y el recuento de las células con un hemocitómetro. </li></ol> 3. Aislamiento de TEC con FACS <ol><li> Ajustar las células de la etapa 2.9 a una concentración de 1x10 6 células / 100 l con solución de lavado y la transferencia delas células a un tubo de 5 ml de fondo redondo (polipropileno o poliestireno, según lo recomendado por las instrucciones del clasificador de flujo). </li><li> Añadir 2 l anti-Fc de IgG receptor por 1x10 6 células y se incuba a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Añadir anti-CD45 (dilución 1: 150, 10 l por muestra) y anti-EpCAM (1: 100 dilución, 10 l por muestra) anticuerpos y se incuba a 4 ° C durante más de 20 min. </li><li> Lavar las células con solución de lavado 2 ml y centrifugar a 400 xg durante 6 minutos a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante con una pipeta. </li><li> Resuspender las células en 1 solución salina tamponada con fosfato 1x ml (PBS). </li><li> Filtrar a través de filtro de 100 micras. </li><li> Aplicar las células en el instrumento de clasificación. Seleccione la población de linfocitos y TEC excluyendo las células más pequeñas de la luz dispersada lateral (SSC) / luz dispersada hacia adelante (FSC) panel (células muertas), entonces la puerta en la población seleccionada para CD45- EpCAM + 13 para la clasificación. </li></ol> 4. Generation de TEC / Agregados EAK Nota: Realizar la preparación de los reactivos y etapas que implican la mezcla bajo el capó laminar celular. <ol><li> Preparar pA / G complejos adaptador mediante la mezcla de 4 l de anti-His-tag IgG, 8 l de anti-EpCAM IgG y 2,6 l de pA / G en un tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 ml, y se incuba a TA durante 5 min. </li><li> Ajuste los TECs según de la etapa 3.7 para 5x10 4 células / ml con solución de lavado, y pipeta de 100 l a un pocillo de una evaporación bajo, de 96 pocillos de fondo redondo de la placa de cultivo de tejidos. Añadir 14,6 l complejos adaptador pA / G a las células. Colocar la placa en una plataforma de agitación durante 20 minutos a 4 ° C. </li><li> Lavar una vez con 200 l de solución de lavado. Centrifugar la placa a 400 xg durante 6 minutos. Descartar el sobrenadante con una micropipeta. </li><li> Lavar una vez con solución de sacarosa 200 l 10%. Centrifugar a 400 xg durante 6 minutos. Descartar el sobrenadante con una micropipeta. </li><li> Resuspender las células en 30 l 10% ssolución de sacarosa terile por pocillo. </li><li> Añadir 10 l de EAKIIH6 (7,5 mg / ml) y se incuba durante 5 min a TA. </li><li> Añadir 20 l de EAK16-II (10 mg / ml) a la mezcla de TEC. </li><li> Añadir 100 ml de medio completo al sistema para iniciar la gelificación. Colocar la placa en un agitador de plataforma durante 15-20 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Colocar la placa en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO2. Después de 2-4 horas, añadir otros 100 l de medio completo. </li><li> Cambio de medio cada dos días hasta su uso. <ol><li> Aspirar 100 l de medio a partir de la superficie sin alterar el gel utilizando una micropipeta y añadir suavemente 100 l de medio de pre-calentado mediante la colocación de la punta de pipeta a la pared del pozo. </li></ol></li></ol> 5. Caracterización de los TEC / EAK Agregados <ol><li> Para examinar la función de los agregados TEC / EAK in vivo, recoger el TEC / hidrogel EAK después de O cultura / N y el trasplante bajo la cápsula renal de un nude atímicosratón, utilizando descrito previamente procedimiento 11,14. </li><li> Supervisar el desarrollo de las células T en la periferia por la recolección de muestras de sangre de 50-100 l en el tubo de recogida de sangre que contiene EDTA-de los ratones desnudos 4-6 semanas después del trasplante y las manchas con un cóctel de anticuerpos anti-CD4, -CD8, -CD45 y CD3 anticuerpos 12. </li><li> Analizar los porcentajes de linfocitos T en los leucocitos de sangre periférica con citometría de flujo (FCM), utilizando software de análisis sola célula 12. </li></ol>

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Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Mientras TEC son la población predominante del estroma del timo y desempeñan papeles esenciales para la estructura y función de las glándulas del timo, que representan sólo alrededor del 0,1-0,5% de la celularidad del timo total. También son células frágiles como se observan ocasionalmente altos porcentajes de muerte de las células después de la digestión de la colagenasa, es decir, el tratamiento para disociar TECs de la matriz extracelular (ECM). Su rareza (~ 200.000 por el timo del ratón) y la fragilidad hiz...

El timo es el órgano linfoide primario responsable de la generación de una población diversa de células T a patógenos reactiva, la auto-tolerancia que es esencial para la función del sistema inmune adquirido. Es un órgano dinámico en el que los timocitos en desarrollo, emigraron de la médula ósea como células de linfocitos progenitoras, migran a través del tridimensional (3-D) de la matriz de tipo esponja del estroma tímico, someterse a linaje de especificación y diferenciación, y, finalmente emigrar como células T maduras. El éxito de este proceso bien programada depende en gran medida de la diafonía entre los timocitos que migran y las células epiteliales del timo residenciales (TEC), la población predominante del estroma tímico que son esenciales para el establecimiento y el mantenimiento de la integridad del microambiente del timo. Sobre la base de su localización anatómica y la función única, TEC se puede dividir en dos subgrupos: los TECs en la corteza (CTEC) que son responsasable de la selección de auto-MHC (complejo principal de histocompatibilidad) limita las células T (selección positiva), y los TEC en la médula (mTECs) que son esenciales para la eliminación de las células T autorreactivas (selección negativa) 1,2. Muchos factores (por ejemplo, el envejecimiento, la infección, la irradiación, los tratamientos de drogas) pueden causar daños irreversibles en el epitelio tímico, dando como resultado la inmunidad adaptativa comprometida. A pesar de los numerosos intentos, la restauración de la función del timo ha sido difícil debido a la dificultad para reproducir el microambiente tímico. En particular, la configuración del timo tridimensional (3-D) es crítico para la supervivencia y la función de TECs, mientras que TECs cultivadas en un entorno de 2-D disminuir rápidamente la expresión de genes críticos para la timopoyesis 3,4. EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) y su análogo histidinylated C-terminal EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) son de bajo peso molecular, oligopéptidos anfifílicas que son solubles a finales desionizadar, pero someterse a la gelificación para formar ß-fibrillas cuando se expone a una fuerza iónica superior a NaCl 20 mM (concentración normal de sal en el fluido corporal humano es 154 mM). Esta propiedad de respuesta del medio ambiente los hace versátiles bloques de construcción para formar estructuras 3D. La etiqueta de His en EAKII-H6 proporciona un mecanismo de acoplamiento, por el que los anti-Sus IgG / Fc de unión a proteína recombinante A / G (αH6: pA / G) complejos pueden servir como un adaptador para anclar fármacos de proteínas y otras biomoléculas ( por ejemplo, anticuerpos) en el compuesto de hidrogel 5-8. Hemos demostrado previamente que las moléculas marcadas con fluorescencia IgG anclados en el hidrogel pueden ser retenidos en el lugar de la inyección durante un máximo de 13 días 9. Además, cuando los αH6: se añadieron adaptadores de pA / G anclados con anti-CD4 IgG al hidrogel EAK16-II / EAKIIH6 (EAK), las células T CD4 + fueron capturados específicamente 10. Usando técnica similar, hemos demostrado recientemente que la 3-D agregación de TECs cOuld ser promovido en EAK hidrogel con complejos adaptadores que llevan anticuerpos anti-EpCAM-TEC específica (αH6: PA / G: αEpCAM). Cuando se trasplantan debajo de las cápsulas renales de ratones desnudos, los grupos TEC incrustados en hidrogel EAK pueden apoyar eficazmente el desarrollo de las células T funcionales in vivo 11,12. Aquí ilustramos nuestro método para purificar rápida y eficazmente TEC con células activadas por fluorescencia (FACS) y generar agregados TEC 3-D con el sistema EAK hidrogel.

<table><tbody><tr><td>TEC Isolation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701 (1 galón)</td><td>Etanol 200 a prueba, agua desionizada</td></tr><tr><td>Tijeras de disección, rectas</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Graefe, rectas</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>11053-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Graefe, curvadas</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Solución</td><td></td><td></td> de lavado <td>1x PBS, 0.1% BSA, 2&nbsp; mM EDTA</td></tr><tr><td>1x PBS (solución salina tamponada con fosfato)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Albúmina sérica bovina)</td><td>Sigma</td><td>A1470-100G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (ácido etilendiaminotetraacético)</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Solución</td><td></td><td></td> de digestión <td>9 ml RPMI-1640, 0,025&nbsp; mg/ml Liberase TM Grado de investigación, 10&nbsp; mM HEPES, 0,2&nbsp; mg/ml DNaseI</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM Grado de investigación</td><td>Roche</td><td>05 401 127 001</td><td>denominado "colagenasa purificada"</td></tr><tr><td>1&nbsp; M HEPES</td><td>Lonza</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>10 104 159 001</td><td></td></tr><tr><td>50&nbsp; ml Tubo de centrífuga</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>60&nbsp; placa de cultivo de tejidos en mm</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>1/2&nbsp; cc U-100 Jeringa de insulina 28&nbsp; 1/2&nbsp; G</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>5&nbsp; ml Tubo de poliestireno de fondo redondo</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>5&nbsp; ml pipeta de vidrio</td><td>Fisher Healthcare</td><td>13-678-27E</td><td>Úselo para enjuagar los fragmentos tímicos. Los fragmentos tímicos tienden a adherirse a la pared con pipetas de plástico.</td></tr><tr><td>Rotador de tubos MACSmix</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>100&nbsp; y micro; m Filtro de células</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Medio de gradiente de densidad: OptiPrep</td><td>Axis-Shield</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Sorting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&nbsp; ml Tubo de polipropileno de fondo redondo</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratón CD16/CD32 (Fc Block)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>Usar sin diluir, 2&nbsp; y micro; l por muestra</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD45-PercpCy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0451-80</td><td>Uso a 1:150, 10&nbsp; y micro; l por muestra</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD326 (EpCAM)-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5791-82</td><td>Uso a 1:100, 10&nbsp; y micro; l por muestra</td></tr><tr><td>BD Influx</td><td>BD Biosciences Software de análisis de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>célula única</td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EAK Gel Assembly</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-His-Tag</td><td>AnaSpec</td><td>29673</td><td>"anti-His-Tag IgG"</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD326 (EpCAM)</td><td>BioLegend</td><td>118202</td><td>"anti-EpCAM IgG"</td></tr><tr><td>Proteína recombinante A/G</td><td>Pierce Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5&nbsp; ml Tubos Safe-Lock, Biopur, estéril</td><td>Fisher Healthcare</td><td>05-402-24B</td><td>denominado "1.5&nbsp; ml tubo de microcentrífuga"</td></tr><tr><td>96 pocillos, Placa de cultivo de tejidos, Fondo redondo con tapa de baja evaporación</td><td>BD Falcon</td><td>353917</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma oscilante: Mezclador Nutator n.º 1105</td><td>BD Clay Adams</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% sacarosa</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>Preparar con agua destilada estéril</td></tr><tr><td>EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAAKAK-CONH2)</td><td>American Peptide Company& nbsp;</td><td></td><td>sintetizado personalizado, 10&nbsp; mg/ml</td></tr><tr><td>EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAEAEAEAAKAKHHHHHH-CONH2)</td><td>Compañía Americana de Péptidos&nbsp;</td><td></td><td>sintetizado personalizado, 7.5&nbsp; mg/ml</td></tr><tr><td>Medio</td><td></td><td></td> completo <td>RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Estreptococo, 1% L-glutamina, 1% NEAA, 5&nbsp; mM HEPES, 50&nbsp; y micro; M 2-Mercaptoetanol</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Suero fetal bovino)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>Calor inactivado antes de usar</td></tr><tr><td>Pluma/Estreptococo</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 200&nbsp; mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>NEAA (aminoácido no esencial) 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>1&nbsp; M HEPES</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol (100x)</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de plataforma: The Belly Dancer</td><td>Stovall Life Sciences Inc.</td><td>modelo: USBDbo</td><td></td></tr></tbody></table>

promoción de 3-d agregación de células epiteliales del timo facs purificada con eak 16-ii / eakiih6 auto-montaje de hidrogel

Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel

La involución del timo, asociada con el envejecimiento o lesiones patológicas, resulta en una disminución de la producción de células T maduras. Restaurar la función de un timo defectuoso es crucial para mantener una respuesta inmunitaria adquirida mediada por células T eficaz contra los patógenos invasores. Sin embargo, la regeneración y revitalización del timo resultó ser un desafío, en gran parte debido a las dificultades de reproducir el microambiente 3D único del estroma tímico que es fundamental para la supervivencia y la función de las células epiteliales tímicas (TEC). Desarrollamos un novedoso sistema de hidrogel para promover la formación de agregados TEC, basado en la propiedad de autoensamblaje de los oligopéptidos anfifílicos EAK16-II y su análogo histidinilado EAKIIH6. Las TEC se enriquecieron a partir de células tímicas aisladas con gradiente de densidad, se clasificaron con clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y se marcaron con anticuerpos anti-molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM) que se anclaron, junto con IgG anti-His, en los complejos adaptadores de proteína A/G. La formación de agregados celulares se promovió mediante la incubación de TEC con EAKIIH6 y oligopéptidos EAK16-II, y luego mediante el aumento de la concentración iónica del medio para iniciar la gelificación. Los agregados de TEC incrustados en el hidrogel EAK pueden promover eficazmente el desarrollo de células T funcionales in vivo cuando se trasplantan a ratones desnudos atímicos.

Para examinar la eficacia de la utilización del protocolo de separación por gradiente de densidad para enriquecer las células del estroma CD45-, las células cosechadas a partir de la interfaz y los gránulos de linfocitos precipitados se tiñeron con anticuerpos anti-EpCAM anti-CD45 y. Tanto anti-Ulex europaeus aglutinina 1 (UEA1) y anticuerpos anti-MHC de clase II también se incluyeron en el cóctel de tinción para identificar mejor los subconjuntos ctec y Mtec. Como se muestra en la <stro...

Este video muestra un protocolo para enriquecer células epiteliales tímicas (TEC) con gradiente de densidad para el aislamiento de FACS. También muestra el uso de péptidos EAK16-II/EAKIIH6 para promover la formación de agregados TEC. Los microambientes del hidrogel EAK16-II/EAKIIH6 proporcionan la configuración 3D necesaria para mantener la supervivencia y la función de los TEC.

Promoción de 3-D agregación de células epiteliales del timo FACS purificada con EAK 16-II / EAKIIH6 auto-montaje de hidrogel

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar el uso del péptido EAK 16-II/EAKIIH6 para promover la agregación de células epiteliales tímicas en una estructura tridimensional para apoyar la autosupervivencia y la función del epitelio tímico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la bioingeniería del timo. Las principales ventajas de esta técnica es que utiliza el péptido EAK-16-II/EAKIIH6, promueve la agregación de células epiteliales tímicas, es biodegradable y tiene el potencial de ser utilizada para inyecciones.Para cosechar el timo, comience colocando un ratón C57 negro 6J de tres a cinco semanas de edad en posición supina y humedezca el cabello con etanol al 70%. Con unas tijeras de disección afiladas y rectas, haga una pequeña incisión horizontal a través de la piel abdominal. A continuación, tire de la piel de ambos lados de la incisión para exponer la cavidad abdominal.A continuación, haz un corte horizontal justo debajo de la nervadura más baja y corta hacia los lados hasta el diafragma. Con pinzas, jala la apófisis xifoides y corta a través de la mitad de las costillas a lo largo de ambos lados del pecho. Levanta las costillas y el esternón para que el timo sea claramente visible.Luego, con una pinza curva, saque suavemente los lóbulos del timo del tejido conectivo y colóquelos en una solución de lavado. Después del enjuague, transfiera el timo a una placa de cultivo de tejido de 16 mililitros que contenga de cinco a seis mililitros de RPMI 1640 y use una aguja de insulina de calibre 28 para diseccionar el tejido en piezas cuadradas de aproximadamente un milímetro cúbico. A continuación, utilice una pipeta pasteur de vidrio para enjuagar los fragmentos de tejido con el medio en el plato.Luego, inclina el plato, dejando que los fragmentos se asienten en el fondo. Retire lentamente el sobrenadante medio por aspiración. Luego repita el lavado cuatro o cinco veces más con cinco a seis mililitros de medio fresco cada vez hasta que la solución se vuelva menos opaca.Después del lavado final, agregue tres mililitros de solución de digestión al plato y transfiera los trozos de timo y la solución a un tubo de poliestireno de fondo redondo de cinco mililitros. Incubar los tejidos en un tubo rotador a 37 grados centígrados durante seis minutos a 12 rpm. Al final de la rotación, deje que los fragmentos se depositen en el fondo del tubo y use una pipeta pasteur para transferir el sobrenadante a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de solución de lavado.Centrifugar el sobrenadante y resuspender las células en 10 mililitros de solución de lavado fresca sobre hielo. Luego digiere los fragmentos tímicos dos veces más en el rotador como se acaba de demostrar, tirando del sobrenadante en el mismo tubo de 50 mililitros. Después de la digestión final, utilice una pipeta serológica de plástico de dos mililitros para triturar los fragmentos restantes y transferir la ráfaga de tejidos al tubo de 50 mililitros.Gire el tubo para recoger las células y vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de tampón de lavado. Luego, filtre las células a través de un colador de 100 micras mientras el tubo se coloca en hielo. Para enriquecer las células epiteliales tímicas, vuelva a centrifugar las células y vuelva a suspender el pellet en 2,5 mililitros de tampón de lavado.A continuación, añada 20 mililitros de RPMI 1640 a las células y utilice una pipeta serológica de 10 mililitros para colocar cuidadosamente 12 mililitros de solución de gradiente de densidad del 21% recién preparada debajo de las células por gravedad. Ahora, separe las celdas por centrifugación en un rotor de cangilón oscilante a la tasa de desaceleración más lenta. Al final de la centrifugación, transfiera la capa superior y la interfaz a un nuevo tubo de 50 mililitros y agregue hasta 40 mililitros de solución de lavado a las celdas.Eliminar el gradiente de densidad mediante tres centrifugaciones consecutivas utilizando una pipeta para aspirar el sobrenadante después de cada lavado. A continuación, vuelva a suspender el pellet final en dos mililitros de solución de lavado para contar. Para generar los agregados EAK de células epiteliales tímicas, ajuste las células epiteliales tímicas a una dilución de cinco veces 10 a cuatro células por mililitro en solución de lavado y siembre 100 microlitros de células por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de baja evaporación de 96 pocillos, fondo redondo.A continuación, añada 14,6 microlitros de complejos adaptadores de proteína AG recién preparados a cada pocillo y coloque la placa sobre una plataforma oscilante a cuatro grados centígrados. Después de 20 minutos, lavar las células con 200 microlitros de solución de lavado por pocillo, utilizando una micropipeta para eliminar el sobrenadante. A continuación, lavar las células de nuevo con 200 microlitros de solución de sacarosa al 10%.Vuelva a suspender los pellets en 30 microlitros de solución de sacarosa estéril al 10% por pocillo. Luego, incuba las células en 10 microlitros de EAKIIH6 durante cinco minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, agregue 20 microlitros de EAK 16-II, seguidos de 100 microlitros de medio completo y coloque la placa en una plataforma a temperatura ambiente para iniciar la gelificación.Después de 15 a 20 minutos, transfiera la placa a una incubadora de 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante dos a cuatro horas. Luego agregue otros 100 microlitros de medio completo y devuelva la placa a la incubadora. Para cambiar el medio, use una micropipeta para aspirar 100 microlitros del medio de la superficie de los cultivos sin alterar el gel y coloque la punta contra las paredes de cada pocillo para sembrar los cultivos con 100 microlitros de medio precalentado.Utilizando el protocolo de separación por gradiente de densidad, como se acaba de demostrar, las células estromales negativas CD45 pueden enriquecerse de forma rutinaria de 15 a 20 veces, como se ilustra en estos diagramas de puntos representativos. Aquí, los agregados de células epiteliales tímicas, preparados a partir de ratones transgénicos que expresan fluorescencia roja de cuatro semanas de edad, como se acaba de demostrar, se cultivaron in vitro durante dos días y se examinaron mediante microscopía confocal. Una vez dominadas, las células epiteliales tímicas pueden enriquecerse para la clasificación del flujo en tres o cuatro horas.Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la ingeniería de tejidos del timo desarrollaran unidades de minitimo inyectables y funcionales para modular el sistema inmunitario adaptativo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este video la preparación de 2-dGuo tratados reaggregate culturas timo se demuestra.

Reaggregate Culturas del timo

Se presentan los protocolos de 3 dimensiones (3D) en la encapsulación de células dentro de los hidrogeles sintéticos. El procedimiento de encapsulación, se destaca por dos métodos utilizados para el entrecruzamiento (michael-tipo y además iniciada por la luz los mecanismos de los radicales libres), así como una serie de técnicas para evaluar el comportamiento de células encapsuladas.

La encapsulación celular en hidrogeles 3D para ingeniería de tejidos

A continuación se describe el uso de un auto-montaje de andamios de 3 dimensiones para cultivo de células progenitoras neurales humanas. Se presenta un protocolo para liberar las células de los andamios para ser analizados posteriormente por ejemplo, mediante citometría de flujo. Este protocolo puede ser adaptado a otros tipos de células para llevar a cabo estudios detallados de manera mecánica.

Cultivo de Células progenitoras neurales en un hidrogel de péptidos 3-dimensional de auto-montaje

El siguiente protocolo proporciona técnicas para encapsular las células β del páncreas en PEG-péptido crecimiento paso a hidrogeles formados por tiol-eno clic en la foto-reacciones. Esta plataforma de material no sólo ofrece un microambiente citocompatible para encapsulación de células, sino que permite también controlada por el usuario rápida recuperación de las estructuras celulares formadas dentro de los hidrogeles.

Generación y Recuperación de β-células esferoides de PEG-péptido de crecimiento Paso hidrogeles

Para la creación de estructuras altamente organizadas de tejido complejo, se deben ensamblar múltiples tipos de materiales y células en un compuesto integrado.  Este diseño combinatorio incorpora láminas de células estratificadas específicas de órganos con dos materiales distintos derivados de la biología que contienen una fuerte base de matriz fibrosa y células endoteliales para mejorar la formación de nuevos vasos.

Ingeniería de tejidos: Construcción de un multicelular 3D Andamios para la entrega de láminas de células en capas

El estudio de las células epiteliales tímicas medulares in vitro ha sido en gran medida infructuoso, ya que los sistemas de cultivo 2D actuales no imitan el escenario in vivo. El sistema de cultivo 3D descrito en este documento, un modelo de cultivo organotípico de piel modificada, ha demostrado ser superior en la recapitulación de la proliferación de mTEC, la diferenciación y el mantenimiento de la expresión génica promiscua.

3D organotípicos Co-cultura de apoyo medular tímica epitelial proliferación celular, la diferenciación y la Expresión Génica Promiscuo Modelo

Hidrogeles de ingeniería de la proteína recombinantes son ventajosos para el cultivo celular 3D ya que permiten completa afinabilidad de la espina dorsal del polímero y por lo tanto, el microambiente de la célula. Aquí, describimos el proceso de purificación de proteína recombinante como elastina y su aplicación en la encapsulación de la célula de hidrogel 3D.

Producción de la proteína elastina como hidrogeles para encapsulación y el Immunostaining de células en 3D

Este protocolo demuestra el uso de un canal microfluídico con geometría cambiante a lo largo de la dirección del flujo de fluido para generar tensión extensional (estiramiento) para alinear fibras en un hidrogel de colágeno 3D (&lt;250 μm de espesor). La alineación resultante se extiende a lo largo de varios milímetros y está influenciada por la velocidad de deformación extensional.

Microingeniería de hidrogeles de colágeno 3D con alineación de fibras de largo alcance

Este artículo describe cómo bioimprimir hidrogeles fotoajustables en 3D para estudiar el endurecimiento de la matriz extracelular y la activación de fibroblastos.

Bioimpresión 3D de hidrogeles fotoajustables para estudiar la activación de fibroblastos

Aquí, describimos un protocolo para la formación de organoides de timo derivados de iPSC humanos cultivados en hidrogeles de fibrina 3D con el objetivo de apoyar la maduración y el mantenimiento prolongado de las células epiteliales tímicas (TEC), así como la timopoiesis in vitro.

Formación de organoides de timo humano en hidrogeles de fibrina tridimensionales

Aprende a promover la agregación tridimensional de células epiteliales del timo usando péptidos EAK16-II/EAKIIH6 en hidrogel biodegradable. Este método mejora la supervivencia celular y avanza la bioingeniería del timo.

Promoción de 3-D agregación de células epiteliales del timo FACS purificada con EAK 16-II / EAKIIH6 auto-montaje de hidrogel

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