Un modelo murino de isquemia retiniana-reperfusión mediante la elevación de la presión intraocular

El objetivo general de esta técnica es proporcionar un modelo experimental de la lesión por isquemia-reperfusión retiniana y sus consecuencias patológicas. Este método se utiliza habitualmente para investigar los mecanismos subyacentes a la isquemia-reperfusión retiniana, así como para evaluar posibles enfoques terapéuticos para el tratamiento de patologías asociadas. La principal ventaja de esta técnica es que crea una lesión muy dirigida a las estructuras oculares, a la vez que causa un daño mínimo a los tejidos circundantes.

La utilidad de esta técnica se extiende hacia la comprensión y tres meses de las múltiples manifestaciones de la Isquemia-Reperfusión de la Retina, incluyendo: inflamación, estrés oxidativo y disfunción de la mirada fija en la unidad neurovascular de la retina. La demostración en video de este método es fundamental porque las técnicas quirúrgicas para la colocación de cánulas pueden ser difíciles de reproducir sin una guía visual. Antes de comenzar el procedimiento, caliente una jaula vacía sobre la mesa.

A continuación, inserte el extremo afilado del tubo del sitio Y preperforado del conjunto primario en un frasco de heparina sódica al 0,1 % y cuelgue la parte inferior de la heparina sódica de una extensión del poste intravenoso. Abra a presión la tapa del filtro de aire en el tubo. A continuación, eleve el frasco de heparina sódica a 163 centímetros desde la mesa hasta el pico del goteo de heparina sódica, para producir una presión de flujo de heparina sódica de 120 mililitros de mercurio.

Abra el tubo del sitio Y preperforado del conjunto primario, para permitir que la heparina sódica llene el tubo, y conecte el tubo del sitio Y preperforado del conjunto primario al colector de cinco válvulas. Luego, usando accesorios de tubo Luer macho a Luer macho, conecte agujas de media pulgada de calibre 30 al colector de cinco puertos. Inserte cada una de las agujas en su propio segmento de diez pulgadas de tubo de calibre 30.

Luego, usando hemostáticos, rompa las nuevas puntas de aguja de media pulgada de calibre 30 e inserte sus extremos romos en los extremos abiertos del tubo de calibre 30. A continuación, use cinta adhesiva para colocar los tubos de la aguja de manera que los tubos conectados a los puertos internos se coloquen encima de los tubos conectados a los puertos exteriores para evitar que se enreden los tubos durante la canulación de la cámara anterior. Ahora, encienda el flujo de heparina sódica al 0,1% al colector de cinco válvulas y a cada puerto individual durante dos o tres minutos para eliminar las burbujas de aire.

A continuación, apague todos los puertos del colector de cinco válvulas. Para realizar la canulación, después de administrar la anestesia, coloque a todos los ratones en la jaula tibia sobre la mesa de cirugía, confirmando el logro de la anestesia profunda por falta de respuesta al pellizco del dedo del pie después de cinco a diez minutos. A continuación, administre una gota de tropicamida para la dilatación de la pupila y una gota de proparacaína para la anestesia local en cada uno de los ojos de los animales, y disponga los ratones en el orden de anestesia, de modo que el primer ratón anestesiado sea el primer ratón en ser canulado.

Mientras espera que las gotas para los ojos hagan efecto, prepare trozos rectos de cinta adhesiva de cuatro pulgadas, tirando firmemente de la cinta antes de rasgarla y apartando un trozo de cinta por animal. Tenga en cuenta que si no se tira con fuerza de la cinta, la cinta se curvará. Cuando el primer ratón esté listo, coloque al animal bajo un microscopio quirúrgico.

Luego, encienda el primer puerto de heparina sódica al 0.1% en el colector de cinco válvulas y use un par de pinzas para proposcar suavemente un ojo. A continuación, inserte la aguja de la cánula de calibre 30 en la cámara anterior aproximadamente a medio camino entre las fibras zonulares y el ápice de la córnea. Teniendo cuidado de no penetrar en la conrea por segunda vez.

Tenga en cuenta que se utiliza un suave movimiento de torsión para insertar la cánula profundamente en la cámara anterior. Ahora, presione el tubo de calibre 30 contra la mesa para minimizar cualquier movimiento de la cánula insertada mientras alcanza un trozo de cinta adhesiva, y use la cinta para asegurar el tubo a la mesa. Una vez que se haya asegurado el tubo, registre la hora de inicio de la cirugía.

Utilice el microscopio para verificar que no haya fugas y que el ojo de isquemia-reperfusión sea más grande que el ojo contralateral, para establecer la presencia de distensión ocular. A continuación, se aplica hidromelosa en ambos ojos cada 30 minutos, hasta el final del experimento para lubricar la córnea y sellar las microfugas. Si un animal se mueve durante el procedimiento, levante la cola y administre un refuerzo de ketamina por vía intraperitoneal.

90 minutos después de canular el primer animal, retire suavemente la cánula de la cámara anterior y lubrique ambos ojos con gelatina lubricante. A medida que se retiran las cánulas subsiguientes, vuelva a colocar cada ratón en la jaula de la mesa quirúrgica, hasta que los animales se recuperen por completo. Una vez que se hayan retirado todas las cánulas, desinféctelas con toallitas con alcohol.

A continuación, utilice una jeringa de 60 mililitros llena de aire para expulsar la heparina sódica del colector de cinco válvulas, las agujas de calibre 30, el tubo de calibre 30 y las cánulas. A continuación, enjuague todos los instrumentos con una jeringa de 60 mililitros llena de agua destilada. Por último, expulse el agua destilada de todos los materiales con 60 mililitros de aire, y guarde el equipo desinfectado y enjuagado para su uso posterior.

El inmunomarcaje de los núcleos neuronales con NeuN revela una pérdida significativa de células nuronales, después de la agresión por isquemia-reperfusión, mediante imágenes microscópicas confocal, siete días después de la lesión por isquemia-reperfusión. De hecho, la cuantificación manual de las células NeuN positivas en el control, y los ojos reperfundidos con isquemia, demuestra una disminución en el recuento de neuronas de la capa de células gangeliónicas después de la lesión, lo que indica la presencia de muerte celular inducida por isquemia-reperfusión. Las amplitudes más bajas de las ondas a y b documentadas por electrorretinografía también significan la aparición de alteraciones inducidas por isquemia-reperfusión en la función neuronal de la retina en comparación con los ojos de control no lesionados.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en diez animales en aproximadamente cinco horas, incluidas las dos últimas horas que se pasan esperando que los ratones se recuperen de la anestesia. Al intentar este procedimiento, es importante mantener la anestesia profunda. Como sedación eficaz se evitará el desplazamiento de la cánula por el movimiento del animal.

Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la electrorretinografía, para responder preguntas adicionales sobre la función de la retina. Esta técnica ha permitido a los investigadores en los campos de la oftalmología, la neurociencia y la biología vascular explorar la patogénesis de la retina neurovasular y la intervención terapéutica en roedores. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo crear una lesión retiniana específica, a través de la canulación de la cámara anterior ocular.

No olvide que trabajar con instrumentos quirúrgicos puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como el uso de un desechador eficaz de objetos punzantes, al realizar este procedimiento.