Name: El estudio de la Organización Supramolecular de membranas fotosintéticas dentro de los tejidos foliares fracturados-Freeze por Cryo-Microscopía Electrónica de Barrido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 52 s
Description: Aprende a estudiar la organización supramolecular de membranas fotosintéticas en tejidos foliares mediante criomicroscopía electrónica de barrido de muestras congeladas por alta presión y fracturadas.

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Agradecemos a Andrés Kaech (Universidad de Zurich) por sus útiles consejos sobre el escaneo de imágenes de microscopía electrónica. Este trabajo fue apoyado por el Fondo de los Estados Unidos e Israel Binacional de Investigación Agrícola y Desarrollo (concesión no. US-4334-10, ZR), la Fundación de Ciencias de Israel (concesión no. 1034/12, ZR), y el Human Frontier Science Program (RGP0005 / 2013, ZR). Se llevaron a cabo los estudios de microscopía electrónica en el Irving Moskowitz y Cherna Centro de Nano y Bio-Imaging Nano en el Instituto de Ciencia Weizmann.

1. Cryo-fijación de tejidos de hojas por medio de congelamiento de alta presión Nota: En esta sección se describe cómo llevar a cabo la congelación de alta presión de los tejidos de las hojas para un experimento de congelación-fractura. Por consideraciones relacionadas con muestras de plantas ver 29. Esto se puede adaptar para otros tipos de tejidos o muestras con alguna modificación. <ol><li> El uso de la esquina de una hoja de afeitar, rayar la parte inferior de la cavidad de 0,1 mm de una plaqueta de aluminio 0,1 / 0,2 mm (Figura 1). Preparar al menos una docena de plaquetas (6 muestras). Tome la precaución de no crear marcas de cuchillo en la circunferencia del disco. <ol><li> Después de rascarse, lavar los discos en etanol absoluto, dejarlos secar y guardar en un plato limpio. </li></ol></li><li> Preparar la máquina de congelación de alta presión de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Llene la cámara de alcohol de la máquina de congelación de alta presión con isopropanol. </li><li> Preparar una infiltratio asistida por vacío caseron dispositivo para reemplazar el gas que se encuentra en el tejido de la hoja con el líquido. <ol><li> conectar firmemente una punta de pipeta 200 l al final de una jeringuilla de 10 ml. Cortar ~ 1 cm de la punta. Hacer un agujero en la tapa de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml a encajar con firmeza la punta de corte. De vacío puede ser creado en el interior del tubo, tirando del émbolo de la jeringa. </li></ol></li><li> Cortar un pequeño trozo de hoja de la planta utilizando una cuchilla de afeitar y con pinzas colocar la hoja en el interior de un tubo de microcentrífuga medio lleno con 1-hexadeceno. Infiltrarse en los espacios intercelulares de la hoja con el líquido tirando suavemente el émbolo para crear el vacío, mantenga durante unos 30 segundos, y luego liberar lentamente el émbolo. </li><li> Retire la pieza de la hoja del tubo con unas pinzas. Recorte la hoja con una hoja de afeitar en caso de que es más gruesa que 0,2 mm y cortar un pedazo pequeño que quepa en una plaqueta. </li><li> Colocar una plaqueta limpia con la cara arañada en el soporte de la máquina de congelación y luego colocar la pieza cortada de leaf en la plaqueta. Llenar el espacio restante que rodea la hoja con 1-hexadeceno. Cerrar el sándwich utilizando otro plaquetas, con los arañazos que se enfrenta la hoja. </li><li> Cierre y apriete el soporte y la inserta en la cámara de la máquina. A continuación, pulse el botón &#39;Jet&#39; para congelar (~ 2.100 bares durante 300 - 500 ms), y transferir rápidamente el soporte en nitrógeno líquido. Retirar con cuidado el sándwich de helado del soporte con unas pinzas pre-enfriado, teniendo cuidado de no fracturar el sándwich. Nota: bocadillos congelados cerrado puede ser helada fracturada inmediatamente o guardado en nitrógeno líquido para su uso posterior. Use ropa protectora y gafas de protección al manejo de nitrógeno líquido. </li></ol> 2. Freeze-fractura y doble capa de revestimiento 27,28 <ol><li> Preparar la máquina de fractura por congelación para su uso, incluyendo tanto los cañones para la evaporación de platino / carbono (Pt / C) y de carbono, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Coloque la pistola de Pt / C a 45 grados unand la pistola de carbono a 90 grados. <ol><li> Pre-programa de un sistema de protección de una capa de 2 nm de Pt / C (velocidad de revestimiento 0,02-0,04 nm / sec) y una capa de 6 nm de carbono (a ~ 0,1 nm / seg). <ol><li> Entrar en la configuración en la pantalla de la máquina de congelación-fractura. Seleccionar un número de usuario donde se guardará el sistema de protección. </li><li> Elija Pt / C de &#39;capa 1&#39;. Seleccione un marco de tiempo, por ejemplo., 5 min (para superar el tiempo necesario necesario para completar el recubrimiento). Utilice las flechas arriba-abajo para definir un espesor de 2 nm. </li><li> Pulse el botón &#39;Capa&#39; para mover a la Capa 2. Repita el paso 2.1.1.2, excepto que seleccione carbono y definir un espesor de 6 nm. </li></ol></li><li> Probar y ajustar el funcionamiento del arma. <ol><li> Seleccione &#39;capa 1&#39;. Seleccione la pistola Pt / C pulsando el botón &#39;gun1&#39; y presione el botón &quot;ON&quot; en la unidad de control de la evaporación de la máquina de congelación-fractura. Monitorear la tasa de evaporación y ajustarlo mediante los mandos de tensión y de emisión until alcanzando una tasa de 0,02 - 0,04 nm / seg. Presione &quot;OFF&quot; para apagar la pistola de Pt / C. </li><li> Seleccione &#39;Capa 2&#39;. Repita 2.1.2.1, excepto &#39;GUN2&#39; para seleccionar y ajustar una velocidad de evaporación de ~ 0,1 nm / seg. </li></ol></li></ol></li><li> Se enfría la etapa de congelación del sistema de fracturas a -140 ºC o -160 ° C (para hojas hidratadas o deshidratadas, respectivamente). Una el servicio de traslado al crio de vacío a la máquina y llenar su cámara con nitrógeno líquido. La presión en la cámara de congelación-fractura enfriado es por lo general entre 1 - 8 x 10 -7 mbar. </li><li> Inserte un soporte de muestras congelación de fracturación (adecuado para las plaquetas de 3 mm) en la estación de carga. Inundar la cámara de la estación de carga con nitrógeno líquido. </li><li> Cargar dos bocadillos congelados sobre el titular de uno por uno con unas pinzas de grado alto de precisión. Apretar el primer sándwich en el soporte y luego darle la vuelta al titular a comprobar que se ajusta de forma segura en su lugar. Repita para el segundo sándwich. </li><li> reEtach el servicio de transporte refrigerado de la máquina de fractura por congelación y conectarlo a la estación de carga. Abra la válvula de doble efecto, introducir el brazo de retracción en el soporte y bloquearlo en su sitio. Reintroducir el brazo con el soporte en el servicio de transporte y cierre la válvula de doble efecto con el mando de la estación de carga. Una el servicio de transporte a la máquina de congelación-fractura e introducir el soporte en la cámara con el brazo de retracción. Separar el servicio de transporte de la máquina. </li><li> Alinear la cuchilla del micrótomo fractura de congelación a una altura tal que va a golpear de las plaquetas superiores de los sándwiches. </li><li> Con el cuchillo microtomo, se rompe con facilidad los sándwiches, e inmediatamente después levantarlo para evitar la contaminación de las muestras por el apego escombros para el cuchillo, y girar el obturador enfriado por encima del plano recién expuesta para proteger las muestras de la posible contaminación por moléculas de agua en la Cámara. </li><li> Cubrir las muestras con platino y carbono. <ol><li> Entre &#39;capa 1&#39; en la screen. Encienda el arma Pt / C pulsando el botón &#39;gun1&#39; seguido por el botón &#39;ON&#39;. Examinar la tasa de evaporación y una vez que se alcanza de 0.02 - 0,04 nm / seg, al mismo tiempo exponer las muestras y pulse el botón &quot;Medir&quot; para controlar el espesor de la capa depositada. Nota: Pistola se apagará automáticamente cuando el espesor se ha alcanzado el valor preseleccionado. </li><li> Cubrir las muestras con el obturador cuando se completa Pt / C evaporación. </li><li> Pulse el botón &#39;Capa&#39; para pasar a &quot;capa 2 &#39;. Repetir los pasos 2.8.1 y 2.8.2, con la excepción de la selección &#39;GUN2&#39; (por carbono) y una velocidad de evaporación de ~ 0,1 nm / seg. </li></ol></li><li> Se calienta la fase del sistema de fracturas congelación a -120 ° C. </li></ol> 3. Cryo-Microscopía Electrónica de Barrido <ol><li> Preparar el microscopio electrónico de barrido para el trabajo crio. <ol><li> Seleccione la etapa / de la etapa de iniciación en el menú principal y confirme. </li><li> Seleccione Herramientas / Goto Panel, y abra el panel &quot;bolsa de aire&quot;, seleccionándolo de la lista. Haga clic en el botón &quot;Cerrar Columna cámara de la válvula. Ventilar la cámara microscopio haciendo clic en el botón de Vent bajo la etiqueta de &#39;vacío&#39;. </li><li> Seleccione Herramientas / Panel de Goto, y abra el panel &quot;Lista de Puntos de Stage. Seleccione la posición de intercambio de la crio para mover la etapa a las coordenadas apropiadas para aceptar el soporte de muestra. Nota: La posición de intercambio crio &#39;está programado para estar en alineación con la posición de la unidad de transferencia de vacío. </li><li> Abrir la cámara de muestras con un par de guantes limpios e inserte la etapa crio en el escenario principal del microscopio. Cerrar la cámara y haga clic en el botón de la bomba bajo la pestaña de vacío &#39;. </li><li> Se enfría el microscopio para -120 ° C. Llenar el microscopio Dewar con nitrógeno líquido. Active la función de calor en la unidad de control de la crio-transferencia a -120 ° C una vez que la temperatura de la fase desciende por debajo de -120 ° C. </li></ol></li><li> attACH del transbordador crio-traslado al microscopio y transferir el soporte de la muestra utilizando el brazo de retracción en la platina del microscopio crio (como en el paso 2.5). Separar el transporte desde el microscopio. </li><li> Haga clic en el botón &#39;Open Columna cámara de válvula&#39; en el panel de bolsa de aire. </li><li> mover con cuidado el soporte de la muestra cerca de la lente objetivo (distancia de trabajo de 1 - 2 mm) utilizando el joystick. Seleccione una abertura de 10 micras en la pestaña &#39;&#39; Las aberturas. Haga doble clic en el campo EHT en la pestaña &#39;Gun&#39;. Introduzca 10 (kV) para el objetivo EHT y haga clic en OK. Haga clic en la pestaña EHT inferior y seleccione &#39;EHT On&#39;. </li><li> Seleccionar &#39;&#39; InLens de la lista desplegable de detectores en la pestaña &#39;Detectores&#39;. Optimizar las condiciones de formación de imágenes (enfoque, brillo y contraste, alineación del balancín, astigmatismo), según proceda. </li><li> Haga clic en la pestaña &#39;escaneado&#39;. Elija una exploración rápida ( &quot;Velocidad de exploración = 1 &#39;, que corresponde a un tiempo de permanencia de 100 nseg por píxel) para minimizar el daño del haz, yuna &quot;resolución de la tienda &#39;de 1.024 x 768 píxeles. Seleccione &#39;Línea Promedio&#39; en la lista desplegable &#39;Reducción de ruido&#39;. Ajuste el valor de N a 20 - 30 líneas para la búsqueda. Mover la muestra usando la función &#39;Centre Point&#39; (pulsando Control-Tab en el teclado) para buscar regiones con células fracturadas y cloroplastos (Figuras 2A y 2B). </li><li> Adquirir imágenes de los cloroplastos fracturados a bajos aumentos (50 - 70 KX) (Figura 2C y 2D). Utilice la función de &#39;Centro de funciones&#39; (pulsando Control + Mayúsculas-Tab en el teclado) para hacer zoom en las caras de fractura interesantes cloroplasto y adquirir imágenes con grandes aumentos (100 - 200 kX, las Figuras 3 y 4). Utilizar los mismos parámetros que en el paso 3.6 para la adquisición de imágenes, pero cambiar el valor medio de la Línea N&gt; 100 para la reducción de ruido 30. <ol><li> Pulse Freeze en la unidad principal de control microscopio o en la pestaña &#39;escaneado&#39; para detener el escaneo y guardarla imagen pulsando el botón &quot;Guardar TIFF &#39;. </li></ol></li></ol> Análisis 4. Imagen Nota: En esta sección se describe un procedimiento corto para la segmentación de las partículas de membrana de congelación-fractura imágenes de SEM utilizando el paquete de código abierto Fiji 31. Resultados similares pueden obtenerse con otro software de análisis de imágenes. <ol><li> imagen abierta con Fiji arrastrando archivo de imagen en la ventana principal del programa. Convertir la imagen a 8 bits mediante la selección de la imagen / Tipo / 8 bits. Seleccionar Imagen / Ajustar / Brillo / Contraste y ajuste si es necesario (Figura 5A). </li><li> Con la herramienta Línea Recta, dibujar una línea del tamaño de la barra de escala de la imagen incrustada. Seleccione Analizar Escala / Set. Introduzca la información de escala apropiada (distancia conocida y la unidad de longitud) y haga clic en OK. Guardar esta imagen a escala ajustada. </li><li> Seleccione Proceso / Filtros / desenfoque gaussiano (1,5 NM de radio) y haga clic en OK (Figura 5B). </li><li> Seleccionar Imagen / Ajustar / AutUmbral o local (utilizando el método de Niblack) y haga clic en OK (Figura 5C). </li><li> Seleccione Editar / Invertir y luego Proceso / Binario / cuencas (Figura 5D). </li><li> Dibujar un borde alrededor de la región de interés (ROI) con la herramienta Selección a mano alzada. Añadir la selección al gestor de retorno de la inversión al seleccionar Editar / Selección / Añadir a Manager o haciendo clic en &#39;T&#39;. </li><li> Seleccione Editar / Borrar el exterior (Figura 5E). </li><li> Seleccione Analizar / mediciones indicadas, elegir los parámetros adecuados (por ejemplo, superficie, en forma de elipse). </li><li> Seleccione Analizar / Analizar partículas. Introduzca un rango apropiado para el tamaño de las partículas y marcar &quot;Mostrar resultados&quot;, &quot;Añadir al Administrador &#39;y, de ser necesario, el&#39; Excluir &#39;en los bordes opción y haga clic en OK. El resultado se muestra en la Figura 5F. </li><li> Abrir el archivo guardado fotografiado reducido (paso 4.2). Seleccione &#39;Mostrar todos&#39; y anular la selección de &quot;etiquetas&quot; en el Administrador de retorno de la inversión. Revisar la partic seleccionadoles deposita sobre la imagen original y añadir o eliminar selecciones mediante el uso de la &#39;Añadir&#39; o &#39;Eliminar&#39; botones del Administrador de retorno de la inversión de forma manual. Corregir las selecciones necesarias mediante el uso de la herramienta Selección a mano alzada y el botón de &quot;actualización&quot; del Administrador de retorno de la inversión (figuras 5G y 5H). </li><li> Analizar los datos utilizando las mediciones obtenidas. En la ventana de resultados, haga clic en Resultados / Resumir para obtener, por ejemplo, el área media, y la media de Major y Minor ejes de las partículas que figuran en el Administrador de retorno de la inversión. Haga clic en Resultados / Distribución, seleccione un parámetro (por ejemplo, la zona) y haga clic en OK para ver un histograma para este parámetro. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

La técnica descrita en este documento permite la investigación de las membranas de congelación-fractura en el contexto de los tejidos vegetales congelados de alta presión bien conservados mediante microscopía electrónica de crio-escaneo. La principal ventaja de la utilización de estos procedimientos es que la preparación de la muestra es puramente físico; no hay pasos que involucran productos químicos o la deshidratación son necesarios. Por lo tanto, permite el estudio de las estructuras biológicas en un estado casi nat...

fotosíntesis oxigénica, originarios de la antigua cianobacterias, fue heredado por las algas y las plantas de la tierra por los acontecimientos que llevaron a endosymbiotic desarrollo del cloroplasto. En todos los oxigénica fototrofas de hoy en día, el transporte de electrones fotosintética y la generación de la fuerza protón-motriz y el poder reductor se llevan a cabo dentro de las vesículas en forma de sacos aplanados denominadas membranas tilacoides &#39;&#39;. Estas membranas albergan los complejos de proteínas que llevan a cabo las reacciones impulsada por la luz de la fotosíntesis y proporcionan un medio para la transducción de energía. Las membranas de los tilacoides de plantas y (algunos) las algas se diferencian en dos dominios morfológicas distintas: las regiones de membrana fuertemente adpresas llamados «grana» y las membranas apiladas que interconectan la grana, llamados &#39;estroma laminillas «1. Se han realizado diversos estudios de congelación-fractura de la planta y membranas tilacoides de algas, a partir de la década de 1970. Cuando por congelación fracturado, membranasdividir a lo largo de su núcleo hidrofóbico 2, generando una cara exoplasmic (EF) y una cara protoplasmática (PF), en función del compartimento celular que las fronteras de entramado de membrana, como acuñado originalmente por Branton et al. . en 1975 3 Planta y tilacoides de algas tienen cuatro diferentes caras de fractura: los EF, EFU, SLP y la UFP, con &#39;s&#39; y que denotan y regiones de membrana &#39;&#39; &#39;no apiladas apilados&#39; &#39;U&#39;, respectivamente. Los complejos de proteínas de membrana, que no se dividen o se rompe, tienen la tendencia a permanecer ya sea con el E o P lado de la membrana. Las observaciones iniciales de que las diferentes caras de fractura de los tilacoides contienen partículas de diferentes tamaños y densidades 4, y las numerosas investigaciones que siguieron, condujeron a la identificación y correlación entre las partículas observadas y los complejos de proteínas de membrana que llevan a cabo las reacciones de luz 5-13 (véase también revisa 14,15). Freexperimentos eze-fractura de membranas tilacoides se llevan a cabo normalmente en preparaciones de cloroplastos o membranas tilacoides aisladas (pero véase 16,17), con el riesgo de cualquier alteración en la organización estructural y / o supramolecular que pueda ocurrir durante el procedimiento de aislamiento. Después de la fractura, las réplicas se preparan por evaporación de platino / carbono (Pt / C), a continuación, por una gruesa capa de carbono (C), y finalmente digestión del material biológico 18. Réplicas se visualizan por microscopía electrónica de transmisión (TEM). La técnica tradicional de congelación-fractura-réplica continúa sirviendo como una herramienta importante para el estudio de la organización supramolecular de las membranas fotosintéticas y su adaptación a las diferentes, por ejemplo., La luz, las condiciones de 19-23. En nuestro reciente estudio de la planta de la resurrección homoiochlorophyllous Craterostigma pumilum 24, que tuvo como objetivo investigar los cambios en la organización supramolecular omembranas tilacoides f, así como en la organización celular en general, durante la deshidratación y la rehidratación. La singularidad de las especies de resurrección homoiochlorophyllous es que son capaces de sobrevivir a las condiciones de desecación en sus tejidos vegetativos (hojas), al tiempo que conserva su aparato fotosintético. Una vez que se dispone de agua, estas plantas recuperar y reanudar la actividad fotosintética en cuestión de horas a unos pocos días 25. Para este estudio, EM crio-barrido (SEM) de imágenes de muestras de hojas de congelación-fractura se combinó con alta presión de congelación para la muestra crio-inmovilización. Estos procedimientos proporcionan un medio para visualizar muestras biológicas congelados-hidratados en un estado cercano a su estado natal 26. Un beneficio principal es que las muestras se examinan directamente después de congelación-fractura y revestimiento sin pasos sucesivos. Esto es particularmente pertinente para la investigación de las plantas en diferentes contenidos de agua relativos (RWC), ya que su estado de hidratación se mantiene durante la preparación. Cómosiempre, una desventaja fundamental es que las muestras congeladas hidratado pueden sufrir de daño haz durante la exploración, especialmente cuando se escanea con grandes aumentos, necesarias para la medición precisa del tamaño de los complejos fotosintéticos. Para superar esto, un método llamado &quot;recubrimiento de doble capa &#39;(DLC) 27,28 combinado con se utilizaron condiciones específicas de formación de imágenes cryo-SEM. Estos dieron lugar a muestras que son significativamente menos sensibles a la viga y se dejan para el esclarecimiento de información valiosa sobre la organización supramolecular proteína fotosintética y otros constituyentes celulares de la planta de la resurrección C. pumilum con grandes aumentos en situ.

<table><tbody><tr><td>Etanol abs</td><td>Bio-Lab</td><td>052505</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Bio-Lab</td><td>162605</td><td></td></tr><tr><td>1-hexadeceno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7009</td><td></td></tr><tr><td>0.1/0.2 Plaquetas</td><td>Oficina de Ingeniería M. Wohlwend GmbH, Suiza</td><td>241</td><td>Las plaquetas son de 3 mm de diámetro y 0,5 mm de espesor (Tipo A) con cavidades de 0,1/0,2 mm de profundidad (de diámetro 2 mm). Se pueden obtener plaquetas similares de Leica Microsystems.</td></tr><tr><td>Pinzas de alta precisión</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72706-01</td><td>Dumont (Suiza) Pinzas estilo Durostar #5; Se puede sustituir por otras pinzas de alta precisión.</td></tr><tr><td>Máquina de congelación a alta presión</td><td>Bal-Tec</td><td>HPM 010</td><td>Alternativas de congelación a alta presión: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems.</td></tr><tr><td>Sistema de congelación-fractura</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM BAF 060</td><td></td></tr><tr><td>Etapa de carga de preparación criogénica</td><td>Leica Microsystems</td><td>16770228</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de muestras para fractura por congelación universal</td><td>Leica Microsystems</td><td>16LZ04746VN</td><td>Soporte de abrazadera para portadores de muestras de 3 mm</td></tr><tr><td>de diámetro Lanzadera de criotransferencia al vacío</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM VCT 100</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de barrido</td><td>Zeiss</td><td>Ultra 055</td><td></td></tr><tr><td>Etapa Cryo SEM</td><td>Leica Microsystems</td><td>16770299905</td><td></td></tr><tr><td>Software de adquisición de imágenes</td><td>SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de análisis de imágenes</td><td>Fiji/Image J, Instituto Nacional de Salud http://fiji.sc/Fiji</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

el estudio de la organización supramolecular de membranas fotosintéticas dentro de los tejidos foliares fracturados-freeze por cryo-microscopía electrónica de barrido

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

microscopía electrónica de Cryo-barrido (SEM) de las muestras de congelación-fractura permite la investigación de estructuras biológicas en condiciones nativas cerca. A continuación, describimos una técnica para el estudio de la organización supramolecular de fotosintéticos membranas tilacoides () dentro de las muestras de hojas. Esto se consigue mediante la congelación de alta presión de tejidos de las hojas, congelación-fractura, recubrimiento de doble capa y, finalmente, formación de imágenes cryo-SEM. El uso del método de recubrimiento de doble capa permite la adquisición de gran aumento (&gt; 100,000X) imágenes con daño haz mínimo para las muestras congeladas hidratado así como los efectos de carga mínimas. Utilizando los procedimientos descritos investigamos las alteraciones en la distribución del fotosistema supramolecular y proteínas antena captador de luz complejos que tienen lugar durante la deshidratación de la planta de la resurrección Craterostigma pumilum, in situ.

La Figura 1 muestra imágenes Cryo-SEM de plaquetas que contienen congelados, trozos de hojas pumilum Craterostigma fracturadas por congelación de alta presión. En algunas muestras, grandes regiones de células fracturadas se obtienen (Figura 1A). En otros, la pieza de la hoja se mantiene fuertemente unido al disco superior y está derribado junto con él (Figura 1B). Sin embargo, incluso en el segundo caso, una parte del tejido de ...

Aquí describimos un procedimiento para estudiar tejidos vegetales fracturados por congelación. Las muestras de hojas congeladas a alta presión se fracturan por congelación y se recubren de doble capa, lo que produce muestras congeladas hidratadas bien conservadas que se obtienen mediante el microscopio electrónico de criobarrido a grandes aumentos con un daño mínimo del haz.

El estudio de la Organización Supramolecular de membranas fotosintéticas dentro de los tejidos foliares fracturados-Freeze por Cryo-Microscopía Electrónica de Barrido

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

El objetivo general de esta técnica es estudiar la organización supramolecular de las membranas fotosintéticas mediante microscopía electrónica de barrido criogénica de muestras de tejido foliar fracturadas por congelación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología celular, como la caracterización morfológica de células y orgánulos, la distribución de complejos proteicos integrales de membrana y la localización de biominerales. La principal ventaja de esta técnica es que la fractura por congelación se realiza sobre tejidos foliares, por lo que la organización supramolecular de la membrana tilacoide se investiga dentro del contexto celular y del orgánulo nativo.Aunque este método se demuestra aquí para una muestra biológica, también puede aplicarse a geles, polímeros y sistemas de liberación de fármacos. En general, las personas nuevas en estos procedimientos deben tener en cuenta que no todas las muestras se congelarán adecuadamente ni se fracturarán correctamente. Para llevar a cabo la criofijación de tejidos foliares mediante congelación a alta presión, comience usando la esquina de una hoja de bisturí para rayar el fondo de la cavidad de 0,1 milímetros de una plaquita de aluminio de 0,1 a 0,2 milímetros.Prepare al menos una docena de plaquetas para seis muestras. Luego, lave las plaquetas con etanol absoluto y manténgalas en un recipiente limpio. Después de preparar la máquina de congelación a alta presión, llene la caja de muestras con nitrógeno líquido.Con una cuchilla de afeitar, corte un pequeño trozo de hoja de la planta y use pinzas para colocar el tejido dentro de un tubo de microcentrifugado parcialmente lleno con hexadecano. Para infiltrar los espacios intercelulares del tejido foliar, inserte la punta del dispositivo de infiltración, preparado según se describe en el protocolo del texto, en el orificio de la tapa del tubo de microcentrifugado y tire del émbolo para crear vacío. Después de aproximadamente 30 segundos, suelte el émbolo.A continuación, utilizando pinzas, retire el trozo de hoja del tubo. Use la cuchilla de afeitar para cortar un pedazo lo suficientemente pequeño como para caber en una plaqueta. Y, si es necesario, recorte la hoja hasta un grosor inferior a 0,2 milímetros.Para evitar el colapso del tejido, las hojas se infiltran con líquido antes de la congelación a alta presión. El grosor de la muestra se mantiene por debajo de 200 micrones para maximizar la probabilidad de obtener una muestra vitrificada. Coloque una plaqueta limpia con el lado rayado hacia arriba en el portador de la máquina de congelación.Luego, coloque el trozo cortado de la hoja en la plaqueta. Use una gota de hexadecano para llenar el espacio restante de la plaqueta antes de colocar otra plaqueta con los arañazos enfrentados a la hoja para cerrar el sándwich. Cierre y apriete el soporte.Congele la muestra presionando el botón de chorro. Luego, transfiera rápidamente el portador al nitrógeno líquido. Utilice pinzas preenfriadas para retirar el sándwich del portador, teniendo cuidado de no fracturarlo.Existen dos pasos críticos en el procedimiento: la fractura por congelación, que es un proceso aleatorio y cuyo éxito solo puede evaluarse en el microscopio electrónico de barrido criogénico, y el recubrimiento de doble capa, que es necesario para obtener imágenes de alto aumento con daño mínimo por el haz. Mientras se prepara y programa la máquina de fractura por congelación según las instrucciones del fabricante, coloque la fuente de platino carbono, o de Pt/C, a 45 grados y la fuente de carbono a 90 grados. Enfríe la etapa del sistema de fractura por congelación a menos 140 o menos 160 grados Celsius.Luego, conecte el transportador criogénico de vacío a la máquina y use nitrógeno líquido para llenar la cámara del transportador. Inserte un portador de muestras para fractura por congelación en la estación de carga y llene con nitrógeno líquido la cámara de la estación de carga. A continuación, utilizando pinzas de alta precisión, coloque un sándwich congelado sobre el portador y ajústelo firmemente en su lugar.Luego, gire el soporte para verificar que el sándwich esté asegurado en su lugar y repita el procedimiento con un segundo sándwich. Desconecte el transportador enfriado de la máquina de fractura por congelación y conéctelo a la estación de carga. A continuación, abra la válvula del transportador, introduzca el brazo retráctil en el soporte, bloquéelo en posición y reintroduzca el brazo con el soporte en el transportador.Después de volver a colocar el portamuestras en la máquina de fractura por congelación, introduzca el soporte en la cámara utilizando el brazo retráctil. Alinee ahora la cuchilla del micrótomo de fractura por congelación a una altura tal que desprenda las plaquetas superiores de los sándwiches. Con la cuchilla del micrótomo, rompa rápidamente los sándwiches.Luego, levante inmediatamente el cuchillo para evitar la contaminación de las muestras por restos adheridos al cuchillo. Coloque el obturador enfriado sobre el plano recién expuesto para proteger las muestras de posibles contaminaciones por moléculas de agua en la cámara. A continuación, para recubrir las muestras con platino, presione Configuración para mostrar la Capa 1 en la pantalla.Luego encienda la pistola de Pt/C presionando el botón GUN 1 seguido del botón ON. Examine la tasa de evaporación y, cuando alcance entre 0,02 y 0,04 nanómetros por segundo, presione el botón Measure para monitorear el espesor de la capa depositada mientras expone simultáneamente las muestras. Para recubrir con carbono, seleccione GUN 2 seguido del botón ON.Una vez que la velocidad de evaporación sea aproximadamente 0,1 nanómetros por segundo, presione el botón Medir y, al mismo tiempo, mueva el obturador para exponer las muestras. Cuando el recubrimiento esté completo, caliente la etapa a menos 120 grados Celsius. Para preparar el microscopio electrónico de barrido para trabajo criogénico, seleccione desde el menú principal Etapa, Inicializar Etapa, y confirme.Bajo la pestaña Vacío, haga clic en el botón Ventilar para ventilar la cámara del microscopio. Luego, seleccione Herramientas, Panel Ir a, y abra el panel Lista de puntos de la platina. Seleccione la posición INTERCAMBIO CRIOGÉNICO para mover la platina a las coordenadas adecuadas para recibir el portamuestras.Mientras usa un par nuevo de guantes, abra la cámara de la muestra e inserte el portaobjetos criogénico en la platina principal del microscopio. Cierre la cámara y, en la pestaña Vacío, haga clic en el botón Bomba. A continuación, enfríe el microscopio llenando el recipiente duor del microscopio con nitrógeno líquido.Una vez que la temperatura de la etapa descienda por debajo de menos 120 grados Celsius, active la función de calentamiento en la unidad de transferencia criogénica para calentar la etapa hasta menos 120 grados Celsius. Ahora, conecte la lanzadera de transferencia criogénica al microscopio y transfiera el portamuestras mediante el brazo retráctil a la etapa criogénica del microscopio. Utilizando el joystick, mueva cuidadosamente el portamuestras cerca del objetivo de la lente.En la pestaña Aperturas, seleccione la apertura de 10 micrones. Luego, en la pestaña Pistola, haga doble clic en el campo Objetivo EHT, ingrese 10 kilovoltios para el objetivo EHT y haga clic en Aceptar. A continuación, para encender el voltaje de aceleración, haga clic en la pestaña inferior EHT y seleccione EHT Encendido. En la pestaña Detectores, seleccione InLens en la lista desplegable. Luego, haga clic en la pestaña Escaneo y elija una velocidad de escaneo igual a uno, que es un escaneo rápido para minimizar el daño por el haz, y una resolución de almacenamiento de 1024 por 768 píxeles.En la lista desplegable Reducción de Ruido, seleccione Promedio de Línea y ajuste el valor de n a entre 20 y 30 líneas para la búsqueda. Luego, pulsando las teclas Control y Tabulador del teclado, utilice la función de punto central para mover la muestra hacia áreas de interés, ampliando simultáneamente para identificar regiones con células fracturadas. Tras identificar regiones con células fracturadas, examine la muestra ampliando la imagen para localizar un cloroplasto fracturado.Luego cambie el valor promedio de n de la línea a más de 100, para reducir el ruido. En la pestaña Escaneo, presione Congelar para detener el escaneo. Al presionar Control + Mayús + Tabulador en el teclado, se utiliza la función de centrado para acercarse a las caras de fractura de cloroplastos de interés; y se adquieren imágenes de alta magnificación utilizando los mismos parámetros que antes.Finalmente, presione el botón Guardar TIFF para guardar la imagen. Realice el análisis de la imagen según el protocolo descrito en el texto. Esta figura muestra una imagen de SEM criogénico de una plaqueta que contiene un fragmento de hoja de Craterostigma pumilum, congelado a alta presión y fracturado por congelación, con una amplia región de células fracturadas.En este ejemplo, falta el trozo de hoja; pero quedó algo de tejido foliar unido a las ranuras del cuchillo en la plaqueta. Una vez identificada una fractura exitosa, se adquieren imágenes de baja magnificación de las células para identificar regiones de interés, como cloroplastos fracturados. Se obtienen imágenes de cloroplastos individualmente fracturados para identificar las caras de fractura de las membranas tilacoides.En este ejemplo se muestra una imagen de alta magnificación de las membranas tilacoides en hojas de C. pumilum. Pueden distinguirse las cuatro caras de fractura diferentes: las caras de fractura exoplásmica de las membranas apiladas y no apiladas, EFs y EFu respectivamente, y las caras protoplásmicas de las membranas apiladas y no apiladas, PFs y PFu respectivamente.El fotosistema II, o PS2, se encuentra tanto en las regiones de membranas de grana apiladas EFs como en las regiones de membranas estromalamelares EFu. Cuando están hidratadas, la densidad de PS2 es aproximadamente tres veces mayor en las EFs que en las EFu, lo que diferencia las dos caras. Durante la deshidratación de C. Pumilum, la densidad de PS2 en las EFs disminuye gradualmente, alcanzando aproximadamente la mitad de su densidad en condiciones hidratadas.Notablemente, tras una deshidratación adicional hasta un contenido de agua relativo del 5 al 10%, los complejos PS2 se organizan en hileras y arrays. El desarrollo de la técnica de réplica por fractura congelada allanó el camino para estudiar el tamaño de los complejos de proteínas de membrana y su disposición dentro de las membranas biológicas. La combinación de la fractura congelada con congelación a alta presión en microscopía electrónica criogénica permite investigar diversos tipos de muestras a varias escalas de tamaño, desde los niveles de tejido y celular hasta el nivel macromolecular en un estado cercano al nativo.Además de la técnica mostrada aquí, métodos como la espectroscopía de rayos X por dispersión de energía, EDS, también pueden aplicarse en el microscopio electrónico de barrido criogénico; por ejemplo, para alcalinizar biominerales.

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El estudio de la Organización Supramolecular de membranas fotosintéticas dentro de los tejidos foliares fracturados-Freeze por Cryo-Microscopía Electrónica de Barrido

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