Name: Tubo de Ensayo de la célula endotelial Formación estratégica: Comparación de la matriz extracelular y el factor de crecimiento reducido de la matriz extracelular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Aprende a cuantificar la formación de tubos en células endoteliales HUVEC usando matrices extracelulares normales y GFR. Este ensayo permite estudiar la angiogénesis y evaluar inhibidores de CXCR2 en investigación oncológica.

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El trabajo fue financiado por el Fondo para la Investigación y Educación Médica, Wayne State University, Detroit, MI.

1. Cultura de la célula <ol><li> 3x10 Seed 5 células HUVEC en 10 ml de medio de crecimiento completo 10 en un matraz de 75 cm. </li><li> Se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO 2 al 70 a 80% de confluencia. </li></ol> 2. Ensayo de Formación túbulo <ol><li> Descongelar ya sea la matriz extracelular del factor de reducción (TFG) el crecimiento o la matriz extracelular normal, durante la noche en hielo a 4 ° C. Nota: En aras de la brevedad &quot;matriz extracelular&quot; de ahora en adelante se utilizará para hacer referencia tanto TFG y la matriz extracelular normal. El proceso para prepararlos es idéntico. </li><li> Mantenga placas de cultivo de 96 pocillos en el hielo, y añadir 50 l de matriz extracelular refrigerado por pocillo utilizando puntas de pre-enfriado. Preparar triplicado de 5 pocillos que contienen solamente la matriz extracelular normal. Se prepara otro triplicado de 5 pozos que contienen sólo TFG matriz extracelular. </li><li> Incubar la placa de 96 pocillos a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Lavar el HUVECsuna vez con solución tamponada con fosfato sin calcio y magnesio (PBS), y añadir 1 ml 0,05% de tripsina-EDTA. Incubar la placa a 37 ° C durante 1-5 minutos, comprobando las células cada minuto hasta que la mayoría de las células completan. Desprender las células punteando en el matraz de una vez. <ol><li> Añadir 5 ml de medio basal (es decir, medio de crecimiento de células endoteliales sin nada (por ejemplo, suplementos añadidos)) con 1% de suero bovino fetal (FBS). Recoger las células en el matraz mediante pipeteo y transferir a un tubo de 15 ml. Centrifugar las células a 200 xg durante 5 min y descartar el sobrenadante. </li><li> Vuelva a suspender con 2 ml de medio basal, contar las células usando un hemocitómetro, y ajustar la concentración celular a 2-3 x 10 5 células / ml. </li></ol></li><li> Preparar 100 l de 10x las concentraciones siguientes de inhibidor de CXCR2 SB225002 en medio basal: 11 M, 5,6 M, 1,1 M, 0,56 M y 0 M (control). </li><li> Pipetear 300 l de la suspensión de HUVEC en cada 5 microcentrifuge tubos. Añadir 33 l de las concentraciones de inhibidor (11 M, 5,6 M, 1,1 M, 0,56 M y 0 M) en un tubo conteniendo cada uno la HUVECs, y vórtice. </li><li> Pipetear 50 l de cada una de las suspensiones de células (1-1,5 x 10 4 células) a pocillos individuales de la matriz extracelular. Placa de cada suspensión por triplicado y se incuba durante 4-16 horas a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Después de 4-16 horas, tomar 4 fotos de los tubos formados por pocillo usando una cámara microscopio invertido 11 (aumento original x 100). </li></ol> Ensayo 3. La interrupción túbulo <ol><li> Preparar la matriz extracelular y las placas de acuerdo con las mismas especificaciones que la formación de tubos de ensayo (pasos 2.1 a 2.3). </li><li> Preparar suspensión HUVEC como se describe en los pasos 2.4- 2.4.2 de la formación de tubos de ensayo y alícuota en una placa de 96 pocillos que contiene la matriz extracelular en 50 l por pocillo. NOTA: La placa suficientes pozos so que hay 3 pozos por tratamiento de drogas. </li><li> Se cultivan las células en la matriz extracelular durante 4 horas a 37 ° C, 5% de CO 2. Tomar imágenes antes de la iniciación del tratamiento con fármacos. </li><li> Preparar las concentraciones de 2x de la SB225002 inhibidor de CXCR2 como se describe en el paso 2.5 del tubo de ensayo de formación, y añadir 50 l de cada concentración por pocillo de la placa de 96 pocillos que contiene la HUVECs. Placa de cada concentración por triplicado. </li><li> Incubar la placa para otro 2-12 horas a 37 ° C, 5% de CO 2. Tomar 4 imágenes de los tubos formados en cada pocillo usando una cámara microscopio invertido (aumento original × 100) 11. </li></ol> 4. Cuantificación de datos <ol><li> Evaluar la formación del tubo capturado en las imágenes mediante la medición de la longitud del tubo total de tubos en cuatro campos microscópicos al azar utilizando el software de la cámara microscopio. </li><li> Abre la imagen en el software de la cámara microscopio, y haga clic en &#39;Anotaciones y Medidas9 ;. En la sección &quot;longitud&quot;, seleccione la herramienta &quot;simple línea &#39;. Haga clic en la imagen, a continuación, dibuje una línea a lo largo de la longitud del tubo, a continuación, haga clic derecho. Nota: El software calcula automáticamente la longitud de la línea en píxeles y poner los datos en un archivo. </li><li> Repetir el procedimiento para todas las líneas de metro en la imagen seleccionando la herramienta &quot;simple línea &#39;. Haga clic en la imagen, a continuación, dibuje una línea a lo largo de la longitud del tubo, a continuación, haga clic derecho. Nota: El software registrará la longitud de cada línea y mostrar los datos en la pantalla. </li><li> Después de medir cada tubo en la imagen, haga clic en &quot;Exportar&quot;, después eligió &#39;Longitud de la hoja de cálculo&#39;. Nota: Los datos de longitud se pueden exportar a una hoja de cálculo. </li><li> Añadir todas las longitudes de los tubos de la hoja de cálculo para obtener la longitud total del tubo. Calcular y registrar la duración media de los tubos. Nota: Se recomiendan cuatro réplicas con media y desviación estándar determinada. </li></ol> 5. Recuperación de células de la matriz extracelular Cultura <ol><li> Cultura y llevar a cabo un ensayo de formación de tubo (véase la sección 2) en una escala más grande como una placa de 96 pocillos no dará suficiente número de células. Para placas de 12 pocillos, utilice 500 l de matriz extracelular y 500 l de la suspensión de células HUVEC (1.5x10 5 células). </li><li> Se incuban las células durante 4-16 hr para formar tubos. A continuación, aspirar el medio de cultivo celular. Enjuagar las células con 1 ml de PBS frío 1x sin calcio y magnesio. </li><li> Añadir 1 ml de hielo frío tampón PBS-EDTA mM 2.5 en la cultura y mantener en hielo durante 10 minutos. </li><li> Desprender las células y mezcla de la matriz extracelular de la cápsula, utilizando una punta de pipeta de 1.000 l con la punta cortada, y luego transferir a un tubo ml frío 15, lavar el pozo con 4 ml de hielo frío EDTA PBS-2,5 mM y poner en el tubo . </li><li> Poner los tubos en hielo durante 1-4 horas y se invierta el tubo un par de veces hasta que todo el extracelularmatriz se disuelve. </li><li> Se centrifuga durante 10 minutos a 1.620 xg a 0 ° C </li><li> Vuelva a suspender los sedimentos celulares con PBS frío 1 ml a un tubo de 1.ml en hielo. </li><li> Volver a centrifugar durante 5 minutos a 3.000 xg a 0 ° C, y luego desechar el sobrenadante. </li><li> Almacenar las células en -80 ° C. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Al llevar a cabo este ensayo, es esencial para mantener la matriz extracelular en hielo oa 4 ° C en todo momento a menos que se especifique lo contrario. Si se permite que la matriz extracelular para calentar por encima de 4 ° C, se polimerizará, y el ensayo se arruinado. También es importante asegurarse de que cualquier cosa que entra en contacto (por ejemplo, puntas de pipeta, la placa) con la matriz extracelular es pre-enfriado por la razón antes mencionada. El número de células sembradas en cada pocillo es crítica, muy pocas células no dan la web esperada en la muestra de control, demasiadas células se forman grandes grupos de células o una monocapa y el ensayo no serán válidos. Otro factor importante en el éxito de este ensayo es el número de pases de células de la HUVECs. El número de paso siempre debe ser inferior a diez, de otro modo la formación del tubo robusto no puede producirse. Además, uno debe asegurarse de que el medio de cultivo celular que se utiliza no ha expirado, o las células no será viable. Alternativavamente, uno puede alícuota del medio y sus componentes y almacenar a -20 ° C para conservar por un período de tiempo después de la fecha de caducidad. Por supuesto, aún es preferible utilizar el medio antes de la fecha de caducidad Como todos los procedimientos, existen algunas desventajas a realizar el ensayo de formación de tubos de células endoteliales. Un problema importante es que, debido a que hay diferentes tipos de células endoteliales y las matrices de apoyo, los resultados del ensayo pueden variar considerablemente en función de que se utiliza el tipo de célula y la matriz. Las células endoteliales (HUVEC utilizados, HAECs o HMVECs) son células primarias, que son costosos de obtener y tienen variabilidad en comparación con las células inmortalizadas. Las células primarias tienen pasajes limitados para el uso, y por lo tanto no son adecuados para los experimentos a largo plazo de la angiogénesis 14. Para los datos fiables, siempre se debe usar el mismo tipo para el ensayo. Como con otros ensayos in vitro, los resultados de un ensayo de formación de tubo deben ser conconfirmado in vivo, ya que los resultados de las condiciones controladas y artificiales de cultivo de tejidos de dos dimensiones no siempre se reflejan en el complejo sistema biológico de un organismo vivo. También es importante tener en cuenta que este tipo de ensayo sólo se puede utilizar para demostrar la formación de tubos de células endoteliales, y no debe ser utilizado para probar otro, no endotelial, células formadoras de tubo. Este ensayo es un método bastante sencillo y rápido para cuantificar el potencial angiogénico de un compuesto. También forma una plataforma para experimentos adicionales, como solo, no da información sobre el mecanismo específico por el que el compuesto realmente afecta al proceso de formación de vasos. Sin embargo, el uso de matrices extracelulares variadas es un ejemplo de cómo crear, además, un marco para preguntas de investigación que no se utiliza comúnmente. Hay métodos para estudiar los mecanismos bioquímicos específicos del compuesto, incluyendo inhibidores específicos que se dirigen a componentes dela vía de la angiogénesis. Otro enfoque puede ser para extraer el ARN de las células endoteliales y el uso de RT-PCR (PCR en tiempo real) 12 para analizar las alteraciones de la expresión de genes que pueden causar el comportamiento del crecimiento observado en el ensayo. Las futuras aplicaciones de este método incluyen HUVEC transfectadas para crear ensayos de knock-down para los pasos específicos de la ruta de la angiogénesis. Existe la posibilidad de aplicar este enfoque para estudiar la vía de la LI. Mediante la alteración de los componentes de la matriz extracelular, la interacción de la matriz y el proceso celular de apoyo angiogénesis en el cáncer se puede explicará adicionalmente. La extracción de ARN y proteínas a partir de células endoteliales bajo estas condiciones específicas proporcionan datos cuantificables adicional correspondiente a la formación de imágenes de datos.

Con el fin de obtener los nutrientes necesarios para la supervivencia, los tumores malignos requieren acceso a la corriente sanguínea del paciente. Para conseguir que el acceso, las células tumorales liberan señales químicas que estimulan el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos en el tumor, secuestrando así el proceso fisiológico normal conocido como angiogénesis 2. Es también a través de los vasos sanguíneos creados a través de la angiogénesis que la metástasis (es decir, la propagación del cáncer a otros órganos) puede ocurrir. Debido a que el proceso de angiogénesis es tan vital para la progresión de una amplia variedad de cánceres, es un objetivo atractivo en la investigación de la terapia anticáncer 3. Un método usado para cuantificar la angiogénesis es medir la capacidad de la célula progenitora endotelial para formar tubos cuando se colocan en una matriz extracelular. Debido a que la formación de estos tubos es un paso temprano crítico en la angiogénesis, las pruebas de las condiciones ambientales (por ejemplo, la presencia o ausencia de un co dadoformación mpound) que puede estimular o inhibir tubo da una idea de los pasos específicos que pueden ser objetivo de inhibir la angiogénesis. El ensayo de formación de tubo celular endotelial es uno de los 4 métodos más utilizados in vitro que mide la capacidad de las células para formar tubos. Es un ensayo simple, que requiere relativamente pocos componentes y un periodo de cultivo corto 5. Tal vez lo más importante, sin embargo, es que los datos obtenidos de este tipo de ensayo es cuantificable. Un ejemplo para el uso del ensayo de formación de tubos consiste en comparar el desarrollo de tubos de células endoteliales vasculares cultivadas en matriz extracelular vs. factor de crecimiento reducido (FG) de la matriz extracelular. La matriz extracelular es un material de tipo membrana basal aislado a partir de células de sarcoma y sus principales componentes son laminina, colágeno de tipo IV, factores de crecimiento y los proteoglicanos. Algunos compuestos tienen diferentes efectos sobre la capacidad de la célula para formar tubos cuando enun entorno con una reducción de los factores de crecimiento y la reducción de proteoglicanos de sulfato de heparán (HSPGs). HSPGs son un componente de la matriz extracelular que se reduce de manera significativa en la TFG matriz extracelular. Como un ejemplo, si la hipótesis es que los inhibidores de la angiogénesis, tales como SB225002, que bloquea el receptor de CXCR2, tiene capacidad considerablemente más débil para interrumpir la formación del tubo cuando HSPGs son abundantes, a continuación, una comparación entre la actividad de la formación del tubo en la matriz extracelular y la matriz extracelular de GFR es importante en la exploración de la posibilidad de inhibición de la angiogénesis a través del control de los HSPG. Otros ensayos que se utilizan comúnmente para determinar los efectos de los compuestos sobre la angiogénesis están en métodos in vivo. Ejemplos notables de esto son la membrana corioalantoidea de pollo (CAM) de ensayo 6 usando huevos de gallina, y el enchufe in vivo Matrigel ensayo de angiogénesis 7 usando ratones. Mientras que los métodos in vivo miden la angiogénesis en tres y las dimensiones son más representativos del cuerpo humano en comparación con el ensayo de formación in vitro del tubo, sufren el defecto de requerir mucho más tiempo y son mucho más difíciles de realizar. Tanto el ensayo de CAM y el ensayo enchufe extracelular toman al menos una semana 8 que hacer, mientras que en comparación, el ensayo de formación de tubos se puede realizar en un solo día y que no requiere el uso de animales. Es importante tener en cuenta que las células endoteliales se utilizan en este informe son células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC). Estas células juegan un papel clave en brote vascular y el crecimiento de los vasos sanguíneos, y son suficientemente análoga a las células endoteliales en los cánceres que se utilizará para evaluar la actividad anti-angiogénesis tanto in vitro e in vivo 9. Otras células, tales como células endoteliales microvasculares primarias también se pueden usar. También es importante tener en cuenta que además de tener menorniveles de HSPG, la matriz extracelular de GFR también ha reducido los niveles de muchos de los componentes cuando se compara con la matriz extracelular normal. Esto incluye, pero no se limita a: EGF, IGF-1, PDGF, y TGF-beta. Aquellos que realizan experimentos que estudian el significado de estos compuestos en relación con la angiogénesis pueden estar interesados ​​en el uso de la TFG matriz extracelular.

<table><tbody><tr><td>Medio de crecimiento completo EGM-2 (kit de balas EGM-2 CC-3162 )</td><td>Medio</td> de crecimiento completo Fisher <td>NC9525043</td><td>HUVEC: Medio base EGM-2 mezclado con BBE (Extracto de Cerebro Bovino), hEGF (Factor de Crecimiento Epidérmico Humano), Hidrocortisona, GA-1000 (Gentamicina, Anfotericina-B), 2% FBS (Suero Fetal Bovino), VEGF (Factor de Crecimiento Endotelial Vascular), hFGF-y beta; (factor de crecimiento de fibroblastos humanos beta), R3-IGF-1 (factor de crecimiento similar a la insulina Long R uno), ácido ascórbico y heparina. Alicuente el medio y sus componentes y guárdelos a -20&nbsp; &deg; C, caliente en 37&nbsp; &deg; C antes de usar.</td></tr><tr><td>MATRIGEL MATRIX 10ML Factor de Crecimiento Reducido (GFR); 10&nbsp; Ml; Fisher</td><td></td><td>CB-40230</td><td>Matriz extracelular reducida (GFR) sin LDEV, mantener en -20&nbsp; &deg; C, caliente en 4&nbsp; &deg; C antes de usar.</td></tr><tr><td>MATRIGEL MATRIX 10ML; 10&nbsp; Ml; Matriz</td> extracelular <td>Fisher</td><td>CB-40234</td> sin LDEV<td>, mantener en -20&nbsp; &deg; C, caliente en 4&nbsp; &deg; C antes de usar.</td></tr><tr><td>SB225002</td><td>Fisher</td><td>559405</td><td>inhibidor de CXCR2, mantener en -20&nbsp; &deg; C, calentar a temperatura ambiente antes de usar.</td></tr><tr><td>Células endoteliales primarias de la vena umbilical humana (HUVEC)&nbsp;</td><td>Laboratorios de investigación ScienCell&nbsp;</td><td>8000</td><td>cultivo según referencia&nbsp; 10.</td></tr> <tr><td>Tripsina 0.05%-EDTA rojo de fenol</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td>mantener en 4&nbsp; &deg; C, caliente en 37&nbsp; &deg; C antes de usar.</td></tr><tr><td>Microscopio de investigación invertido</td> <td>Nikon</td><td></td> <td>ECLIPSE</td> Ti.</tr><tr><td>NIS-Elements AR 4.20.02 Nikon</td><td></td><td></td> de 64 bits <td>Software de microscopio de investigación invertido</td></tr><tr><td>Graph-pad Prism 5</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td>Software científico de gráficos y estadísticas en 2D, para calcular IC50.</td></tr></tbody></table>

tubo de ensayo de la célula endotelial formación estratégica: comparación de la matriz extracelular y el factor de crecimiento reducido de la matriz extracelular

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Los tumores malignos requieren un suministro de sangre para sobrevivir y propagarse. Estos tumores obtienen la sangre necesaria del torrente sanguíneo del paciente mediante el secuestro del proceso de angiogénesis, en el que se forman nuevos vasos sanguíneos a partir de los vasos sanguíneos existentes. El receptor CXCR2 (quimiocina (C-X-C motif) receptor 2) es una molécula transmembrana ligada a la proteína G que se encuentra en muchas células y que está estrechamente asociada con la angiogénesis1. El bloqueo específico del receptor CXCR2 inhibe la angiogénesis, según lo medido por varios ensayos, como el ensayo de formación del tubo endotelial. El ensayo de formación de tubos es útil para estudiar la angiogénesis porque es un método excelente para estudiar los efectos que cualquier compuesto o condición ambiental puede tener sobre la angiogénesis. Se trata de un ensayo in vitro sencillo y rápido que genera datos cuantificables y requiere relativamente pocos componentes. A diferencia de los ensayos in vivo, no requiere animales y se puede realizar en menos de dos días. Este protocolo describe una variación de la matriz extracelular que soporta la formación del tubo endotelial, que prueba el receptor CXCR2.

formación considerable, sano endotelial tubo puede ser fácilmente contraste con la formación del tubo inhibido en las imágenes de microscopía. La formación de tubos sana aparece como una banda organizada de las estructuras similares a capilares (Figura 1). En comparación, la formación del tubo inhibido se manifiesta como células dispersas (Figura 2). Tubo de ensayo de formación de datos se cuantifica mediante la medición de la longitud del tubo total de tubos capilares (Tabla 1). Además longitud total del tubo, la longitud media del tubo, el número total de tubos, o el número total de puntos de ramificación se pueden medir. la formación del tubo estructurada produce una mayor longitud de tubo de red que inhibe el crecimiento del tubo dispersa. En la Figura 3, una curva de respuesta a la dosis permite el cálculo de IC 50 en las condiciones experimentales de HUVECs en TFG matriz extracelular y un inhibidor de CXCR2 SB225002. Figura 1. endotelial formación t Ube en la matriz extracelular y el crecimiento (FG) de la matriz extracelular reducido factor. Dos imágenes muestran la formación de tubos de éxito en la matriz extracelular (A) y la matriz extracelular de GFR (B). La red interconectada de tubos de muestra claramente que el crecimiento de los tubos es saludable en estas HUVECs. Barra de escala = 10 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54074/54074fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54074/54074fig2.jpg" /> Figura 2. Inhibición de la formación de tubos en extracelular y el factor de crecimiento reducido (FG) de la matriz extracelular por un SB225002 inhibidor de CXCR2 (5,6 M). Dos imágenes muestran tuboformación que ha sido inhibida por un inhibidor SB225002 CXCR2 (5,6 M) en la matriz extracelular (A) y la matriz extracelular de GFR (B). Los grupos aislados de células HUVEC se ven en esta imagen Demostración de que las células no fueron capaces de formar los tubos necesarios para conectar el uno al otro. Barra de escala = 10 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54074/54074fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54074/54074fig3.jpg" /> Figura 3. Dosis curva de respuesta en el crecimiento (FG) de la matriz extracelular reducido factor. El eje X muestra la longitud del tubo y el eje Y muestra la concentración de un inhibidor de CXCR2. La curva de respuesta a la dosis muestra que la respuesta HUVEC al inhibidor de CXCR2 en TFG matriz extracelular es dependiente de la dosis. El IC 50 (inhibidor de media máximay concentración) se calculó mediante el uso de software 13 y puede ser comparado con una curva de respuesta a la dosis para la matriz extracelular, por ejemplo. IC 50 es la concentración del inhibidor que disminuye la respuesta a 50%. Las barras de error representan la desviación estándar. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Factor de Crecimiento reducido (TFG) y el inhibidor de la matriz extracelular (4 repeticiones cada una) </td><td> Longitud total del tubo Promedio (píxeles) (1 píxel = 0,34 micras) </td><td> Desviación estándar </td><td> P Valor </td></tr><tr><td> control de la matriz extracelular TFG </td><td> 2447 </td><td> 168.174 </td><td></td></tr><tr><td> TFG extracelular SB225002 matriz + 0,56 M </td><td> 1422.5 </td><td> 185.4218 </td><td> 0.000395 </td></tr><tr><td>TFG extracelular SB225002 matriz + 1,1 M </td><td> 1004 </td><td> 126.1784 </td><td> 2,14 x 10 -5 </td></tr><tr><td> TFG extracelular SB225002 matriz + 5,6 M </td><td> 519,25 </td><td> 129.6368 </td><td> 4.19 x 10 -6 </td></tr><tr><td> TFG extracelular SB225002 matriz M + 11 </td><td> 393.75 </td><td> 212.6857 </td><td> 1,21 x 10 -5 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Cuantificación de longitudes de tubo totales en crecimiento (FG) de la matriz extracelular reducido factor bajo condiciones variables. Una parte de una tabla utilizando longitudes de tubo totales registrados en las muestras cultivadas en TFG matriz extracelular con concentraciones variables de inhibidor de CXCR2. Los datos indican que el inhibidor de CXCR2 no inhibe la formación de tubos. Se incluyen los valores asociados como el promedio de cuatro réplicas, desviación estándar y el valor de p. Se mide en píxeles para mostrarlos datos que se exportan. IC 50 se puede calcular mediante el uso de software estadístico 13. (1 pixel = 0,34 micras)

Este manuscrito describe un ensayo de formación de tubos para cuantificar los efectos de un determinado compuesto o condición sobre la angiogénesis mediante el uso de la formación de tubos de células endoteliales en un entorno controlado.

Tubo de Ensayo de la célula endotelial Formación estratégica: Comparación de la matriz extracelular y el factor de crecimiento reducido de la matriz extracelular

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

El objetivo general de este experimento es cuantificar la dependencia de la formación de tubos por células endoteliales en función de quimioquinas angiogénicas, utilizando dos matrices extracelulares diferentes que contienen componentes capaces de asociarse con diversas moléculas angiogénicas. Este método puede responder preguntas clave en el campo de la angiogénesis tumoral, como por ejemplo, ¿por qué la angiogénesis se apoya en vías alternativas mediante alteraciones en la matriz extracelular? Las principales ventajas de esta técnica son que es cuantificable y emplea menos variables.Quien demostrará el procedimiento será la señorita Donghong Ju, asociada de investigación en el laboratorio. Para comenzar este procedimiento, descongele durante la noche a cuatro grados Celsius matriz extracelular GFR o matriz extracelular normal. Mantenga la placa de cultivo de 96 pocillos sobre hielo y agregue 50 microlitros de matriz extracelular fría por pocillo utilizando puntas de pipeta previamente enfriadas.Prepare tres réplicas de cinco pocillos que contengan únicamente la matriz extracelular normal, seguidas de tres réplicas de cinco pocillos que contengan únicamente la matriz extracelular GFR. Luego, incube la placa a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Después de 30 minutos, lave las CÉHUV una vez con PBS, sin calcio ni magnesio, y agregue un mililitro de tripsina-EDTA al 0,05 %.Posteriormente, incubar las células a 37 grados Celsius durante uno a cinco minutos y verificarlas cada minuto hasta que la mayoría de las células se redondeen. Luego, despegar las células golpeando suavemente el frasco. Después, añadir cinco mililitros de medio basal con un uno por ciento de FBS al frasco.Transfiera las células a un tubo de 15 mililitros. Luego, centrifugue las células a 200 ×g durante cinco minutos. Después de cinco minutos, deseche el sobrenadante y re-suspenda las células con dos mililitros de medio basal.Cuente las células utilizando un hemocitómetro y ajuste la concentración celular a dos o tres veces 10 a la quinta células por mililitro. Luego, prepare 100 microlitros de cinco concentraciones diferentes de inhibidor de CXCR2 a 10X en medio basal. Pipetee 300 microlitros de la suspensión de HUVEC en cada uno de los cinco tubos microcéntrifugos individuales.Posteriormente, agregue 33 microlitros del inhibidor 10X de cada concentración en los tubos que contienen HUVEC y vortexee. A continuación, pipetee 50 microlitros de cada una de las suspensiones celulares en pozos individuales de la matriz extracelular. Siembre cada suspensión en triplicado e incube durante cuatro a 16 horas a 37 grados Celsius.Posteriormente, tome cuatro imágenes por pocillo utilizando una cámara de microscopio invertido. En este procedimiento, prepare la matriz extracelular y las placas según las mismas especificaciones que en el ensayo de formación de tubos. Posteriormente, prepare la suspensión de HUVEC y distribuya en una placa de 96 pocillos que contenga la matriz extracelular, con 50 microlitros por pocillo.A continuación, cultive las células sobre la matriz extracelular durante cuatro horas a 37 grados Celsius. Luego, tome imágenes antes del inicio del tratamiento con fármacos. A continuación, prepare cinco concentraciones diferentes dos X del inhibidor de CXCR2 en medio basal.Añada 50 µL de inhibidor de CXCR2 de cada concentración a cada uno de los 96 pocillos que contienen HUVEC. Posteriormente, incube la placa durante otras dos a doce horas a 37 °C. Luego, tome cuatro imágenes de cada pocillo utilizando una cámara de microscopio invertido.Para evaluar la formación de tubos capturada en las imágenes, mida la longitud total de los tubos en cuatro campos microscópicos aleatorios utilizando el software de la cámara del microscopio. Para ello, abra la imagen en el software de la cámara del microscopio y haga clic en Anotaciones y Mediciones. En la sección Longitud, seleccione la herramienta de línea simple.Haga clic en la imagen, luego dibuje una línea a lo largo de la longitud del tubo y, a continuación, haga clic derecho para realizar el cálculo. Después, repita el procedimiento para todas las líneas de los tubos en la imagen seleccionando la herramienta de línea simple. Haga clic en la imagen, dibuje una línea a lo largo de la longitud del tubo y luego haga clic derecho.El software registrará la longitud de cada línea y mostrará los datos en la pantalla. Después de medir cada tubo en la imagen, haga clic en Exportar y luego elija Longitud a hoja de cálculo para exportar los datos de longitud a una hoja de cálculo. Sume todas las longitudes de los tubos de la hoja de cálculo para obtener la longitud total de los tubos.A continuación, calcule y registre la longitud promedio de los tubos. En este procedimiento, cultive y realice un ensayo de formación de tubos en la placa de 12 pocillos. Incube las células durante cuatro a 16 horas para permitir la formación de los tubos.Posteriormente, aspire el medio de cultivo celular y enjuague las células con un mililitro de PBS 1X frío sin calcio y magnesio. A continuación, agregue un mililitro de tampón PBS frío con 2,5 milimolar de EDTA sobre el cultivo y manténgalo en hielo durante 10 minutos. Después de 10 minutos, desprenda la mezcla de células y matriz extracelular del recipiente utilizando la punta de pipeta de 1.000 microlitros con la punta cortada.Luego, transfiera las células a un tubo frío de 15 mililitros. Lave la placa con cuatro mililitros de PBS frío con hielo y coloque la solución en el mismo tubo. A continuación, coloque el tubo en hielo durante una a cuatro horas e invierta el tubo varias veces hasta que la matriz extracelular se disuelva.Después de eso, centrifugue durante 10 minutos a cero grados Celsius. Luego, re-suspenda el pellet celular con un mililitro de PBS frío en un tubo de 1,5 mililitros sobre hielo. Vuelva a centrifugar durante cinco minutos a cero grados Celsius.Luego, deseche el sobrenadante y almacene las células a 80 grados Celsius. Estas dos imágenes muestran una formación exitosa de tubos endoteliales en la matriz extracelular normal y en la matriz extracelular GFR. La red interconectada de tubos muestra claramente que el crecimiento de los tubos es saludable en estos HUVEC.Estas dos imágenes muestran la inhibición de la formación de tubos por un inhibidor de CXCR2, SB225002, a 5,6 micromolar sobre la matriz extracelular normal y la matriz extracelular GFR. Los agregados aislados de HUVEC observados en esta imagen indican que las células no pudieron formar los tubos necesarios para conectarse entre sí. Este gráfico muestra que la respuesta de las HUVEC al inhibidor de CXCR2 sobre la matriz extracelular GFR es dependiente de la dosis.Tras el procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la RT-PCR cuantitativa o la secuenciación de ARN utilizando las células preparadas. Se pueden obtener datos como la longitud promedio de los tubos, el número total de tubos o el número total de puntos de bifurcación, utilizando imágenes para caracterizar el proceso de angiogénesis bajo condiciones experimentales.

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Un ensayo de la formación del tubo se utiliza para evaluar la actividad vascular de las células tumorales.

A Matrigel basado en tubo de ensayo de formación para evaluar la actividad de las células tumorales vasculogénica

El ensayo de formación de tubo es un método rápido, cuantificable para medir la angiogénesis in vitro. Las células endoteliales se combinan con los medios condicionados y se sembraron en extracto de membrana basal. La formación del tubo se produce dentro de horas y los túbulos recién formadas cuantificarse fácilmente.

Ensayo de formación de tubos de células endoteliales para la<em&gt; In Vitro</em&gt; Estudio de la angiogénesis

Se describe un bioensayo sencillo basado en células para la detección, cuantificación y seguimiento de la actividad de los miembros de la familia del factor de crecimiento endotelial vascular de ligandos. El ensayo utiliza receptores quiméricos expresados ​​en una línea celular dependiente de factor para proporcionar una evaluación semi-cuantitativa o cuantitativa de la unión al receptor y la reticulación por el ligando.

Un ensayo biológico simple para la Evaluación de Factores de Crecimiento Endotelial Vascular

Se describe un protocolo para la inducción en vitro de transición endotelio-mesénquima (EndMT), que es útil para la investigación de vías de señalización celulares involucradas en EndMT. En este modelo experimental, EndMT es inducida por el tratamiento con TGF-β en las células endoteliales MS-1.

Análisis molecular de transición endotelio-mesénquima inducida por transformación de señalización del Factor de crecimiento β

Aquí, evaluamos los efectos del extracto de agua de Ruta graveolens en la formación de la red de recipientes mediante el uso de un ensayo de formación de tubos en una matriz de sótano gelizado.

HUVEC Ensayo de formación de tubos para evaluar el impacto de los productos naturales en la angiogénesis

El sistema de ensayo de angiogénesis esferoide cocultura tridimensional está diseñado para imitar la angiogénesis fisiológica. Los esferoides de cocultivo están formados por dos precursores de células vasculares humanas, EFCC y MSC, e incrustados en gel de colágeno. El nuevo sistema es eficaz para evaluar moduladores angiogénicos y proporciona información más relevante al estudio in vivo.

Sistema de ensayo de angiogénesis tridimensional utilizando esferoides de cocultura formados por células formadoras de colonias endoteliales y células madre mesenquimales

El objetivo de este método es obtener matrices 3D derivadas de fibroblastos como un andamio natural para ensayos celulares posteriores. Los fibroblastos se sembran en una placa de cultivo pretratada y se estimulan con ácido ascórbico para la generación de matrices. Las matrices se descelularizan y se bloquean para cultivar células relevantes (por ejemplo, células endoteliales).

Sistema de matriz 3D derivado de fibroblastos aplicable al ensayo de formación de tubos endoteliales

Aquí se presenta un protocolo para el análisis de hibridación de ARN in situ de montaje completo en ensayos de formación de peces cebra y tubos en células endoteliales derivadas de células madre inducidas por el paciente para estudiar el papel de la endoglina en la formación vascular.

Hibridación en situ de montaje completo en embriones de pez cebra y ensayo de formación de tubos en iPSC-CE para estudiar el papel de la endoglina en el desarrollo vascular

El presente protocolo permite la recuperación de estructuras en forma de tubo formadas en el ensayo clásico de formación de tubos de angiogénesis in vitro , donde las células, como las células trofoblásticas, se organizan en estructuras similares a capilares sobre una capa de matriz de membrana basal extracelular. Las estructuras recuperadas se utilizan para el aislamiento de ARN y proteínas para diversos análisis bioquímicos.

Ensayo de recuperación de células trofoblásticas de angiogénesis y formación de tubos para el análisis de la expresión de marcadores de diferenciación

Este estudio presenta el ensayo bidimensional (2D) de migración de heridas por arañazo y el ensayo tridimensional (3D) de brotes esferoides, junto con sus respectivos métodos de análisis posteriores, incluida la extracción de ARN y la inmunocitoquímica, como ensayos adecuados para estudiar la angiogénesis in vitro.

Investigación de la angiogénesis a nivel funcional y molecular mediante el uso del ensayo de migración de heridas por arañazo y el ensayo de germinación de esferoides.

Aprende a cuantificar la formación de tubos en células endoteliales HUVEC usando matrices extracelulares normales y GFR. Este ensayo permite estudiar la angiogénesis y evaluar inhibidores de CXCR2 en investigación oncológica.

Tubo de Ensayo de la célula endotelial Formación estratégica: Comparación de la matriz extracelular y el factor de crecimiento reducido de la matriz extracelular (Video) | JoVE Journal

Tubo de Ensayo de la célula endotelial Formación estratégica: Comparación de la matriz extracelular y el factor de crecimiento reducido de la matriz extracelular

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