Aislamiento y Celular del fenotipo de células madre mesenquimales derivadas del líquido sinovial y la médula ósea de cerdos enanos

El objetivo general de este procedimiento es la recolección no invasiva de líquido sinovial y médula ósea de minicerdos para obtener células madre mesenquimales que se utilizarán en estudios de regeneración y de inmunomodulación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la terapia con células madre mesenquimales en otología, como cómo establecer el líquido sinovial en células madre mesenquimales y cómo caracterizarlas en comparación con las células madre mesenquimales derivadas de médula ósea. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de establecer eficazmente las propiedades clave de las células madre mesenquimales derivadas de líquido sinovial y de médula ósea de minicerdos, lo que resultará útil para su aplicación en pacientes.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de diversas enfermedades articulares, ya que la población de CEM derivadas del líquido sinovial en la cavidad sinovial está significativamente aumentada en pacientes atletas. Aunque este método puede aportar conocimientos sobre la medicina regenerativa, también puede aplicarse a otros estudios, como la investigación de enfermedades autoinmunes. Dado que las CEM de minicerdo son autólogas, la inmunosupresión podría interesar a los seres humanos.

Además de los otros científicos, quienes demostrarán el procedimiento serán Hyeon-Jeong Lee y Won-Jae Lee de mi nivel tres. Para comenzar, posicione un minicerdo anestesiado para acceder a la cresta ilíaca. A continuación, depile una región de 15 centímetros cuadrados en la cresta ilíaca, utilizando una afeitadora o tijeras eléctricas.

Luego, limpie alternativamente la piel expuesta tres veces con povidona-iodo y etanol al 70%. Una vez que esté completamente seco, coloque campos estériles. Ahora, recubra previamente una jeringa de diez mililitros con heparina, utilizando un enjuague de tres a cuatro mililitros.

Esto evitará que la médula ósea se coagule durante su extracción. Luego, justo en la cresta del hueso ilíaco, fije firmemente un extractor de médula ósea a la jeringa recubierta con heparina y extraiga al menos cinco mililitros de médula ósea. Para aislar las células de la médula ósea extraída, primero dilúyala con un volumen igual de DPBS en un tubo cónico de 15 mililitros a temperatura ambiente.

Luego, cargue tres mililitros de medio de centrifugación por densidad en un segundo tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, transfiera cuidadosamente cuatro mililitros de la médula ósea diluida sobre el medio de centrifugación por densidad para crear dos capas de solución. Ahora, centrifugue el tubo a 400 G durante 40 minutos a temperatura ambiente.

Las MNC deseadas se recogen en la capa blanca central. Aspire únicamente esta capa. Expulse la capa de MNC en un tubo cónico de 15 mililitros y dilúyala con siete a ocho mililitros de DPBS.

Luego, centrifugue las células a 500 G durante diez minutos a temperatura ambiente. Descarte el sobrenadante y lave las células sedimentadas dos veces con diez mililitros de DPBS, repitiendo el ciclo anterior de centrifugación. Después de los dos lavados, suspendemos los MNC en dos mililitros de ADMEM.

Luego, cargue las células en una placa de cultivo de tejidos de 35 milímetros e incúbelas a 38,5 grados Celsius en un incubador con 5% de dióxido de carbono humedecido. Después de 48 horas, aspire el medio junto con los MNC no adheridos. A continuación, agregue nuevamente dos mililitros de ADMEM fresco y continúe la incubación, cambiando el medio cada tres días.

Cuando las células alcancen una confluencia del 70 al 80 %, lave el cultivo con DPBS fresco. A continuación, disocie las células utilizando un mililitro de tripsina-EDTA al 0,25 % durante tres a cinco minutos a 37 grados Celsius. Recoja las células en diez mililitros de ADMEM y transfiéralas a un tubo cónico de 15 mililitros.

Luego, centrifugar las células a 300 G durante cinco minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. Ahora, suspender los MNC recolectados en un mililitro de ADMEM fresco y medir su densidad. Finalizar sembrando entre medio millón y tres cuartos de millón de células en matraces T25 con cuatro mililitros de ADMEM.

Incube los frascos de la misma manera que las placas, y cambie el medio cada tercer día. Prepare una sección de piel de 15x10 centímetros sobre la articulación femoral, tal como se hizo al preparar para la recolección de médula ósea. Luego, palpe para localizar las crestas de la rótula y la tibia debajo de la piel con el fin de identificar la articulación sinovial, e inserte una jeringa de tres mililitros con una aguja de calibre 23 directamente en la articulación.

Mediante succión suave, extraiga entre medio y un mililitro de líquido, y retire inmediatamente la aguja. Si el volumen de líquido sinovial es demasiado pequeño, lave la cavidad con DPBS para recoger el líquido sinovial junto con DPBS. El volumen de DPBS a utilizar varía según el tamaño de la cavidad sinovial.

El volumen óptimo de líquido sinovial es limitado en una articulación sana. El volumen varía según el tamaño y la condición patológica de su articulación. Para aislar las células del líquido sinovial, diluya el líquido con un volumen igual de DPBS en un tubo cónico de 15 mililitros a temperatura ambiente.

A continuación, eliminamos los residuos filtrando la dilución a través de un filtro celular de nailon de 40 micrones. Luego, agregue otros diez mililitros de DPBS y centrifugue la suspensión a 400 G durante diez minutos a temperatura ambiente. A continuación, deseche el sobrenadante y lave las células dos veces utilizando DPBS.

Suspendemos el pellet celular lavado en dos mililitros de ADMEM. A continuación, procedemos con el cultivo de las células tal como se demostró con las MSCs. Las MSCs se aislaron con éxito de la médula ósea y de las articulaciones sinoviales de los minicerdos y se expandieron in vitro.

La morfología de las CMM derivadas del líquido sinovial es similar a la de las CMM derivadas de la médula ósea: ambas presentan una forma fusiforme fibroblástica y son homogéneamente adherentes. Las CMM mostraron expresión positiva en la tinción de fosfatasa alcalina tras completar el tercer subcultivo. A continuación, se analizaron los marcadores de superficie en ambos cultivos.

Como era de esperar, ambos tipos de MSC expresaron significativamente CD29, CD44 y vimentina. En contraste, la expresión de CD34 y CD45 fue negativa y baja. Estos resultados fueron idénticos a los obtenidos mediante MSC distintivas, incluyendo células aisladas del líquido sinovial.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aspirar de forma no invasiva el líquido sinovial y la médula ósea para aislar sus CMM del minicerdo y cómo realizar la comparación y fenotipado de estas CMM. Al intentar este procedimiento, es importante recordar localizar el punto objetivo en la cresta ilíaca y en la articulación sinovial, determinado mediante una palpación cuidadosa. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como en modelos de osteoartritis o artritis reumatoide, con el fin de responder preguntas adicionales, como si no solo las CMM de la médula ósea, sino también las del líquido sinovial, tienen la misma capacidad para la iniciación del cartílago o del hueso y para la inmunosupresión.

Después de su desarrollo, esta técnica impulsó la terapia autóloga de las enfermedades articulares al ayudar a caracterizar las células madre mesenquimales derivadas de la articulación afectada o inflamada en pacientes con artritis.