Name: Aislamiento y Celular del fenotipo de células madre mesenquimales derivadas del líquido sinovial y la médula ósea de cerdos enanos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Aprende a aislar y cultivar células madre mesenquimales de líquido sinovial y médula ósea de cerdos enanos mediante técnicas no invasivas. Este protocolo permite caracterizar fenotípicamente las MSC mediante citometría de flujo para aplicaciones en medicina regenerativa y terapias autólogas de enfermedades articulares.

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Agradecemos el apoyo financiero proporcionado por el Programa BioGreen 21 de Próxima Generación (No. PJ007969), la Administración de Desarrollo Rural y la Fundación Nacional de Investigación (subvención No. NRF-2015R1D1A1A01056639) de la República de Corea.

Los experimentos con animales fueron autorizados por el Centro de Experimentación Animal para Biomédica en la Universidad Nacional de Gyeongsang. 1. Preparativos para realizar el procedimiento de Animales <ol><li> Preparar el adulto cerdos enanos hembra para la recogida no invasiva de las MSC de la médula ósea y el líquido sinovial. Realizar el examen clínico de los cerdos enanos un día antes de la anestesia y la recogida de muestras. <ol><li> Proporcionar los animales clínicamente normales para los exámenes físicos, que incluyen la temperatura corporal, la frecuencia respiratoria y la frecuencia cardíaca y de la observación del comportamiento y hematológicos estados de los cerdos, utilizando pruebas de conteo sanguíneo completo. Nota: los intervalos de parámetros para cerdos enanos clínicamente sanos son 11 a 29 / min para la velocidad de respiración, 68-98 / min para el ritmo cardíaco, y 37 a 38 ° C para la temperatura del cuerpo. </li></ol></li><li> Retire la ropa de cama comestible a partir de la jaula durante el período de ayuno preoperatorio de 6 - 12 horas prior para la administración de la anestesia para cerdos enanos jóvenes y adultos, 3 h de ayuno debe ser observado para los recién nacidos. Proporcionar agua potable hasta el momento de la anestesia. </li></ol> 2. Preparación de los animales para la anestesia <ol><li> Medicar los cerdos enanos antes de la administración de la anestesia con acepromazina (0,1 mg / kg), medetomidina (0,03 mg / kg), y atropina (0,04 mg / kg). <ol><li> Inyectar todos los medicamentos por vía intramuscular (IM) usando una aguja de 21 G con una longitud de al menos 30 mm para cerdos enanos adultos. Realizar la inyección IM 1-3 cm por detrás de la oreja en el músculo cervical lateral o en el músculo del muslo. Nota: Realizar todos los procedimientos sin provocar miedo o estrés en los animales o que requieren una manipulación brusca para inyectar la medicación previa. </li></ol></li><li> Coloque los cerdos enanos en una posición dorsal-reclinada. </li><li> Quince minutos después de la administración de la medicación previa, iniciar la anestesia utilizando 1,5% de administrador isofluranotrado por inhalación. <ol><li> Continuar la inhalación de isoflurano (1,5%) a través de un tubo endotraqueal, seguido de un aumento en la concentración de 2,5%, con oxígeno (1,5 L / min) como gas portador. </li></ol></li><li> Un seguimiento continuo de la frecuencia cardíaca, la temperatura corporal, y la saturación de oxígeno en sangre percutánea (SpO 2) de los cerdos enanos durante la anestesia. Utilice una manta de agua circulante a una temperatura de 38-39 ° C para mantener la temperatura corporal. Aplicar una pomada oftalmológica para proteger los ojos se sequen durante la anestesia. </li><li> Siga la clasificación de Guedel para evaluar la profundidad de la anestesia 13. </li></ol> 3. Preparativos para el aislamiento y cultivo celular <ol><li> Para cultivar las MSCs derivadas de médula ósea y el líquido sinovial, se preparan 500 ml de medio avanzado de Dulbecco Eagle modificado (ADMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% Glutamax, 10 ng / ml de crecimiento de fibroblastos básico factor (bFGF), y 1,0% de penicilina-estreptomicina (10.000 UI y 10.000 g / ml, respectivamente, Pen-Strep). <ol><li> Incubar la ADMEM a 38,5 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2 dentro de una incubadora de CO 2. </li></ol></li><li> Preparar 500 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) según las instrucciones del fabricante para el aislamiento de células y lavado. </li></ol> 4. Recopilación de Médula Ósea de la cerdos enanos <ol><li> Seleccione un área de aproximadamente 15 x 15 cm de tamaño en la cresta ilíaca (Figura 1), y quitar el pelo de esta área usando maquinillas de afeitar esterilizadas o una maquinilla eléctrica. Una vez que se coloca el cerdo enano, alternativamente fregar el sitio del procedimiento tres veces con los siguientes agentes de esterilización: yodo povidona y 70% de etanol. Después de que el área esté completamente seco, aplicar paños estériles. </li><li> Pre-capa de la jeringa 10 ml con 100 U / ml de heparina por lavado con 3 - 4 ml de heparina antes de ejecting el agente anti-coagulante. Nota: Realice este paso para evitar la coagulación en la jeringa durante la aspiración de médula ósea. </li><li> Extracto de un mínimo de 5 ml de médula ósea de la cresta ilíaca del hueso de la minipig bajo anestesia, utilizando un extractor de médula ósea (3,0 × 100 mm) firmemente unido a la jeringa 10 ml de heparina pre-revestido. </li></ol> 5. Aislamiento de células extraídas de la médula ósea y cultivo in vitro <ol><li> Aislar las células de la médula ósea extraída. <ol><li> Diluir la médula ósea se extrajo con un volumen igual de DPBS en un tubo cónico de 15 ml a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 3 ml de medio de centrifugación de densidad (Ficoll-Paque) al tubo cónico de 15 ml. </li><li> Diluir una capa de 4 ml de la médula ósea con DPBS, que se coloca en el soporte de centrifugación de densidad sin mezclar y centrifugar al 400 × g durante 40 min a temperatura ambiente. </li><li> Cosecha de la capa de células mononucleares(MNC) de la capa leucocitaria entre las dos capas que contienen el plasma (capa superior) y los medios de centrifugación de densidad (capa inferior), y transferir las multinacionales en un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Diluir las multinacionales transferidos con 7 - 8 ml de DPBS y centrifúguelas a 500 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante y lavar las células dos veces con DPBS. </li><li> Suspender el sedimento de células en 2 ml de ADMEM y transferirla a una placa de cultivo de tejidos de 35 mm. Incubar la placa de cultivo a 38,5 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2. </li></ol></li><li> El cultivo in vitro de células aisladas de la médula ósea. <ol><li> Después de 48 hr, aspirar el medio con las células que no se han adherido a la placa, y reemplazar 2 ml de la ADMEM e incubar al 38,5 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2. Cambiar el medio cada tres días. </li><li> En 70 a 80% de confluencia, se lavan las células con DPBS, disociar con 1 ml de 0,25%tripsina / EDTA, y incubarlos a 37 ° C durante 3 - 5 min hasta que las células se separan. </li><li> Recoger las células utilizando 10 ml de ADMEM, transferirlos en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar ellos en 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Descartar el sobrenadante. </li><li> Suspender las células recogidas en 1 ml de ADMEM fresco y contarlos utilizando un hemocitómetro. </li><li> Colocar las células en un 5 a 7,5 x 10 5 / 25T matraz que contiene 4 ml de ADMEM y incubarlos a 38,5 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2. Cambiar el medio cada tres días. </li></ol></li></ol> 6. Recogida de líquido sinovial de los cerdos enanos <ol><li> Al igual que en el procedimiento de aspiración de médula ósea, seleccionar un área adecuada de aproximadamente 15 x 10 cm (longitud / anchura) sobre la articulación del fémur, y quitar el pelo usando maquinillas de afeitar esterilizadas o una maquinilla eléctrica, siga por procedimientos de sanitización (paso 4.1). </li><li> Inserte una jeringa de 3 ml con un 23 Gaguja en la articulación después de los puntos de referencia (palpación de la cresta de la rótula y la tibia). <ol><li> Aplicar succión suave a las jeringas para la aspiración de líquido sinovial en la articulación. El volumen aproximado de líquido sinovial extraída de un conjunto es de 0,5 - 1 ml, pero esto varía de acuerdo con el tamaño de la minipig o la articulación. Enjuague a través de DPBS en la cavidad sinovial si el volumen recogido de líquido sinovial es demasiado pequeño. </li><li> Inmediatamente retirar la jeringa para evitar la contaminación con sangre. </li></ol></li></ol> 7. aislamiento de células del líquido sinovial y recogió el cultivo in vitro <ol><li> Aislar las células del líquido sinovial aspirado. <ol><li> Diluir el líquido sinovial de aspiración con un volumen igual de DPBS en un tubo cónico de 15 ml a temperatura ambiente. </li><li> Para eliminar los desechos, se filtra el líquido sinovial diluida usando un filtro de células de nylon de 40 micras. </li><li> Añadir 10 ml de DPBS al tubo que contiene el filtrado sinovialfluido y centrifugar al 400 × g durante 10 min a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante y lavar las células dos veces con DPBS. </li><li> Suspender el sedimento de células en 2 ml de ADMEM, colocar las células en un 2 - placa de cultivo tisular 3 x 10 5 células / 35 mm con 2 ml de ADMEM, y incubarlos a 38,5 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2 . </li></ol></li><li> Repita el paso 5.2 para el cultivo in vitro de las MSC de líquido derivado sinoviales aisladas. </li></ol> 8. Después del procedimiento de los cerdos enanos <ol><li> Si es necesario, cerrar la piel en el sitio de la inyección extractor de médula ósea con una sola sutura con una grapadora de piel, después de la extracción de la médula ósea. </li><li> Después de que se completa el procedimiento, administrar una inyección intramuscular de enrofloxacina (5 mg / kg) y meloxicam (0,2 mg / kg) a los cerdos enanos una vez al día durante 3 días. </li><li> Después de que se completa el procedimiento, la desinfección de la médula ósea y el sitio de recogida de fluido sinovialcon 0,1% de yodo povidona una vez al día durante 3 días. Observe cuidadosamente a diario para vigilar los signos de complicaciones (por ejemplo, hinchazón, pus o enrojecimiento). </li></ol> 9. Fenotipificación celular mediante citometría de flujo <ol><li> Cuando las MSCs son 70 a 80% de confluencia en pasajes 3 - 5, se lavan las células con DPBS y tratarlos con 1 ml de 0,25% (v / v) de tripsina / EDTA. A continuación, los incuban a 37 ° C durante 3 - 5 min hasta que se separan las células. </li><li> Recoger las células utilizando 10 ml de DPBS, transferirlos en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar ellos en 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Desechar la solución sobrenadante. </li><li> Para fijar las células, suspender el sedimento celular en 10 ml de una solución de formaldehído al 3,7% y mantenerlos a 4 ° C durante un día antes del análisis. <ol><li> Un día después de la fijación, se lavan las células con DPBS dos veces con centrifugación a 300 xg durante 5 min cada vez. Desechar la solución sobrenadante. </li><li> Suspender el sedimento de células en 4 mlde DPBS, que se complementa con 1% (w / v) de albúmina de suero bovino (BSA), e incubar el sedimento durante 1 hora a 4 ° C para bloquear interacciones no específicas Fc mediada. </li><li> Distribuir partes alícuotas de 500 l de la suspensión celular en tubos de 1,5 ml. </li><li> Para los anticuerpos no conjugados (CD29 y vimentina), se lavan las células por centrifugación a 300 xg durante 3 min. Desechar la solución sobrenadante. </li><li> Suspender el sedimento de células en 500 l de una dilución 1: 100 del anticuerpo primario y se incuba durante 1 hora a 4 ° C. </li><li> Lavar las células dos veces con 1% de albúmina de suero bovino por centrifugación a 300 xg durante 5 min cada vez. Desechar la solución sobrenadante. </li><li> Suspender el sedimento de células en 500 l de una dilución 1: 100 de la isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado con anticuerpo secundario e incubar durante 1 h en la oscuridad a 4 ° C. </li></ol></li><li> Para los anticuerpos conjugados con FITC (isotipo, CD34, CD44 y CD45), se lavan las células por centrifugación a 300 × g durante 3 min. Desechar la solución sobrenadante. <ol><li> Suspender el sedimento celular en 500 l de la 1: 100 de anticuerpo conjugado con FITC y se incuba durante 1 hora en la oscuridad a 4 ° C. </li><li> Por tanto en condiciones de tinción, se lavan las células dos veces con DPBS por centrifugación a 300 xg durante 5 min cada vez. Desechar la solución sobrenadante. </li><li> Suspender las células en 500 l de DPBS, transferirlos a un tubo de 5 ml de fondo redondo, y analizar los resultados utilizando un citómetro de flujo 8. </li></ol></li></ol>

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Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

Cerdos enanos se utilizaron para establecer el aislamiento MSC de la médula ósea y el líquido sinovial. Para eliminar diversas condiciones fisiológicas, tales como la edad, el género, y la enfermedad, cerdos enanos de donantes fondo isogénicas se eligieron para evaluar con precisión la caracterización dependiente fuente de células. Los cerdos son conocidos por ser anatómicamente, fisiológicamente, y genéticamente similares a los humanos y, en particular, cerdos enanos pueden producir órganos tamaño emparejados; por lo t...

Las células madre mesenquimales multipotentes (MSCs) se pueden clasificar en linajes de células mesenquimales, y las MSCs se han establecido y aislado de diversas fuentes de tejidos, como la médula ósea, los cordones umbilicales, las placentas, el tejido adiposo, la piel dérmica, el músculo esquelético, los folículos pilosos, las membranas sinoviales y los dientes1-5. Actualmente, se ha prestado atención a las MSC derivadas de sinoviales porque estas células pueden ayudar a tratar enfermedades articulares, como la fracción ósea, la osteoartritis y la artritis reumatoide (AR), y debido al potencial regenerativo de las MSC en el cartílago o el hueso dañados, también pueden ayudar a tratar la modulación inmune o las enfermedades autoinmunes6-8. La mayoría de las investigaciones sobre MSCs derivadas de fuentes sinoviales han empleado MSCs de la membrana sinovial en lugar de del líquido sinovial2,9; por lo tanto, la comprensión biológica de las MSC derivadas del líquido sinovial es limitada.
El líquido sinovial es una fuente fácilmente accesible de MSCs, que puede ser aspirada durante los diagnósticos o tratamientos de pacientes y durante las confirmaciones diagnósticas de diversas afecciones de artritis que no requieren procedimientos invasivos, como la osteoartritis o la AR. La población de MSCs derivadas del líquido sinovial en la cavidad sinovial está significativamente aumentada en los pacientes artríticos en comparación con los pacientes no artríticos10-12. Por lo tanto, el líquido sinovial es una excelente fuente candidata para las MSC, particularmente para la terapia con células madre autólogas en pacientes con articulaciones inflamadas o lesionadas. Además, las MSC derivadas del líquido sinovial tienen una capacidad condrogénica, capacidades de inmunomodulación y una alta tasa de proliferación. Este estudio estableció protocolos para la extracción de médula ósea y la aspiración de líquido sinovial de minicerdos utilizando métodos no invasivos y para la expansión in vitro de células aisladas y el análisis de fenotipos celulares.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco avanzado' s medio Eagle modificado (ADMEM)</td><td>Gibco</td><td>12491-023</td><td>MSC medio de cultivo</td></tr><tr><td>Dulbecco' Solución salina tamponada con fosfato (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Medio de lavado celular, libre de Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>Componente del medio MSCs</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>Componente del medio MSCs</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>Componente del medio MSCs</td></tr><tr><td>Factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF)</td><td>Simga</td><td>F0291</td><td>Componente del medio MSCs</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A6003</td><td>Componente del medio MSCs</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td>Reactivo de disociación celular&nbsp;</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td>Componente del medio MSCs</td></tr><tr><td>Anticuerpo de isotipo</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD 550616</td><td>Control de isotipo</td></tr><tr><td>Anticuerpos CD29</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD 552369</td><td>Integrina beta-1 Marcador de MSCs Marcador</td></tr><tr><td>CD44</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD 553133</td><td>Glicoproteína de superficie celular Marcador de MSCs</td></tr><tr><td>Anticuerpo CD45</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD 340664</td><td>Marcador de células madre hematopoyéticas Anticuerpos</td></tr><tr><td>CD34</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD 555821</td><td>Marcador de células madre hematopoyéticas</td></tr><tr><td>Anticuerpos CD90</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD 555595 Thy-1</td><td>glicoproteína de membrana Marcador de MSCs</td></tr><tr><td>MHC Anticuerpo MHC Clase II</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-32247 Marcador de</td><td>células presentadoras de antígenos</td></tr><tr><td>Anticuerpo Vimentina</td><td>Sigma Sigma-S6389</td><td></td><td>Filamento intermedio tipo III Marcador MSCs</td></tr><tr><td>Fosfatasa alcalina</td><td>Promega</td><td>S3841</td><td>Mezcla de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) y tetrazolio azul nitro (NBT)</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>Centrifugación en gradiente de densidad Filtro</td></tr> de <tr><td>células</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>40 &micro; m Filtro de células de nailon</td></tr><tr><td>tubo cónico de poliestireno de 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td></td><td>351095 Recogida de muestras y aislamiento celular</td></tr><tr><td>Placas de 35 mm</td><td>Nunc</td><td>153066</td><td>Placa de cultivo celular</td></tr><tr><td>Extractor de médula ósea</td><td>GmbH Medizintechnologie, Alemania</td><td>1145-1W010</td><td>TrokaBone, 3,0 x 100 mm</td></tr><tr><td>Cámara de hematocrito</td><td>Marinfeld</td><td>640130</td><td>Cámara</td></tr> <tr>de recuento de células<td>Atropina</td><td>Jeil Pharmaceutical Co, Corea</td><td></td> del Sur <td>Sulfato de atropina</td></tr><tr><td>Hidrato de acepromazina</td><td>Samu Median, Corea</td><td></td> del Sur <td>Fármaco sedante y antiemético preanestésico</td></tr><tr><td>Medetomidina</td><td>Pfizer</td><td></td><td>Fármaco anestésico y analgésico</td></tr><tr><td>Enrofloxacina</td><td>Bayer Healthcare, Alemania</td><td></td><td>Antibióticos</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Sobre Medicina Veterinaria, Argentina</td><td></td><td>Medicamento antiinflamatorio y analgésico</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Hana pharm, Corea</td><td></td> del Sur <td>Anestesia inhalatoria</td></tr><tr><td>Povidona yodado&nbsp;</td><td>Korea Pharma, Corea</td><td></td> del Sur <td>Agente de esterilización</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>Agente de esterilización</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td>Agente anticoagulante</td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>Agente de fijación celular</td></tr><tr><td>Pomada oftalmológica&nbsp;</td><td>Pfizer</td><td></td><td>Oxitetraciclina HCl con sulfato de polimixina B</td></tr><tr><td>Manta de agua circulante</td><td>Industrias</td><td></td> Gaymar <td>Sistema de calentamiento durante y después de la anestesia</td></tr><tr><td>Grapadora de piel</td><td>Covidien, EE. UU.</td><td></td><td>Cierre de la piel</td></tr><tr><td>con sutura CO2 Incubadora</td><td>Thermo Forma</td><td>3111</td><td>Equipo de cultivo celular</td></tr><tr><td>Citómetro de flujo</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Analizador de células</td></tr><tr><td>Minipig</td><td>PWG Genetics Korea, Ltd.</td><td>Cerdo miniatura</td> <td>tipo T</td></tr></tbody></table>

aislamiento y celular del fenotipo de células madre mesenquimales derivadas del líquido sinovial y la médula ósea de cerdos enanos

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Las células madre mesenquimales (MSCs) se han establecido después del aislamiento de varias fuentes de tejidos, incluyendo la médula ósea y el líquido sinovial. Recientemente, se informó que las MSC derivadas del líquido sinovial tienen potencial de diferenciación de múltiples linajes y características inmunomoduladoras, lo que indica que estas células se pueden usar para ingeniería de tejidos y tratamientos sistémicos. Este estudio presenta un protocolo para el aislamiento simple y no invasivo de MSCs derivadas de la médula ósea y el líquido sinovial de minipigs para analizar marcadores de superficie celular para el fenotipado celular y el cultivo in vitro. Utilizando minicerdos sexualmente maduros de seis meses de edad, se extrajo médula ósea del hueso de la cresta ilíaca utilizando un extractor de médula ósea, y el líquido sinovial se aspiró de la articulación femorotibial. Los procedimientos para la recolección de muestras de ambas fuentes no fueron invasivos. Se proporcionan los protocolos para el aislamiento efectivo de MSCs a partir de fuentes celulares recolectadas y para la creación de condiciones de cultivo in vitro para expandir MSCs estables de minipigs y la aplicación de tratamientos autólogos sistémicos. Para el fenotipado celular, los marcadores de superficie celular de ambas células se analizaron mediante citometría de flujo. En los resultados, las MSC se aislaron del líquido sinovial de los minicerdos y mostraron que las MSC derivadas del líquido sinovial tienen una morfología y un fenotipo celular similares a las MSC derivadas de la médula ósea. Por lo tanto, el líquido sinovial obtenido de forma no invasiva es una valiosa fuente de MSCs.

Establecimiento de las MSC derivadas de la médula ósea y de líquido sinovial de los cerdos enanos MSCs se aislaron con éxito de la médula ósea y de las articulaciones sinoviales articulares de los cerdos enanos y se expandieron in vitro (Figura 2). Jeringa de aspiración de líquido sinovial es simple, y es posible obtener suficientes células adherentes durante el cultivo in vitro</...

Se presenta un protocolo que establece células madre mesenquimales (MSCs) aisladas del líquido sinovial y de la médula ósea de minicerdos y recolectadas de forma no invasiva mediante aspiración con jeringa. El fenotipado celular se realizó mediante citometría de flujo después del aislamiento celular y cultivo in vitro de médula ósea y fluidos sinoviales derivados de MSCs.

Aislamiento y Celular del fenotipo de células madre mesenquimales derivadas del líquido sinovial y la médula ósea de cerdos enanos

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

El objetivo general de este procedimiento es la recolección no invasiva de líquido sinovial y médula ósea de minicerdos para obtener células madre mesenquimales que se utilizarán en estudios de regeneración y de inmunomodulación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la terapia con células madre mesenquimales en otología, como cómo establecer el líquido sinovial en células madre mesenquimales y cómo caracterizarlas en comparación con las células madre mesenquimales derivadas de médula ósea. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de establecer eficazmente las propiedades clave de las células madre mesenquimales derivadas de líquido sinovial y de médula ósea de minicerdos, lo que resultará útil para su aplicación en pacientes.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de diversas enfermedades articulares, ya que la población de CEM derivadas del líquido sinovial en la cavidad sinovial está significativamente aumentada en pacientes atletas. Aunque este método puede aportar conocimientos sobre la medicina regenerativa, también puede aplicarse a otros estudios, como la investigación de enfermedades autoinmunes. Dado que las CEM de minicerdo son autólogas, la inmunosupresión podría interesar a los seres humanos.Además de los otros científicos, quienes demostrarán el procedimiento serán Hyeon-Jeong Lee y Won-Jae Lee de mi nivel tres. Para comenzar, posicione un minicerdo anestesiado para acceder a la cresta ilíaca. A continuación, depile una región de 15 centímetros cuadrados en la cresta ilíaca, utilizando una afeitadora o tijeras eléctricas.Luego, limpie alternativamente la piel expuesta tres veces con povidona-iodo y etanol al 70%. Una vez que esté completamente seco, coloque campos estériles. Ahora, recubra previamente una jeringa de diez mililitros con heparina, utilizando un enjuague de tres a cuatro mililitros.Esto evitará que la médula ósea se coagule durante su extracción. Luego, justo en la cresta del hueso ilíaco, fije firmemente un extractor de médula ósea a la jeringa recubierta con heparina y extraiga al menos cinco mililitros de médula ósea. Para aislar las células de la médula ósea extraída, primero dilúyala con un volumen igual de DPBS en un tubo cónico de 15 mililitros a temperatura ambiente.Luego, cargue tres mililitros de medio de centrifugación por densidad en un segundo tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, transfiera cuidadosamente cuatro mililitros de la médula ósea diluida sobre el medio de centrifugación por densidad para crear dos capas de solución. Ahora, centrifugue el tubo a 400 G durante 40 minutos a temperatura ambiente.Las MNC deseadas se recogen en la capa blanca central. Aspire únicamente esta capa. Expulse la capa de MNC en un tubo cónico de 15 mililitros y dilúyala con siete a ocho mililitros de DPBS.Luego, centrifugue las células a 500 G durante diez minutos a temperatura ambiente. Descarte el sobrenadante y lave las células sedimentadas dos veces con diez mililitros de DPBS, repitiendo el ciclo anterior de centrifugación. Después de los dos lavados, suspendemos los MNC en dos mililitros de ADMEM.Luego, cargue las células en una placa de cultivo de tejidos de 35 milímetros e incúbelas a 38,5 grados Celsius en un incubador con 5% de dióxido de carbono humedecido. Después de 48 horas, aspire el medio junto con los MNC no adheridos. A continuación, agregue nuevamente dos mililitros de ADMEM fresco y continúe la incubación, cambiando el medio cada tres días.Cuando las células alcancen una confluencia del 70 al 80 %, lave el cultivo con DPBS fresco. A continuación, disocie las células utilizando un mililitro de tripsina-EDTA al 0,25 % durante tres a cinco minutos a 37 grados Celsius. Recoja las células en diez mililitros de ADMEM y transfiéralas a un tubo cónico de 15 mililitros.Luego, centrifugar las células a 300 G durante cinco minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. Ahora, suspender los MNC recolectados en un mililitro de ADMEM fresco y medir su densidad. Finalizar sembrando entre medio millón y tres cuartos de millón de células en matraces T25 con cuatro mililitros de ADMEM.Incube los frascos de la misma manera que las placas, y cambie el medio cada tercer día. Prepare una sección de piel de 15x10 centímetros sobre la articulación femoral, tal como se hizo al preparar para la recolección de médula ósea. Luego, palpe para localizar las crestas de la rótula y la tibia debajo de la piel con el fin de identificar la articulación sinovial, e inserte una jeringa de tres mililitros con una aguja de calibre 23 directamente en la articulación.Mediante succión suave, extraiga entre medio y un mililitro de líquido, y retire inmediatamente la aguja. Si el volumen de líquido sinovial es demasiado pequeño, lave la cavidad con DPBS para recoger el líquido sinovial junto con DPBS. El volumen de DPBS a utilizar varía según el tamaño de la cavidad sinovial.El volumen óptimo de líquido sinovial es limitado en una articulación sana. El volumen varía según el tamaño y la condición patológica de su articulación. Para aislar las células del líquido sinovial, diluya el líquido con un volumen igual de DPBS en un tubo cónico de 15 mililitros a temperatura ambiente.A continuación, eliminamos los residuos filtrando la dilución a través de un filtro celular de nailon de 40 micrones. Luego, agregue otros diez mililitros de DPBS y centrifugue la suspensión a 400 G durante diez minutos a temperatura ambiente. A continuación, deseche el sobrenadante y lave las células dos veces utilizando DPBS.Suspendemos el pellet celular lavado en dos mililitros de ADMEM. A continuación, procedemos con el cultivo de las células tal como se demostró con las MSCs. Las MSCs se aislaron con éxito de la médula ósea y de las articulaciones sinoviales de los minicerdos y se expandieron in vitro.La morfología de las CMM derivadas del líquido sinovial es similar a la de las CMM derivadas de la médula ósea: ambas presentan una forma fusiforme fibroblástica y son homogéneamente adherentes. Las CMM mostraron expresión positiva en la tinción de fosfatasa alcalina tras completar el tercer subcultivo. A continuación, se analizaron los marcadores de superficie en ambos cultivos.Como era de esperar, ambos tipos de MSC expresaron significativamente CD29, CD44 y vimentina. En contraste, la expresión de CD34 y CD45 fue negativa y baja. Estos resultados fueron idénticos a los obtenidos mediante MSC distintivas, incluyendo células aisladas del líquido sinovial.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aspirar de forma no invasiva el líquido sinovial y la médula ósea para aislar sus CMM del minicerdo y cómo realizar la comparación y fenotipado de estas CMM. Al intentar este procedimiento, es importante recordar localizar el punto objetivo en la cresta ilíaca y en la articulación sinovial, determinado mediante una palpación cuidadosa. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como en modelos de osteoartritis o artritis reumatoide, con el fin de responder preguntas adicionales, como si no solo las CMM de la médula ósea, sino también las del líquido sinovial, tienen la misma capacidad para la iniciación del cartílago o del hueso y para la inmunosupresión.Después de su desarrollo, esta técnica impulsó la terapia autóloga de las enfermedades articulares al ayudar a caracterizar las células madre mesenquimales derivadas de la articulación afectada o inflamada en pacientes con artritis.

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