Aislamiento y Celular del fenotipo de células madre mesenquimales derivadas del líquido sinovial y la médula ósea de cerdos enanos

El objetivo general de este procedimiento es la recolección no invasiva de líquido sinovial y médula ósea de minicerdos para recolectar células madre mesenquimales para su uso en estudios de regeneración e inmunomodulación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la terapia de MSC de los otólogos, como por ejemplo, cómo establecer el líquido sinovial en las MSC y cómo caracterizarlas en comparación con las MSC de la médula ósea. La principal ventaja de esta técnica es establecer de manera efectiva las propiedades clave del líquido sinovial y las MSC derivadas de la médula ósea de minicerdos, que serán útiles para su aplicación en pacientes.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de diversas enfermedades articulares, ya que la población de MSC derivada del líquido sinovial en la cavidad sinovial aumenta significativamente en pacientes deportistas. Aunque este método puede proporcionar información sobre la medicina regenerativa, también se puede aplicar a otros estudios, como la investigación de enfermedades autoinmunes. Debido a que las MSC de minicerdos son autólogas, la inmunosupresión podría interesar a los humanos.

Además de los otros científicos, demostrarán el procedimiento Hyeon-Jeong Lee y Won-Jae Lee de mi nivel tres. Para empezar, orienta a un minicerdo anestesiado para acceder a la cresta ilíaca. A continuación, depila una región de 15 centímetros cuadrados en la cresta ilíaca, con una navaja de afeitar o una maquinilla.

A continuación, frote alternativamente la piel expuesta tres veces con povidona yodada y etanol al 70%. Una vez que esté completamente seco, aplique cortinas estériles. Ahora, recubra previamente una jeringa de diez mililitros con heparina, usando un enjuague de tres a cuatro mililitros.

Esto evitará que la médula ósea se coagule mientras se extrae. Luego, precisamente en la cresta del hueso ilíaco, conecte firmemente un extractor de médula ósea a la jeringa recubierta de heparina y extraiga al menos cinco mililitros de médula ósea. Para aislar las células de la médula ósea extraída, primero diluya con un volumen igual de DPBS en un tubo cónico de 15 mililitros a temperatura ambiente.

Luego, cargue tres mililitros de medio de centrifugación de densidad en un segundo tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, transfiera con cuidado cuatro mililitros de la médula ósea diluida al medio de centrifugación por densidad para crear dos capas de solución. Ahora, centrifuga el tubo a 400 Gs durante 40 minutos a temperatura ambiente.

Las MNC deseadas se recogen en la capa blanca central. Aspira solo esta capa. Expulse la capa de MNC en un tubo cónico de 15 mililitros y dilúyalo con siete a ocho mililitros de DPBS.

A continuación, centrifugar las células a 500 Gs durante diez minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y lave las celdas paletizadas dos veces con diez mililitros de DPBS, repitiendo el ciclo de centrifugación anterior. Después de los dos lavados, suspendemos las MNC en dos mililitros de ADMEM.

A continuación, cargue las células en una placa de cultivo de tejidos de 35 milímetros e incube a 38,5 grados centígrados en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5%. Después de 48 horas, aspire el medio junto con las MNC no conectadas. A continuación, vuelva a añadir dos mililitros de ADMEM fresco y continúe la incubación, cambiando el medio cada tres días.

Cuando las células alcancen un 70 a 80% de confluencia, lavar el cultivo con DPBS fresco. A continuación, disocie las células, utilizando un mililitro de tripsina-EDTA al 0,25% durante tres a cinco minutos a 37 grados centígrados. Recoja las células en diez mililitros de ADMEM y transfiéralas a un tubo cónico de 15 mililitros.

Luego, centrifuga las células a 300 g durante cinco minutos a temperatura ambiente y desecha el sobrenadante. Ahora, suspenda las multinacionales cosechadas en un mililitro de ADMEM fresco y mida su densidad. Termine con el recubrimiento de entre 1/2 y tres cuartos de millón de células en matraces T25 con cuatro mililitros de ADMEM.

Incubar los matraces al igual que las placas, y cambiar el medio cada tres días. Prepare una sección de piel de 15x10 centímetros sobre la articulación femoral, como se hizo cuando se preparó para las recolecciones de médula ósea. Luego, palpa las crestas de la rótula y la tibia debajo de la piel para identificar la articulación sinovial e inserta una jeringa de tres mililitros con una aguja de calibre 23, con precisión en la articulación.

Con una succión suave, extraiga entre 1/2 y un mililitro de líquido y retire inmediatamente la aguja. Si el volumen de líquido sinovial es demasiado pequeño, enjuague la cavidad con DPBS para recolectar el líquido sinovial con DPBS. El volumen de DPBS a utilizar varía con el tamaño de la cavidad sinovial.

El volumen óptimo de líquido sinovial es limitado en una articulación sana. El volumen varía con el tamaño y la condición patológica de su articulación. Para aislar las células del líquido sinovial, diluya el líquido con un volumen igual de DPBS en un tubo cónico de 15 mililitros a temperatura ambiente.

A continuación, movemos los residuos filtrando la dilución a través de un colador de células de nailon de 40 micras. A continuación, añade diez mililitros más de DPBS, y centrifuga la suspensión a 400 Gs durante diez minutos a temperatura ambiente. A continuación, deseche el sobrenadante y lave las células dos veces, usando DPBS.

Suspendemos el palet de celda lavada en dos mililitros de ADMEM. A continuación, se procedió al cultivo de las células, tal y como se demostró con las MSCs, que se aislaron con éxito de la médula ósea y de las articulaciones sinoviales de los minicerdos y se expandieron in vitro.

La morfología de las MSC derivadas del líquido sinovial es similar a la de las MSC derivadas de la médula ósea: ambas tienen una forma de huso fibroblástico y son homogéneamente adherentes. Las MSCs mostraron expresión positiva para la tinción de fosfatasa alcalina después de que se completó el tercer subcultivo. A continuación, se analizaron los marcadores de superficie en ambos cultivos.

Como se esperaba, ambos tipos de MSC expresaron significativamente CD29, CD44 y Vimentina. Por el contrario, la expresión de CD34 y CD45 fue negativa y baja. Estos resultados fueron idénticos a los obtenidos a través de MSCs distintivas, incluyendo células aisladas de líquido sinovial.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aspirar de manera no invasiva el líquido sinovial y la médula ósea para aislar su MSC de minipigs y cómo realizar la comparación y el fenotipado de este MSC. Al intentar este procedimiento, es importante recordar ubicar el punto objetivo en la cresta ilíaca y el sinovial, determinado por una palpación cuidadosa. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como en los modelos de osteoartritis o artritis reumatoide, para responder a preguntas adicionales como si no solo las MSC de la médula ósea sino también las MSC del líquido sinovial tienen una capacidad similar para la iniciación del cartílago o el hueso y las inmunosupresiones.

Tras su desarrollo, esta técnica avanzó en la terapia autóloga de las enfermedades articulares al ayudar a caracterizar las MSC derivadas de la articulación atacada o inflamada en pacientes con artritis.