Modelado de la distrofia miotónica 1 en las células C2C12 mioblastos

El objetivo general de estos procedimientos de mantenimiento, transfección y transducción de mioblastos es establecer un modelo de distrofia miotónica de una sola célula para el estudio de la distrofia miotónica y otras enfermedades musculares. Este método puede ayudar a establecer los modelos de células mioblastos M1 que serán útiles para investigar el mecanismo detallado de la patogénesis de M1. Esta manipulación génica de múltiples niveles de mioblastos C2C12 permite el modelado de eventos patológicos secuenciales y genéticos en las M1,24 horas antes de su placa de transfección siete veces 10 a la quinta célula C2C12 por pocillo en una placa de seis pocillos.

Al día siguiente, agregue dos micro gramos del ADN plasmídico de interés en 200 microlitros de temperatura ambiente, libre de suero, medio y haga un breve vórtice de la solución. A continuación, agregue seis microlitros de reactivo de transfección a temperatura ambiente al medio e inmediatamente agite la solución durante 30 segundos. A continuación, incubar el medio a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Durante los últimos cinco minutos de la incubación. Reemplace el medio en cada pocillo con dos coma cinco mililitros de medio de crecimiento libre de suero fresco y agregue 200 microlitros de mezcla de transfección a cada pocillo. Regrese la placa a la incubadora de cultivos celulares durante cuatro horas.

A continuación, examine las células al microscopio para detectar cambios en su morfología y adhesión. Si se observa citotoxicidad, reemplace el medio libre de suero con el medio de crecimiento. 48 horas después de la transfección, agregue el antibiótico de selección apropiado en un medio de crecimiento fresco cada dos días durante 10 días.

Hasta que el control transfectado sin plásmidos bien no contiene células vivas. Para preparar el retrovirus, primero se coloque una placa cuatro veces 10 a la sexta celda de empaquetamiento basada en HEK293 ecotrópico en una placa de 100 milímetros que contenga medio de cultivo celular. Al día siguiente, mezcle 15 microgramos del ADN plasmídico de interés en un mililitro de medio de crecimiento libre de suero y haga un vórtice breve en el tubo.

A continuación, agregue 30 microlitros de reactivo de transfección a temperatura ambiente al medio e inmediatamente agite la solución durante 30 segundos. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, agregue la mezcla de transfección gota a gota a las celdas ecotrópicas y agite suavemente el plato. Regrese la placa a la incubadora de cultivo celular durante 24 horas, reemplazando el medio con 10 mililitros de medio de crecimiento fresco a 37 grados centígrados al día siguiente.

48 horas después de la transfección, use una pipeta para transferir los sobrenadantes que contienen retroviral a un solo tubo cónico de 50 mililitros para su almacenamiento durante la noche a cuatro grados centígrados. Luego agregue 10 mililitros de medio caliente nuevo por el costado de la placa y devuelva el cultivo a la incubadora. Coseche el segundo lote de virus retro 60 horas después de la transfección.

Juntándolo con el retrovirus recogido a las 48 horas. Gire el sobrenadante para eliminar cualquier residuo celular y transfiera el retrovirus a un nuevo tubo de 50 mililitros. Ahora lave cada pocillo de un cultivo celular C2C12 con tres mililitros de PPS a temperatura ambiente, seguido de la adición de 500 microlitros de EDTA de tripsina punto cero dos al cinco por ciento para una incubación de cinco minutos a 37 grados Celsius.

Cuando las células se hayan desprendido, neutralice la reacción en cada pocillo con tres mililitros de medio de crecimiento y triture el cultivo de seis a ocho veces para disociar las células en una sola suspensión celular. Después de contar, agregue ocho veces 10 a las quintas celdas a un plato de 60 mililitros y agregue tres mililitros de medio de crecimiento. A continuación, infecte las células con cero coma cinco mililitros de retro virus y devuelva la placa a la incubadora durante 48 horas.

Después de dos días, alimente las células con tres mililitros de medio de crecimiento fresco, complementado con el antibiótico de selección adecuado todos los días durante cinco días. Hasta que el cultivo de control C2C12 no transducido no contenga más células vivas. Para la transducción lentiviral de células C2C12, en un gabinete de nivel de bioseguridad dos, placa cuatro veces 10 a la sexta células 293T en una placa de 100 milímetros con medio de cultivo celular HEK293.

Al día siguiente, mezcle los vectores de empaquetamiento lenitviral con ocho microgramos del vector de transferencia lenitviral apropiado, en un mililitro de medio de cultivo celular libre de suero. Agite la mezcla brevemente y agregue 36 microlitros de reactivo de transfección precalentado. A continuación, agita el medio durante otros 30 segundos e incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Al final de la incubación, agregue la mezcla de transfección a las células 293T, agite suavemente la placa y devuelva las células a la incubadora. Después de 24 horas, reemplace la mezcla de transfección con 10 mililitros de medio de cultivo fresco. Después de 48 horas, transfiera el lentivirus que contiene sobrenadante a un tubo cónico de 50 mililitros para un almacenamiento de cuatro grados centígrados, y agregue 10 mililitros de medio fresco y tibio al plato.

Después de 60 horas, agrupe el segundo lote de sobrenadante con el lentivirus recolectado a las 48 horas y centrifugue el virus para eliminar cualquier residuo celular. A continuación, añada cero coma cinco mililitros de lentivirus a un cultivo confluente del 30 al 40 por ciento de células C2C12 CUG200 asentadas en una placa de 60 milímetros, como se acaba de demostrar. 72 horas después de la transfección, sustituya el sobrenadante de lentivirus por un medio fresco, suplementado con el antibiótico de selección adecuado.

Refrescar el medio de cultivo todos los días durante cinco días con un medio complementado con antibióticos de selección fresca, hasta que todas las células de control C2C12 CUG200 no transducidas estén muertas. Después de la selección de la resistencia a los fármacos, la expresión de GFP y la formación de miotubos de miobalistas diferenciados se pueden evaluar mediante un análisis manofluorescente. La cuantificación de la formación de miotubos en este experimento representativo demuestra que las áreas de fusión y miotubos disminuyen significativamente por la expansión anormal de CUG y las células transfectadas de GFP CUG 200.

La regulación positiva de Celf1 también se asocia con la expansión de CUG en la distrofia miogénica uno. Además, la Western blot demuestra consistentemente una elevación de los niveles de proteína Celf1 con CUG inhibida la expresión de MyoD, MyoG y Mef2C durante la diferenciación. Lo que sugiere que la expansión de CUG induce defectos en los miotubos y altera la diferenciación de los mioblastos.

El análisis de Western blot también revela que Celf1 marcado con FLAG está presente solo en cultivos transducidos con vectores retrovirales, y que su expresión está regulada al alza en estos cultivos. De hecho, la formación de miotubos es rara en las células que sobreexpresan Celf1 en comparación con los cultivos de control. Lo que sugiere que la sobreexpresión de Celf1 perjudica gravemente la diferenciación de mioblastos.

Además, el nivel de proteína endógena Celf1 y células GFP CUG 200 transducidas por vectores lentivirales seleccionados por antibióticos dobles se reduce notablemente en presencia de ARN de horquilla corta Celf1. Con el rescate de la formación de miotubos, se observaron indecies de fusión de miotubos y áreas de miotubos en estos cultivos. Mientras tanto, los resultados de RTPCR en tiempo real sugieren que la expresión de MyoD, MyoG y Mef2C aumenta significativamente en las células que expresan ARN de horquilla corta Celf1, lo que respalda la posibilidad de una deficiencia de diferenciación de miocitos rescatada por la eliminación de Celf1 en estos cultivos.

Al intentar este procedimiento, es importante monitorear la densidad de células C2C12 para que esté por debajo del 70 por ciento de confluencia. Después de la transfección celular, trate las células con medio libre de suero durante al menos cuatro horas, pero no más de 12 horas. Durante el seguimiento de la citotoxicidad de las células.

Mediante el uso de la transfección de plásmidos, la transducción retroviral y lentiviral, hemos establecido con éxito un modelo de células de distrofia miotónica que beneficiará la investigación en esta y otras enfermedades musculares.