Name: Modelado de la distrofia miotónica 1 en las células C2C12 mioblastos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprenda a modelar la distrofia miotónica 1 en mioblastos C2C12 mediante transfección y transducción viral. Este protocolo permite estudiar mecanismos patológicos y evaluar diferenciación miocitaria.

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Agradecemos a los Dres. Tom Cooper del Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan de la Universidad de Wisconsin-Madison y Didier Trono de la Universidad de Ginebra por los reactivos. Este trabajo cuenta con el apoyo de un fondo inicial (YL) de la Universidad de Houston, una subvención de la Asociación Americana del Corazón (YL, 11SDG5260033) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (XP, 81460047).

1. Cultivo de células C2C12 <ol><li> Mantener C2C12 mioblastos de ratón en una placa de 100 mm en medio de crecimiento (medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)) suplementado con suero bovino fetal 20%, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, y 2 mM L-glutamina. Permitir que las células a pases C2C12 se conviertan en aproximadamente 50 - 60% de confluencia. </li><li> Descartar el medio de cultivo y lavar las células C2C12 con solución salina tamponada con fosfato 3 ml temperatura ambiente (PBS). Retire el PBS y añadir 500 l 0,25% de tripsina-EDTA para desprender las células. Colocar la placa en un 37 ° C, 5% de CO2 durante 3 - 5 min. </li><li> Neutralizar la tripsina mediante la adición de 3 ml de medio de crecimiento. Pipetear 6 - 8 veces para suspender las células. Añadir 1 ml de células en suspensión a una nueva placa 100 mm y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> 2. C2C12 Cell transfección / transducción y selección <ol><li> C2C12 plásmido transfección <ol><li> 24 h antes de la transfección, pfinales de 7,0 x 10 5 C2C12 células en un pocillo de una placa de seis pocillos para cada transfección. Nota: Esto lleva a 50 - 60% de confluencia en el momento de la transfección. </li><li> Permitir que el reactivo de transfección a la temperatura ambiente antes de su uso. </li><li> Añadir 2 g de ADN plásmido (GFP-CUG5 o GFP-CUG200) en 200 l pre-calentado medio libre de suero y de vórtice brevemente. Añadir el reactivo de transfección 6 l al medio y mezclar inmediatamente durante 30 segundos usando un vórtice. Incubar la mezcla durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Cambiar el medio de células C2C12 a 2,5 ml de medio de crecimiento libre de suero. Añadir la mezcla de transfección a las células después de la incubación. Volver las placas a un 5% de CO 2, 37 ° C incubadora. </li><li> Mantener las células en la mezcla de transfección el medio de crecimiento / libre de suero durante 4 horas o hasta durante la noche. Cambio de medio de nuevo a los medios de cultivo al día siguiente o cuando la citotoxicidad es evidente. Nota: La citotoxicidad se evaluó mediante la inspección microscópica de la ceLLS. Observar los cambios en la morfología celular y la retirada de las células. Mientras no hay citotoxicidad manifiesta, incubación durante la noche en medio de crecimiento libre de suero aumenta la transfección. </li><li> Seleccionar las células 48 horas después de la transfección mediante la adición de 01.02 a 01.06 mg / ml de G418 durante unos 10 días hasta que el cultivo de control (sin transfectadas los plásmidos) no tiene células vivas. Cambiar el soporte de cada dos días con medio de cultivo suplementado con G418. </li><li> Mantener las células resistentes a G418 en medio de crecimiento y 5% de CO2 a 37 ° C para los experimentos posteriores. </li></ol></li><li> preparación de retrovirus y C2C12 transducción retroviral <ol><li> Preparar HEK 293 medio de cultivo por DMEM que complementa alta glucosa con 10% de suero fetal bovino, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, y 2 mM L-glutamina. <ol><li> Aproximadamente 24 horas antes de la transfección, la placa de 4,0 x 10 células HEK 293 de embalaje a base de 6 ecotropic en una placa de 100 mm (confluencia del 80% en la transfección) cmedio de cultivo celular ontaining. </li></ol></li><li> Permitir que el reactivo de transfección a la temperatura ambiente antes de su uso. </li><li> Mezclar 15 g de ADN plásmido (pMSCV-Puro o pMSCV-Celf1Flag-Puro) en 1 ml de medio de crecimiento libre de suero. brevemente Vortex. Añadir 30 l reactivo de transfección de la etapa 2.2.2 en el tubo de medio de crecimiento de ADN / libre de suero, y se mezcla bien con vórtice. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Añadir transfección mezcla gota a gota a las células de empaquetamiento ecotrópico HEK 293 basados ​​en. Hacer girar suavemente las placas y devolverlos de nuevo al 5% de CO2, a 37ºC. Después de 24 horas, cambiar el soporte de medio de cultivo fresco 10 ml previamente calentada. </li><li> Se recoge el sobrenadante (que contiene retrovirus) 48 h después de la transfección usando una pipeta y transferir el sobrenadante a un tubo de centrífuga de 50 ml. Añadir 10 ml de nuevos medios cálidos a la placa y devolverlo a la incubadora. Mantenga el sobrenadante a 4 ° C. Nota: Los medios de comunicación se añade suavemente a tél lado del pozo a fin de no perturbar la monocapa de células. </li><li> Se recoge el segundo lote de sobrenadante 60 horas después de la transfección y mezclarla con el sobrenadante de 2.2.5. Centrifugar a 500 xg, 4 ° C durante 7 min para eliminar restos celulares. </li><li> Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml. Utilice retrovirus para transducir células C2C12 en este punto por continuar con el paso 2.2.9 o alícuota y almacenar el sobrenadante a -20 ° C para uso futuro. </li><li> Descongelar el retrovirus de 2.2.7 a temperatura ambiente, si se usa una solución madre congelada aquí. Nota: Evite múltiples ciclos de congelación-descongelación. </li><li> Placa células C2C12 en el mismo día de la transducción con el objetivo de 30 - 40% de confluencia. <ol><li> Descartar el medio de cultivo y lavar las células C2C12 con 3 ml de PBS temperatura ambiente. Retire la PBS, añadir 500 l 0,25% de tripsina-EDTA, e incubar la placa en un 37 ° C, 5% de CO2 durante 3 - 5 min. </li><li> Neutralizar la tripsina mediante la adición de 3 ml med crecimientoio. Pipetear 6 - 8 veces para suspender las células. Recuento de células utilizando un hemocitómetro y añadir 8,0 x 10 5 células C2C12 a una placa de 60 mm. </li></ol></li><li> Añadir 0,5 ml de retrovirus para infectar una placa de 60 mm de células en 3 ml de medio de crecimiento. Devolver la placa a la incubadora. </li><li> Reemplazar con 3 ml de medio fresco suplementado con antibiótico de selección (puromicina 1-3 g / ml) 48 h después de la infección. Reemplazar 3 ml de medio con antibióticos para todos los días a 5 días hasta que el cultivo de control C2C12 transducido se extingue. </li></ol></li><li> preparación lentivirus y C2C12 transducción lentiviral Nota: Realizar todos los procedimientos relacionados con lentivirus de Bioseguridad Nivel 2 del gabinete y seguir las directrices de seguridad biológica. Los residuos líquidos que contiene el virus debe ser desinfectada antes de su eliminación. <ol><li> Placa 4.0 x 10 6 células 293T en una placa de 100 mm (~ 80% de confluencia en el día de la transfección) con HEK 293 medio de cultivo celular (DMEM alto contenido en glucosa, suplementado con 10% fetalde suero bovino, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, y 2 mM L-glutamina) 24 h antes de la transfección. </li><li> Calentar el reactivo de transfección a temperatura ambiente. Mezclar los vectores de empaquetamiento lentiviral (4 g pMD2.G y 6 g psPAX2) junto con vector de transferencia lentiviral 8 g (Celf1 shRNA o revueltos de control shRNA) en 1 ml de medio de cultivo celular libre de suero. brevemente Vortex. </li><li> Añadir 36 l de reactivo de transfección pre-calentado en el tubo de ADN / DMEM y se mezcla bien por vórtice. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Retire las células 293T de la incubadora y añadir la mezcla de transfección a la placa. Hacer girar suavemente la placa y volver de nuevo a 5% de CO2, a 37ºC. Después de 24 hr, reemplace la mezcla de transfección con 10 ml de medio de cultivo fresco. </li><li> Recoger el sobrenadante que contiene lentivirus 48 hr después de la transfección y la transfiere en un tubo de centrífuga de 50 ml. Añadir 10 ml nuevos medios cálidos a la placa y volverlaa la incubadora. Almacenar el sobrenadante a 4 ° C. </li><li> Recoger el sobrenadante segundo lote de 60 horas después de la transfección y combinarlo con el sobrenadante de 2.3.5. brevemente centrifugar a 500 xg, 4 ° C durante 7 minutos. </li><li> Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml. Si se utiliza el virus fresca, continúe en el paso 2.3.9. Para uso futuro, tienda de virus que contienen sobrenadante a -20 ° C en alícuotas de 10 ml. </li><li> Descongelar el virus de 2.3.7 a temperatura ambiente antes de su uso, si se usa una solución madre congelada. Nota: Evite múltiples ciclos de congelación-descongelación. </li><li> células de la placa C2C12-CUG200 (obtenido en la Sección 2.1) como se describe en 2.2.9 en el mismo día de la transducción. Nota: Trate de 30 - 40% de confluencia. </li><li> Añadir 0,5 ml de virus para infectar una placa de 60 mm de C2C12-CUG200 y devolver la placa a la incubadora. </li><li> Sustituir el medio de cultivo con medio fresco suplementado con el antibiótico de selección (puromicina 1-3 g / ml) 72 horas después de la transducción.Refrescar los medios de cultivo todos los días con el antibiótico de selección para ~ 5 días hasta que todo el cultivo de control C2C12-CUG200 transducido se extingue. </li><li> Utilice Western blot para verificar caída Celf1 en las células transfectadas GFP-CUG200. </li></ol></li></ol> 3. Diferenciación celular C2C12 <ol><li> Plate 2 x 10 6 células en un pocillo de una placa de 6 pocillos en 2,5 ml de medio de crecimiento 24 horas antes de la iniciación de la diferenciación. Nota: La densidad de placas se puede ajustar de modo que la confluencia completa se alcanza en 24 hr. <ol><li> Enjuagar las células confluentes con PBS y añadir 2,5 ml de medio de diferenciación bajo en suero (medio modificado de Eagle suplementado con suero equino al 2%, 100 U / ml de penicilina de Dulbecco, 100 mg / ml de estreptomicina, 2 mM L-glutamina, y 1 mM de insulina) . Reemplazar el medio cada dos días. Nota: guardar la acción de la insulina congelada y añadirlo a los medios de comunicación en cada cambio de medio. </li></ol></li><li> Durante la diferenciación de C2C12, recoger muestras para quancuanti- RT-PCR (ver sección 4) en los siguientes puntos de tiempo: Day0, 1, 2, 4 y 6. Proceso de la cultura para la inmunotinción en el día 6 - 8 (véase la sección 5). </li></ol> 4. Aislamiento de ARN y RT-PCR cuantitativa <ol><li> Utilice el protocolo del fabricante para el aislamiento de ARN. Después del aislamiento, resuspender el pellet de ARN en 30 l de agua libre de RNasa y pipetear arriba y abajo varias veces. Nota: Las muestras pueden proceder a RT-PCR cuantitativa o pueden ser almacenadas a -80 ° C. </li><li> Utilice un kit de RT PCR cuantitativa para la RT-PCR cuantitativa 10 y siga las instrucciones del fabricante. Preparar la mezcla de reacción de acuerdo con la Tabla 1. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volumen (l) </td><td> concentración final </td></tr><tr><td> tampón de reacción 2x </td><td> 10 </td><td> 1x </td&gt; </tr><tr><td> cebador directo </td><td> 0,5 </td><td> 200 nM </td></tr><tr><td> cebador inverso </td><td> 0,5 </td><td> 200 nM </td></tr><tr><td> Sonda </td><td> 0,5 </td><td> 200 nM </td></tr><tr><td> La transcriptasa reversa y RNasa Inhibidor </td><td> 0,1 </td><td> 0,25 U / ml </td></tr><tr><td> Modelo </td><td> 1 </td><td> 100 ng de ARN total </td></tr><tr><td> RNasa libre de agua </td><td> 7.4 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> mezcla total </td><td> 20 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Quantitative RT-PCR Master Mix Preparación <ol start="3"><li> Ejecutar un 20 l de reacción RT-qPCR utilizando perfil térmico Tabla 2. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> paso de transcripción inversa </td><td> 30 min, 48 ° C </td></tr><tr><td> polímero de ADNactivación ase / inactivación de la transcriptasa inversa </td><td> 10 min, 95 ° C </td></tr><tr><td rowspan="2"> 40 ciclos </td><td> 15 seg, 95 ° C </td></tr><tr><td> 1 min, 60 ° C </td></tr></tbody></table> Tabla perfil térmico 2. RT-PCR cuantitativa 5. La inmunotinción <ol><li> Fijar el cultivo en monocapa en 2,5 ml recién preparada de paraformaldehído al 4% / PBS a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Permeabilizar las muestras en 2,5 ml 0,1% de Triton X-100 / PBS durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Transferir las muestras a una cámara humidificada. Bloquear las muestras en 2,5 ml de tampón (tensioactivo no iónico 0,1% / PBS, 10% de suero normal de cabra) de bloqueo durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Desechar el tampón de bloqueo y aplicar 800 l de anticuerpo primario contra la miosina de cadena pesada diluido en tampón de bloqueo (1: 100). Incubar durante la noche en una cámara humidificada a temperatura ambiente. </li><li> Lavar la placa 3 timES (10 min cada una) con 2,5 ml de tampón de lavado (0,1% de polisorbato 20 / PBS) el día 2. </li><li> Eliminar el tampón de lavado y aplicar anticuerpo secundario 800 l (de cabra anti-IgG de ratón, 1: 500 diluido en PBS). Incubar en una cámara humidificada a temperatura ambiente durante 1 hr. </li><li> Lavado dos veces (10 min cada una) con tampón de lavado de 2,5 ml. </li><li> Incubar con 800 l DAPI (1 g / ml, diluido en agua destilada desionizada H 2 O) durante 5 min. </li><li> Se lava con 2,5 ml de tampón de lavado de nuevo durante 10 minutos. </li><li> Cambiar el tampón de lavado a 2,5 ml de PBS y el uso de un microscopio de fluorescencia para capturar imágenes. </li></ol>

<ol><li>Harper, P. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarper%2C+PS+%22Myotonic+dystrophy.+3rd+edn%22">Myotonic dystrophy. 3rd edn</a>. , W. B. Saunders. (2001).</li>
<li>Timchenko, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+muscle+atrophy+in+myotonic+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies.</a> Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).</li>
<li>Brook, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+myotonic+dystrophy%3A+expansion+of+a+trinucleotide+%28CTG%29+repeat+at+the+3%27+end+of+a+transcript+encoding+a+protein+kinase+family+member%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3' end of a transcript encoding a protein kinase family member.</a> Cell. 68 (4), 799-808 (1992).</li>
<li>Chau, A., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+insights+into+the+pathology+of+and+therapeutic+strategies+for+DM1%3A+Back+to+the+basics%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics.</a> Dev Dyn. 244 (3), 377-390 (2015).</li>
<li>Ho, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscleblind+proteins+regulate+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Muscleblind proteins regulate alternative splicing.</a> EMBO J. 23 (15), 3103-3112 (2004).</li>
<li>Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+steady-state+levels+of+CUGBP1+in+myotonic+dystrophy+1+are+due+to+PKC-mediated+hyperphosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Increased steady-state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC-mediated hyperphosphorylation.</a> Mol Cell. 28 (1), 68-78 (2007).</li>
<li>Kalsotra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mef2+transcription+network+is+disrupted+in+myotonic+dystrophy+heart+tissue%2C+dramatically+altering+miRNA+and+mRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The Mef2 transcription network is disrupted in myotonic dystrophy heart tissue, dramatically altering miRNA and mRNA expression.</a> Cell Rep. 6 (2), 336-345 (2014).</li>
<li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).</li>
<li>Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+activation+of+human+nuclear+genes+in+stable+heterocaryons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons.</a> Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).</li>
<li>Peng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celf1+regulates+cell+cycle+and+is+partially+responsible+for+defective+myoblast+differentiation+in+myotonic+dystrophy+RNA+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Celf1 regulates cell cycle and is partially responsible for defective myoblast differentiation in myotonic dystrophy RNA toxicity.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (7), 1490-1497 (2015).</li>
<li>Amack, J. D., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myotonic+dystrophy+expanded+CUG+repeat+tract+is+necessary+but+not+sufficient+to+disrupt+C2C12+myoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation.</a> Hum Mol Genet. 10 (18), 1879-1887 (2001).</li>
<li>Amack, J. D., Paguio, A. P., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cis+and+trans+effects+of+the+myotonic+dystrophy+%28DM%29+mutation+in+a+cell+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model.</a> Hum Mol Genet. 8 (11), 1975-1984 (1999).</li>
<li>Bhagavati, S., Shafiq, S. A., Xu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28CTG%29n+repeats+markedly+inhibit+differentiation+of+the+C2C12+myoblast+cell+line%3A+implications+for+congenital+myotonic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">(CTG)n repeats markedly inhibit differentiation of the C2C12 myoblast cell line: implications for congenital myotonic dystrophy.</a> Biochim Biophys Acta. 1453 (2), 221-229 (1999).</li>
<li>Amack, J. D., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+defects+in+myotonic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Myogenic defects in myotonic dystrophy.</a> Dev Biol. 265 (2), 294-301 (2004).</li>
<li>Emerson, C. P., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEmerson%2C+CP+%22Methods+in+muscle+biology%22">Methods in muscle biology</a>. 52, Academic Press. (1997).</li>
<li>Ward, A. J., Rimer, M., Killian, J. M., Dowling, J. J., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUGBP1+overexpression+in+mouse+skeletal+muscle+reproduces+features+of+myotonic+dystrophy+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">CUGBP1 overexpression in mouse skeletal muscle reproduces features of myotonic dystrophy type 1.</a> Hum Mol Genet. 19 (18), 3614-3622 (2010).</li>
<li>Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart-specific+overexpression+of+CUGBP1+reproduces+functional+and+molecular+abnormalities+of+myotonic+dystrophy+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1.</a> Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Línea celular C2C12 se ha utilizado como un modelo para estudiar la miogénesis 11-14. Estas células conservan un aspecto similar a fibroblastos, proliferan rápidamente en medios que contienen suero bovino fetal 20% y fácilmente diferencian en medios que contienen 2% de suero equino 15. El rápido crecimiento y la diferenciación son características ventajosas en un modelo celular miogénesis. Aquí, se demuestra el uso de plásmido, retroviral, y vectores lentivirales para introducir ADNc, 3&#39;-UTR, y...

La distrofia miotónica (DM) es una enfermedad autosómica dominante que afecta a múltiples sistemas, más notablemente los músculos cardíaco y esquelético 1. Hay dos subtipos de esta enfermedad, DM1 y DM2. DM1 es más común y tiene una manifestación más grave que DM2 2. La mutación genética subyacente DM1 es una expansión de repeticiones de tripletes CUG ubicadas en la región no traducida 3 &#39;(UTR) del gen de la proteína quinasa DM (DMPK) 3. El número de repetición CUG en individuos no afectados varía de 5 a 37. Por el contrario, aumenta a más de 50, y a veces hasta miles de personas en los pacientes con DM1 4. Como resultado, las proteínas de unión a ARN, como muscleblind tipo 1 (MBNL1), CUGBP, y Elav-1 como de la familia (Celf1), son misregulated. Debido a la secuestro en las repeticiones CUG expandido, MBNL1 pierde su capacidad para regular splicing alternativo 5. Celf1, por el contrario, está regulado hasta 6,7. La sobreexpresión de Celf1 se asocia con la pérdida de músculoy debilidad, que no se atribuye a la pérdida de la función MBNL1. Los modelos animales que simulan alteraciones relacionadas-DM1, incluyendo DMPK 3&#39;-UTR de expansión CUG, pérdida de MBNL1, y la sobreexpresión de Celf1, se han establecido. Sin embargo, el modelado de la DM1 en mioblastos ofrece una alternativa eficiente, especialmente para la disección de eventos celulares y moleculares relacionados con DM1. C2C12 línea celular de mioblastos fue aislado por primera vez a partir de músculo de ratón C3H heridos y ampliamente utilizado para estudiar la diferenciación miogénica 8,9. células C2C12 proliferan rápidamente en el suero bovino fetal (FBS) que contienen los medios de comunicación y fácilmente experimentan diferenciación cuando se agote el FBS. Sin embargo, el uso de este modelo de diferenciación de mioblastos presenta dos retos: las células C2C12 son a menudo resistente a la transfección de genes / transducción viral; y ligeras variaciones en el manejo celular y la diferenciación procedimiento pueden conducir a cambios marcados en la formación de miotubos. Nuestro laboratorio utiliza rutinariamente mioblastos C2C12 como acell modelo y ha desarrollado protocolos que transmitan efectivamente los genes de plásmido transfección, transducción retroviral, y la transducción lentiviral en la línea celular C2C12 10. En el video, que demuestran los procedimientos optimizados para la transfección / transducción de células C2C12 y el mantenimiento de la coherencia de diferenciación en el establecimiento de modelos de mioblastos DM1.

<table><tbody><tr><td>DMEM, alta glucosa</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td>para medio de cultivo</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino - Premium</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>para medio de cultivo</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina-Glutamina (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td>para medio</td></tr><tr><td>de cultivo Insulina de páncreas bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634-100MG</td><td>para medio de diferenciación</td></tr><tr><td>suero equino</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12150</td><td>para medio de diferenciación</td></tr><tr><td>FuGENE&nbsp; Reactivo de transfección HD</td><td>Promega</td><td>E2311&nbsp;</td><td>para transfección</td></tr><tr><td>Sulfato G418 &nbsp;</td><td>Biotecnología del Oro&nbsp;</td><td>G-418-10</td><td>para la selección</td></tr> de resistencia a los medicamentos <tr><td>Dihidrocloruro de puromicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>sc-108071</td><td>para la selección de resistencia a los medicamentos</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% Gel de proteína Bis-Tris, 1,0 mm, 15 pocillos</td><td>Life Technologies</td><td>NP0323BOX</td><td>para Western blot</td></tr><tr><td>Tampón de transferencia NuPAGE (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP00061</td><td>para Western blot</td></tr><tr><td>Búfer de ejecución NuPAGE MES SDS (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0002</td><td>para Western blot</td></tr><tr><td>Amersham Protran soportado 0,2 NC, 300 mm x 4 m</td><td>GE healthcare life science</td><td>10600015</td><td>para western blot</td></tr><tr><td>MF 20</td><td>Banco de hibridomas</td><td>del desarrollo MF 20</td> Ab <td>primario MF 20 para inmunotinción</td></tr><tr><td>anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-ratón de cabra, conjugado Texas Red-X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T-862</td><td>secundario Ab para inmunotinción</td></tr><tr><td>Un paso qRT-PCR MasterMix</td><td>AnaSpec</td><td>05-QPRT-032X</td><td>para qRT-PCR</td></tr><tr><td>Reactivo de aislamiento TriPure</td><td>Roche</td><td>11667165001</td><td>para el aislamiento de ARN</td></tr><tr><td>CUG-BP1 Anticuerpo (3B1)</td><td>santa cruz</td><td>sc-20003</td><td>primario Ab western blot</td></tr><tr><td>Anticuerpo de actina</td><td>santa cruz</td><td>sc-1615</td><td>de cabra IgG policlonal para el control de carga</td></tr><tr><td>293T Ecopack</td> Células <td>de 631507</td> <td>Clontech</td><td>para la preparación de retrovirus</td></tr><tr><td>pMSCV-puro</td><td>Clontech</td><td>634401</td><td>vector retroviral vacío para la preparación de retrovirus</td></tr><tr><td>pMSCV-Celf1Flag-puro</td> construido en <td>casa</td><td>no disponible</td><td>vector retroviral que codifica Celf1Flag, utilizado en la preparación de retrovirus</td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>regalo de Didier Trono</td><td>no disponible</td><td>para la preparación de lentivirus</td></tr><tr><td>Regalo pMD2.G</td><td>de Didier Trono</td><td>no disponible</td><td>para la preparación de lentivirus</td></tr><tr><td>Regalo GFP-CUG5</td><td>de M.S. Mahadevan</td><td>no disponible</td><td>detalles en la referencia 10&nbsp;</td></tr><tr><td>GFP- CUG200</td><td>regalo de M.S. Mahadevan</td><td>no disponible</td><td>detalles en la referencia 10&nbsp;</td></tr><tr><td>Tritón &nbsp; X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>para inmunotinción</td></tr><tr><td>con paraformaldehído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>para inmunotinción</td></tr><tr><td>TWEEN&nbsp; 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td>para inmunotinción</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>para inmunotinción</td></tr></tbody></table>

modelado de la distrofia miotónica 1 en las células c2c12 mioblastos

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

La distrofia miotónica 1 (DM1) es una forma común de distrofia muscular. Aunque se han establecido varios modelos animales para DM1, modelos celulares de mioblastos son todavía importantes debido a que ofrecen una alternativa eficiente celular para el estudio de eventos celulares y moleculares. Aunque las células de mioblastos C2C12 se han utilizado ampliamente para estudiar la miogénesis, resistencia a la transfección de genes, o transducción viral, obstaculiza la investigación en las células C2C12. A continuación, describimos un protocolo optimizado que incluye procedimientos de mantenimiento diario, transfección y transducción para introducir genes en mioblastos C2C12 y la inducción de la diferenciación de los miocitos. Colectivamente, estos procedimientos permiten mejores eficacias de transfección / transducción, así como los resultados de diferenciación consistentes. El protocolo descrito en el establecimiento de modelos celulares de mioblastos DM1 beneficiaría al estudio de la distrofia miotónica, así como otras enfermedades musculares.

C2C12 células fueron transfectadas con GFP-CUG5 o GFP-CUG200. Después de la selección de resistencia a fármacos, se establecieron piscinas estables, que puede ser visualizado por la expresión de GFP (Figura 1A). Formación de miotubos en los mioblastos diferenciadas fue detectado por la cadena pesada de la miosina inmunotinción 10 (Figura 1B). La cuantificación de la formación de miotubos demostró que los índices de fusión se redujeron de 35,4 ...

En este protocolo, se presentan los procedimientos para establecer modelos de distrofia miotónica de mioblastos 1, incluyendo el mantenimiento optimizado C2C12 celular, transfección de genes / transducción, y la diferenciación de los miocitos.

Modelado de la distrofia miotónica 1 en las células C2C12 mioblastos

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

El objetivo general de estos procedimientos de mantenimiento, transfección y transducción de mioblastos es establecer un modelo celular de distrofia miotónica tipo uno para el estudio de la distrofia miotónica y otras enfermedades musculares. Este método puede ayudar a establecer modelos celulares de mioblastos M1 que serán útiles para investigar el mecanismo detallado de la patogénesis de M1. Esta manipulación genética escalonada de mioblastos C2C12 permite modelar eventos patológicos genéticos y secuenciales en la M1. Veinticuatro horas antes de su transfección, sembrar siete veces 10 a la quinta células C2C12 por pocillo en una placa de seis pocillos.Al día siguiente, añada dos microgramos del ADN plasmídico de interés a 200 microlitros de medio libre de suero a temperatura ambiente y vortexee brevemente la solución. A continuación, añada seis microlitros del reactivo de transfección a temperatura ambiente al medio, y vortexee inmediatamente la solución durante 30 segundos. Luego, incube el medio a temperatura ambiente durante 30 minutos.Durante los últimos cinco minutos de la incubación, reemplace el medio en cada pocillo con dos punto cinco mililitros de medio de crecimiento f

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Las células cultivadas del músculo son un modelo inadecuado para recapitular músculo...

Una unidad motora funcional en la placa de cultivo: Co-cultivo de explantes de la médula espinal y las células musculares

Un medio no invasivo para evaluar el éxito de trasplante de mioblastos se describe. El método se aprovecha de un gen de fusión informador unificada compuesta de genes cuya expresión se pueden obtener imágenes con diferentes modalidades de imágenes. Aquí, se hace uso de...

Imagen Molecular a Target trasplantó células progenitoras musculares

Este protocolo describe técnicas para el aislamiento de células vivas y el cultivo primario de líneas celulares miogénicas y fibroblastas a partir de tejido muscular o cutáneo.  También se describe una técnica para la inmortalización de estas líneas celulares.  En conjunto, estos protocolos proporcionan una herramienta fiable para generar y preservar células derivadas de pacientes para aplicaciones posteriores.

El aislamiento y la inmortalización de líneas celulares derivados de los pacientes a partir de una biopsia muscular para Modelado de Enfermedades

Este protocolo utiliza la electroporación para introducir y expresar proteínas marcadas con fluorescencia en fibras musculares de ratón. Después de la recuperación después de la electroporación, las fibras se aíslan. A continuación, se obtienen imágenes de las fibras individuales mediante microscopía confocal de alta resolución para visualizar la estructura muscular.

ADN electroporación, aislamiento e Imagen de miofibras

Las células musculares se encuentran entre las células eucariotas más complejas. Presentamos un protocolo para la diferenciación in vitro de miofibras altamente maduras que permite la manipulación genética y la obtención de imágenes claras durante todas las etapas de desarrollo.

Diferenciación in vitro de las fibras maduras de imágenes en vivo

El objetivo de esta técnica es preparar una cultura altamente enriquecida de primarias motoneuronas (MNs) de murine de la médula espinal. Para evaluar las consecuencias de las mutaciones que causan enfermedades de MN, Describimos aquí el aislamiento de estos aislados MNs y su transfección por magnetofection.

Modelado enfermedad del Charcot-Marie-diente In Vitro por transferencia primaria Motoneurons de ratón

Proporcionamos un protocolo para derribar genes que codifican las proteínas de matriz extracelular (ECM) en los mioblastos C2C12 utilizando ARN de horquilla pequeña (sh). Apuntando a ADAMTSL2 como ejemplo, describimos los métodos para la validación de la eficiencia de derribo en el ARNm, la proteína y el nivel celular durante la diferenciación de mioblasto c2C12 a miotubo.

Derribo estable de genes que codifican proteínas de matriz extracelular en la línea celular de mioblaste C2C12 utilizando small-Hairpin (sh)RNA

En este artículo, describimos un protocolo detallado para el modelado eficiente del músculo de la distrofia muscular de Duchenne usando células derivadas de orina convertidas MYOD1para evaluar la restauración de los niveles de ARNm de distrofina y proteína según el exon.

Exon Skiping en Miotubos Directamente Reprogramados obtenidos de Células Derivadas de orina humana

Aquí, proponemos un método para obtener eficientemente fibras musculares individuales en etapas de desarrollo postnatal tempranas a partir del modelo de ratón lamin 8-11 mutante homocigoto, un modelo muy severo para la distrofia muscular de Emery-Dreifuss (EDMD).

Aislamiento de miofiber único y cultura de un modelo murino de distrofia muscular de Emery-Dreifuss en el desarrollo post-Natal temprano

Este protocolo describe la conversión de fibroblastos de piel en mioblastos y su diferenciación en miotubes. Las líneas celulares se derivan de pacientes con trastornos neuromusculares y se pueden utilizar para investigar mecanismos patológicos y para probar estrategias terapéuticas.

Reprogramación directa de fibroblastos humanos en mioblastos para investigar terapias para trastornos neuromusculares

Describimos un sistema de imágenes reproducible, automatizado e imparcial para caracterizar la función de la unión neuromuscular utilizando tejido muscular esquelético diseñado por humanos y motoneuronas optogenéticas. Este sistema permite la cuantificación funcional de la conectividad neuromuscular a lo largo del tiempo y detecta la disminución de la función neuromuscular causada por las neurotoxinas y la miastenia gravis en el suero del paciente.

Ingeniería y caracterización de un modelo optogenético de la unión neuromuscular humana

Aprenda a modelar la distrofia miotónica 1 en mioblastos C2C12 mediante transfección y transducción viral. Este protocolo permite estudiar mecanismos patológicos y evaluar diferenciación miocitaria.

Modelado de la distrofia miotónica 1 en las células C2C12 mioblastos

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