La eliminación de materiales exógenos de la parte exterior de congelados Núcleos para Investigar la antigua comunidades biológicas albergaba el interior
3 de julio de 2016
La criosfera ofrece acceso a los organismos conservados que persistieron en las condiciones ambientales del pasado. Un protocolo se presentará a recoger y descontaminar los núcleos de permafrost de suelos y hielo. La ausencia de colonias exógenos y el ADN sugiere que los microorganismos detectados representan el material, en lugar de la contaminación de la perforación o de procesamiento.
La criósfera ofrece acceso a organismos preservados que persistieron bajo condiciones ambientales pasadas. El objetivo general de este procedimiento es descubrir la diversidad oculta mediante la recolección exitosa y la eliminación de material exógeno de núcleos congelados. Este método puede ayudar a responder preguntas históricas valiosas sobre períodos de tiempo específicos mediante la identificación de organismos recuperados de hielo glacial y permafrost.
Recoger un núcleo aséptico en el campo es un desafío debido a la alta probabilidad de introducción de contaminantes. Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica es que la eliminación de contaminantes ocurre en un entorno de laboratorio controlado. La demostración visual de este protocolo es fundamental, ya que los pasos de raspado y descontaminación pueden ser algo difíciles de aprender.
Realmente es un trabajo para dos personas, por lo que requiere mucha paciencia y, sobre todo, trabajo en equipo. Esta técnica será demostrada por dos científicos técnicos de mi laboratorio, Karen Foley y Robert Jones. Este protocolo requiere una limpieza meticulosa.
Utilice un horno ajustado a 450 grados Celsius para hornear lo siguiente durante cuatro horas: estantes metálicos estériles libres de ácidos nucleicos, material de vidrio, pinzas metálicas y lana de vidrio. Utilice un envoltorio de aluminio pesado para prevenir la recontaminación.
A continuación, filtre y esterilice el etanol al 85% y el agua ultra pura utilizando filtros de 0,22 micrones. Estos líquidos deben mantenerse a cuatro grados centígrados o menos, ya que de lo contrario podrían agrietar la muestra, facilitando la contaminación. Almacene el etanol a menos 20 grados centígrados.
Y almacene el agua a cuatro grados Celsius. Luego, esterilice una regla de plástico con etanol al 70%, seguido de la solución de descontaminación de ADN y la solución de descontaminación de ARNasa. Limpie inmediatamente cada solución tan pronto como se haya aplicado.
Luego, guarde la regla en una bolsa Whirl-Pak estéril y libre de ácidos nucleicos. A continuación, prepare el espacio de la cámara fría frotando las paredes, los pisos y una mesa de trabajo metálica con lejía al 1%. Luego, ajuste la temperatura de la habitación a aproximadamente menos 11 grados Celsius.
Una vez preparado, use trajes de protección ligera, guantes de nitrilo y mascarillas al estar en la cámara frigorífica para reducir cualquier posibilidad de contaminación del cuarto o de las muestras. Este procedimiento requiere que dos personas trabajen en conjunto. Esto puede ser difícil considerando las numerosas oportunidades de recontaminación.
Para garantizar el éxito, nos supervisamos mutuamente, comunicamos y cambiamos los guantes con frecuencia. Con todo preparado, lleve los materiales esterilizados y las muestras a la sala fría, y colóquelos sobre la mesa limpiada con lejía. Esto incluye cultivos preparados de S. marcescens.
Primero, el testigo de permafrost se coloca sobre una lámina de aluminio preparada. A continuación, se inocula ligeramente el exterior del testigo con un cultivo diluido de S. marcescens utilizando una espuma estéril. Luego, coloque el testigo sobre una rejilla metálica estéril colocada encima de una bandeja.
Ahora, la hoja de acero del microtomo se limpia de forma estéril con etanol al 70 %, solución de descontaminación de ADN y solución de descontaminación de ARN. A continuación, el investigador A limpia sus guantes de nitrilo de la misma manera. Luego, A sostiene el núcleo a un ángulo de 45 grados sobre la bandeja.
B raspa suavemente unos cinco milímetros de la superficie exterior de todo el núcleo, incluyendo los extremos, utilizando la hoja estéril, mientras A gira el núcleo tras cada raspadura. Según sea necesario, la hoja debe limpiarse nuevamente con las tres soluciones. A continuación, B vierte rápidamente y con cuidado etanol al 95 % filtrado y esterilizado sobre el núcleo mientras A lo gira.
Luego, el núcleo se enjuaga rápidamente con agua. Ahora se vuelve a colocar la rejilla metálica sobre la bandeja, y el núcleo se coloca sobre la nueva rejilla. A ahora limpia sus guantes de nitrilo y luego coloca el núcleo sobre una rejilla limpia por encima de la bandeja.
Mientras tanto, B rocía todo el testigo con una solución descontaminante de ADN, seguido de un enjuague con agua esterilizada por filtración. A continuación, B rocía todo el testigo con una solución descontaminante de ARNasa, seguido de otro enjuague con el agua. Por último, el testigo se coloca en una bolsa Whirl-Pak estéril.
Comience colocando una rejilla de metal sobre un recipiente de vidrio en una cabina de flujo laminar. Luego, coloque el núcleo sobre la rejilla de metal. Permita que de dos a cinco milímetros de la superficie externa del núcleo se descongelen durante aproximadamente 10 minutos.
En este tiempo, gire el núcleo 90 grados cada dos minutos. Después del descongelamiento, sujete un poco de lana de vidrio con pinzas y pase sobre toda la superficie del núcleo para recoger las bacterias. A continuación, inocule las dos placas utilizando la lana de vidrio.
A continuación, mida las dimensiones externas del núcleo utilizando la regla, pero no toque el núcleo. Asimismo, inocule dos placas adicionales con el cultivo original que se utilizó previamente para impregnar el exterior del núcleo, a fin de verificar que el inóculo era viable. Luego, transfiera el núcleo a una bolsa estéril grande y almacénelo a menos 80 grados Celsius.
Incube las placas inoculadas a 23 grados Celsius durante una semana y luego examínelas en busca de colonias de S. marcescens, que se vuelven rojas a esta temperatura. Aunque este protocolo tiene una serie de pasos críticos, uno de los más importantes es verificar el crecimiento de Serratia marcescens. Si no hay colonias visibles de S. marcescens, continúe con la siguiente fase de descongelación.
SI hay colonias de S.marcescens, raspe otros cinco milímetros del núcleo y repita el procedimiento. Verifique si S.marcescens creció a partir del cultivo original expuesto a las bajas temperaturas de la cámara frigorífica. Las muestras se recolectaron de hielo y permafrost de un túnel de 110 metros ubicado en Fox, Alaska.
El túnel permitió el acceso a limo rico en hielo y aluvión. Las muestras se recolectaron por triplicado. En instalaciones en New Hampshire, se llevaron a cabo los protocolos descritos.
El gen 16S de ARNr se secuenció a partir de bacterias cultivadas a partir de los núcleos. Dominaron especies del género Pseudomonas, pero también estuvieron presentes miembros relacionados con Planctomycetia. Y, de particular interés fue la ausencia de especies del género Serratia, lo que indica que el protocolo de descontaminación eliminó adecuadamente el ADN exógeno.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo descontaminar con éxito núcleos de hielo y permafrost. Una vez dominados, los pasos de procesamiento en cámara fría pueden realizarse en 30 a 45 minutos si se realizan correctamente. Al intentar este procedimiento, es fundamental tener cuidado con todo y cada lugar que toca.
En caso de duda, simplemente cámbiese los guantes y vuelva a esterilizar. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la secuenciación de amplicones y la metagenómica de tiro al azar para responder preguntas adicionales, como cuál fue la composición de especies durante ese período de tiempo, o qué atributos funcionales predominaron bajo esas condiciones ambientales.
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Descripción general
Este protocolo describe un método para recolectar y descontaminar núcleos de permafrost con el fin de descubrir organismos preservados de condiciones ambientales pasadas. La técnica tiene como objetivo eliminar material exógeno manteniendo la integridad de las muestras.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Ciencias ambientales
- Criobiología
Antecedentes
- La criósfera contiene organismos preservados que proporcionan información sobre ecosistemas históricos.
- La recolección de muestras de ambientes congelados presenta riesgos de contaminación.
- Comprender la diversidad microbiana pasada puede orientar estudios ecológicos actuales.
- Las técnicas de laboratorio controladas son esenciales para un análisis preciso.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para la recolección de núcleos de permafrost.
- Eliminar contaminantes de manera eficaz en un entorno de laboratorio.
- Identificar y analizar microorganismos provenientes de hielo glacial y permafrost.
Métodos Utilizados
- Recolección de núcleos asépticos de permafrost y hielo glacial.
- Procedimientos de descontaminación realizados en un ambiente controlado.
- Demuestras visuales para facilitar el aprendizaje de las técnicas de raspado y descontaminación.
- Análisis de ADN microbiano para confirmar la ausencia de contaminación.
Resultados principales
- Recolección exitosa de núcleos de permafrost sin introducir colonias exógenas.
- Los microorganismos detectados probablemente son indígenas a las muestras.
- Eficacia demostrada del protocolo de descontaminación.
- Proporcionó información sobre la diversidad microbiana histórica.
Conclusiones
- El protocolo permite el estudio de organismos conservados de manera libre de contaminación.
- Mejora la comprensión de las condiciones ambientales pasadas.
- La investigación futura puede basarse en estos hallazgos para explorar la evolución microbiana.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La descontaminación de núcleos congelados es fundamental para un análisis preciso de comunidades biológicas antiguas, asegurando que los microorganismos detectados reflejen poblaciones indígenas y no contaminación exógena. Este protocolo permite la validación de objetivos en microbiología ambiental al posibilitar la extracción fiable de señales endógenas a partir de muestras criopreservadas. El método mejora la confianza predictiva en aplicaciones posteriores, como la secuenciación de amplicones y la metagenómica, al establecer una base libre de contaminación para la desactivación mecanicista de reconstrucciones de ecosistemas históricos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de hipótesis terapéuticas mediante el aislamiento de señales microbianas indígenas procedentes de permafrost y testigos de hielo antiguos.
- Valor operativo: Reduce el riesgo de falsos positivos en la identificación de objetivos mediante la eliminación rigurosa de ADN exógeno y colonias microbianas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para ensayos posteriores mediante la confirmación de la ausencia de crecimiento de contaminantes mediante siembra de Serratia marcescens.
- Valor operativo: Estandariza la preparación de muestras mediante puntos de control de descontaminación cuantificables, mejorando la reproducibilidad entre lotes.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Apoya la modelización de sistemas relevantes para enfermedades al proporcionar acceso a consorcios microbianos ancestrales para el análisis de atributos funcionales.
- Valor operativo: Garantiza la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta el trabajo preclínico mediante el mantenimiento de la integridad de las muestras a través de una descontaminación controlada.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al permitir pruebas de hipótesis confiables sobre la diversidad microbiana antigua, apoyando directamente la identificación de candidatos mediante enfoques de secuenciación independientes de cultivo.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la aclaración de rutas metabólicas y la reducción del riesgo biológico al confirmar el origen endógeno de los microorganismos detectados mediante la ausencia de colonias de Serratia dopadas.
- Tamizaje: Permite la preparación del ensayo mediante pasos estandarizados de descontaminación que producen núcleos libres de contaminación, adecuados para la extracción de ADN.
- Análisis: Genera mediciones cuantitativas de variables dependientes, como el recuento de unidades formadoras de colonias y los resultados de secuenciación de ARNr 16S, para comparar condiciones entre muestras.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al proporcionar sistemas relevantes para enfermedades que permiten estudiar la adaptación microbiana bajo condiciones ambientales históricas.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad reutilizable para el procesamiento de núcleos que puede aplicarse en múltiples proyectos de núcleos de permafrost y hielo.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos mediante la confirmación de la ausencia de material exógeno.
- Valor operativo: Normalización y reproducibilidad mediante puntos de control definidos para descontaminación y protocolos de sala fría.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de continuar o descartar inversiones en secuenciación posterior al reducir el ruido biológico.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo de proyectos con muestras antiguas basada en la eficacia comprobada de la descontaminación.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas asépticas y biología molecular para prevenir la recontaminación durante el manejo.
- Depende de instrumentación que incluye cuartos fríos mantenidos a -11°C, equipos libres de ácidos nucleicos y cabinas de flujo laminar.
- Necesita la estandarización entre equipos de los pasos de descontaminación, incluyendo enjuagues con etanol, tratamientos con DNAasa/RNAasa y protocolos de cambio de guantes.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes tipos de testigos (hielo frente a permafrost), manteniendo una eliminación consistente de la capa externa.
- Limitación práctica: la eficacia depende de la ejecución rigurosa de los pasos de raspado y descontaminación química para evitar señales exógenas residuales.
