Name: Stencil Micropatterning de las células madre pluripotentes para el sondeo Organización Espacial de la diferenciación Parcas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Aprende el método de micropatrón con stencil para células madre pluripotentes humanas. Genera gradientes espaciales que controlan patrones de diferenciación sin modificaciones superficiales adicionales.

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Este trabajo es apoyado por NUS Puesta en marcha de subvención (R-397-000-192-133) y el Fondo Gap ETPL (R-397-000-198-592). GS es un erudito NUS Investigación. Los autores desean agradecer a la Dra Jiangwa Xing por su apoyo técnico en micropatterning celular.

NOTA: Este protocolo describe la fabricación de PDMS plantilla con 1.000 micras patrones de corte por láser y micropatterning de la línea de células madre, H9 usando la plantilla de PDMS. 1. Diseño y fabricación de PDMS de la plantilla para Micropatterning <ol><li> El diseño de la hoja de colocación de letreros de agujeros pasantes de la geometría y el tamaño deseados (por ejemplo, 1.000 micras círculos) y la junta de la plantilla utilizando el software de diseño asistido por ordenador 10. </li><li> Laser-cortar la hoja de colocación de letreros y la junta en 120-150 micras y 2 mm de espesor polidimetilsiloxano (PDMS) hojas, respectivamente, utilizando un láser de CO2-fresa 10. </li><li> Unir la junta de PDMS con la hoja de la plantilla PDMS utilizando PDMS sin curar líquidos y horno a 60 ° C durante 3-4 h para obtener la plantilla de PDMS micropatterning. </li><li> Esterilizar la plantilla PDMS en autoclave a 120 ° C durante 30 min y secado en un horno antes de su uso. </li></ol> 2. CMEh Principalmantenimiento <ol><li> Cultura de las líneas de células madre en un medio de mantenimiento sin alimentador de 1 × placas de cultivo celular recubierto de matriz de la membrana basal de células madre cualificado a 37 ° C y 5% de CO2. </li><li> Pasaje la hESCs cuando son aproximadamente el 70% de confluencia en un 3 minutos de incubación a 37 ° C con dispasa tratamiento y disociar mecánicamente las colonias de células madre en 100-200 micras grumos. Placa de los grupos hESCs a una densidad de 30-50 grupos por 9,6 cm 2 de área de crecimiento en la membrana basal de la matriz recubierta de poliestireno de cultivo de tejido en relación de 1: 6 de división. </li></ol> 3. Plantilla Micropatterning de células estaminales embrionarias humanas <ol><li> Preparación previa a la celda patrón <ol><li> Sellar una plantilla de PDMS en una placa de Petri de 60 mm mediante la supresión de 700 l 70% de etanol grado analítico en agua ultrapura en la placa de Petri y la colocación de la plantilla en la parte superior. </li><li> Coloque la placa de Petri en el interior de cabinas de seguridad durante la noche para permitir que tél etanol seco. </li><li> Verificar existe ninguna burbuja debajo de la plantilla para asegurar que la plantilla se forma un buen sello con la placa de Petri. Esto evita las fugas de solución de recubrimiento ECM. Sellar la placa de Petri y almacenar bajo condiciones estériles hasta que esté listo para la siembra de células. </li><li> Preparar alícuotas de matriz de membrana basal células madre cualificado de acuerdo con el certificado de análisis. Asegúrese de que cada uno de los rendimientos alícuota de 1 × solución matriz de la membrana basal células madre cualificado cuando se diluye en 25 ml de de Eagle modificado por Dulbecco: mezcla nutriente F-12 (DMEM / F12) de acuerdo con la hoja de producto del fabricante. </li><li> Preparar la solución de recubrimiento ECM mediante la adición de una alícuota de la matriz de la membrana basal células madre cualificado en 16,7 ml de DMEM / F12 para hacer 1,5 x solución matriz de la membrana basal células madre cualificado. Mantener toda la solución de revestimiento de ECM en hielo para evitar la gelificación. </li><li> Suplemento medio de mantenimiento de células madre con 10 mM inhibidor ROCA (Y27632). </li></ol></li><li><strong&gt; ECM recubrimiento sobre el sustrato estarcido <ol><li> El tratamiento de la placa de Petri con 100 WO 2 plasma durante 90 segundos. Para garantizar la esterilidad, sólo se abra la tapa de placa de Petri en el interior de la cámara de plasma antes del tratamiento de plasma, de forma rápida y cubrir de nuevo la placa de Petri después de la finalización del tratamiento. Esto facilita la humectación de la superficie y previene la formación de burbujas de aire en el micropatrón orificios pasantes durante la adición de solución de recubrimiento ECM. </li><li> Añadir 450 l de solución de matriz de membrana basal células madre cualificado 1,5 × para cubrir la totalidad de la plantilla. Sellar la placa de Petri con una película auto-sellable, tal como Parafilm, para evitar que la solución se seque, y se incuba durante 5 horas a 37 ° C antes de su uso. </li></ol></li><li> CMEh de siembra sobre el sustrato estarcido <ol><li> Examine las colonias de células madre en la placa de 6 pocillos para identificar las áreas de células diferenciadas que muestra la pérdida de la morfología típica de células madre (por ejemplo, pérdida de redondeada, bien packed morfología epitelial, relación / citoplasma alta núcleo con nucléolos prominentes). Eliminar regiones diferenciadas utilizando un aspirador de vacío. </li><li> Lavar dos veces con 2 ml de DMEM / F12 por pocillo. </li><li> Añadir 1 ml de las enzimas digestivas, tales como Accutase, por pocillo de placa de 6 pocillos y se incuba a 37 ° C durante 8 min. Golpear suavemente la placa para separar todas las colonias del sustrato. </li><li> Enjuague cada pocillo con al menos 4 ml de DMEM / F12 por 1 ml de las enzimas digestivas y recoger la suspensión de células en 15 ml de tubo cónico. </li><li> Centrifugar la suspensión celular a 200 g durante 3 min a temperatura ambiente. </li><li> Aspirar para eliminar el sobrenadante y añadir 400 l de medio de mantenimiento suplementado con células madre inhibidor ROCA (Rocki) para volver a suspender las células. Pipetear la suspensión de células arriba y abajo 3 veces con cuidado para romper grumos en células individuales. </li><li> Mezclar el bien suspensión de células individuales y se diluye 10 l de muestras de células en 190 l de DMEM / F12 (1:20 dilución). Use un hemocytometer para determinar la densidad celular en la suspensión celular stock. </li><li> Calcular la densidad de la siembra de células necesaria para una plantilla dada. NOTA: Por ejemplo, se ha determinado experimentalmente la densidad de la siembra de células para obtener una monocapa confluente de células individuales es de aproximadamente 4.444 células / mm 2. Por lo tanto, una plantilla con una superficie de 450 mm 2 y el volumen de siembra de 400 l se requiere una suspensión de células a ser a una densidad de 2 millones de células / 400 l. </li><li> Se diluye la suspensión de células de valores para la densidad de siembra requerido (véase el paso 3.3.8 NOTA) con medio de cultivo suplementado con células madre Rocki. </li><li> Añadir un volumen designado de suspensión de células que contiene el número requerido de células en cada plantilla y dejar la placa de Petri sin problemas en campana durante 5 min a temperatura ambiente para permitir que las células se asienten. </li><li> La transferencia de la placa de Petri en la incubadora y se incuba durante 1 hora para permitir para la fijación celular. Tenga cuidado de mantener el nivel de placa de Petri durante eltransferir proceso para que las células se mantienen como una monocapa en la plantilla. </li></ol></li><li> La eliminación de la plantilla y la pasivación del sustrato sin patrón <ol><li> Examinar la placa de Petri bajo un microscopio para verificar si las células están bien fijados en el sustrato subyacente. </li><li> Aspirar distancia suspensión de células de la plantilla. </li><li> Añadir 2 ml / placa de cultivo de células de 0,5% de tensioactivo no iónico compatible en DMEM / F12 a la zona que rodea a la plantilla. </li><li> Use un par de pinzas tratadas en autoclave para pelar suavemente de la plantilla. Agitar la solución de tensioactivo no iónico como alrededor de la plantilla se despega para evitar que las células se sequen. observar visualmente las células micropatterned en la placa de Petri. </li><li> Se incuban las células en solución micropatterned tensioactivo no iónico-DMEM / F12 0,5% durante 10 min a 37 ° C. </li><li> Aspirar la solución de distancia / F12 tensioactivo-DMEM no iónico. Lavar 3 veces con 2 ml / plato de DMEM / F12. </li><li> Añadir 2 ml / placa de células madremedio de mantenimiento suplementado con Rocki e incubar a 37 ° C durante la noche. </li><li> Después de la incubación durante la noche, aspirado hESC medio de mantenimiento suplementado con Rocki, lavar una vez con DMEM / F12 y inducir la diferenciación mesoendoderm añadiendo 2 ml / placa de medio de diferenciación suplementado con 100 ng / ml de activina, 25 ng / ml BMP4 y 10 ng / FGF2 ml . </li><li> Evaluar los micropatterns utilizando imágenes de contraste de fase y calcular los perfiles promedio Brachyury (T) de intensidad para cada patrón como se describe anteriormente 8. </li></ol></li></ol>

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Los autores no tienen intereses financieros en competencia.

La fabricación de plantillas Micropatterning micropatterning de la plantilla proporciona un método ideal para generar micropatterns HPSC para la investigación de nicho mediada por los patrones de diferenciación. La principal ventaja de los patrones de la plantilla sobre otras técnicas micropatterning, tales como impresión por microcontacto y photopatterning, es que no requiere modificación de la superficie y puede ser implementado sobre sustratos TCPS convencionales...

Las células madre pluripotentes humanas (hPSCs), incluyendo las células madre embrionarias (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs), son ampliamente explotados en la medicina regenerativa, así como el modelado experimental de la organogénesis normal y enfermo debido a su potencial de diferenciación en linajes celulares de todos tres capas germinales 1,2. El destino de diferenciación de hPSCs son muy sensibles a factores ambientales locales que pueden modular procesos mechanotransduction autocrinos o paracrinos de señalización 1, así como mediadas por señales físicas 3-5. Micropatterning célula abarca un conjunto de técnicas que se han desarrollado para organizar espacialmente la geometría y la localización de una población de células como un medio para controlar el microambiente celular local, tales como las interacciones célula-célula 6 y de las interacciones célula-matriz 3. En el contexto de hPSCs, micropatterning celular se ha empleado para obtener una mejor aproximación a la forma depende de nichola señalización autocrina ent modula células madre decisiones pluripotencia de diferenciación-7 y organización en los primeros patrones de diferenciación de embriones 6. 2D y 3D hPSCs micropatterned se han utilizado para controlar el tamaño de las colonias de los patrones multicelulares, que a su vez influyeron en las decisiones de diferenciación en las tres capas germinales 8,9. Hemos empleado micropatrones HPSC multicelulares para modular el grado de célula-célula y las interacciones célula-matriz en una colonia de HPSC para investigar cómo la diafonía integrina-E-cadherina puede dar lugar a la heterogeneidad del destino celular 10. Las manifestaciones de los informes anteriores nuevas vías abiertas hacia la aplicación de micropatterns multicelulares de hPSCs como modelos experimentales para la detección de toxicidad de los medicamentos para enfermedades del desarrollo 11, para estudiar el efecto de los factores de crecimiento y hormonas durante el tejido o el desarrollo de órganos, y para desentrañar la formación de los patrones de tejido. Una miríada de micropatter celulartécnicas Ning se han desarrollado como revisado por Falconnet et. al., 12 pero sólo un puñado, tales como micro-impresión de contacto 7,8,13, 14,15 cultura microplaca, photopatterning 6 y 16 microstencils se han aplicado con éxito con hPSCs. El reto con hPSCs micropatterning radica en su vulnerabilidad y un requisito estricto de matrices específicas extracelular (ECM) y condiciones de crecimiento para la fijación celular y la supervivencia. Para los patrones 2D HPSC, la impresión por microcontacto es uno de los métodos más comunes para generar micropatterns HPSC en cultivo de tejidos y de sustratos de vidrio 13. El método se puede utilizar para patrón ECM común utilizado en la cultura HPSC, incluyendo laminina y la membrana basal, tales como matrices de Matrigel. Sin embargo, se requiere típicamente un procedimiento de revestimiento de dos etapas con la ayuda de poli-D-lisina, y necesita condiciones atmosféricas inertes y humedad específicas para hacer micropatrones ECM estables para hPSCs para fijar en 6,13. La consideración más importante de cada método micropatterning es si el régimen de modificación de la superficie puede generar patrones de ECM HPSC-adhesivas en una resolución geométrica deseada al tiempo que minimiza la unión celular no específica a las zonas circundantes. Aquí, se presenta el uso de la plantilla micropatterning como un método simple para generar micropatterns HPSC sin etapas adicionales de modificación de la superficie antes de la generación de patrones de ECM adhesivas para hPSCs para unir sucesivamente. La plantilla de célula comprende una membrana delgada, hoja por ejemplo, polidimetilsiloxano (PDMS), con micras a milímetro tamaño orificios pasantes selladas sobre un sustrato de cultivo de células para contener físicamente recubrimientos ECM y hPSCs posteriormente sembradas. Como patrón de la plantilla funciona restringiendo físicamente el lugar donde HPSC puede acceder y conectar directamente al sustrato ECM subyacente recubierto, este método es compatible con varios sustratos que pueden apoyar las culturas HPSC. Los únicos requirement es que la elección del material de la plantilla puede formar un cierre reversible con el sustrato. Estos sustratos incluyen poliestireno convencional de cultivo de tejidos (TCPS) 17, los sustratos conjugados de ligando 18, así como sustratos elastoméricos con rigidez sintonizable (por ejemplo., PDMS) 19. Este método también permite recubrimiento de diferentes ECM, tales como vitronectina (o proteína VTN), laminina y matrices de membrana basal (por ejemplo, Matrigel y Geltrax) para permitir la unión y la diferenciación de hPSCs adecuada. configuraciones ECM-sustrato, por lo tanto, podemos transferir optimizados para una línea específica para HPSC stencil Micropatterning para una óptima adhesión célula-matriz, la supervivencia y la diferenciación. Recientemente, también se ha informado de un método similar para dirigir la diferenciación hepática por hESCs Micropatterning utilizando poli (metacrilato de metilo) (PMMA) matrices de micro-stencil 16. stencils celulares pueden ser fabricados de diferentes materiales, incluyendo reunieronALS 20,21, poli (p-xilileno) polímeros 22,23, PMMA 16 y más comúnmente, PDMS 24-28. El silicio y el poli (p-xilileno) polímeros plantillas requieren el grabado directo de los orificios pasantes con equipo especializado 20 a 23, lo que limita su accesibilidad para los usuarios biológicos. PDMS plantillas pueden ser fabricados por diferentes métodos dependiendo del tamaño característica requerida, que varía típicamente de 3 micras a 2000 micras 11,26-29. Si se desean características pequeñas, hojas de estarcir delgadas se pueden producir mediante moldeo por prensado PDMS pre-polímero en una plantilla de silicio microfabricado que contiene relieves de los micropatrones 28. Para las funciones de&gt; 1.000 micras, un cortador láser de CO 2 proporciona un método fácil y de bajo costo para reducir directamente los patrones en una hoja de PDMS pre-fundido durante la fabricación de la plantilla. El reciclado de las plantillas de PDMS también los hace rentable para llevar a cabo una serie de experimentos con suficiente consistencia. <p clculo = &quot;jove_content&quot;&gt; A continuación, se presenta la metodología detallada para la fabricación de una plantilla de PDMS con 1.000 micras características mediante corte por láser y la generación de células madre micropatterns. Estos micropatrones de células madre se utilizan para modular la amplitud de la integrina y E-cadherina mediadas adherencias dentro de una colonia hESC cohesiva con el fin de investigar cómo polarización espacial de la adhesión celular resultó en la celda destino heterogeneidad 10.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Hoja de PDMS de 2 mm de espesor</td><td>Specialty Silicone Products Inc., EE. UU.</td><td>SSPM823-.005</td><td>Se utiliza para formar un depósito para la plantilla</td></tr><tr><td>120-150 &mu; Hoja de PDMS de m de espesor</td><td>Specialty Silicone Products Inc., EE. UU.</td><td>SSPM823-.040</td><td>Se utiliza para formar plantillas&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de Petri de 60 mm</td><td>Nunc Nunclon Delta</td><td>150326</td><td>Sustrato para micropatrones</td></tr><tr><td>Accutase Accutase</td><td>, Merck Millipore, Singapur</td><td>SCR005</td><td>Enzima para romper células H9 en células individuales</td></tr><tr><td>Activin&nbsp; &nbsp;</td><td>R& D Systems, Singapur</td><td>338-AC-010 Factor de</td><td>crecimiento para la diferenciación H9</td></tr><tr><td>BMP4&nbsp;</td><td>R& D Systems, Singapur</td><td>338-BP-010</td><td>Factor de crecimiento para la diferenciación de H9</td></tr><tr><td>Sistema de plasma&nbsp;</td><td>Femto Science, Corea</td><td>CUTE-MP</td><td>Para la oxidación por plasma de la plantilla Dispasa</td></tr><tr><td></td><td>StemCell&trade; Technologies, Singapur</td><td>7923</td><td>Enzima utilizada para debilitar la adhesión célula-ECM durante el paso</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO, EE. UU.</td><td>11330032</td><td>Medio basal para células H9</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>R& D Sistemas, Singapur</td><td>233&ndash; FB&ndash; 025</td><td>Factor de crecimiento para la diferenciación de H9</td></tr><tr><td>Línea celular H9</td><td>WiCell Research Institute, Inc., EE. UU.</td><td>WA09</td><td>Células madre embrionarias humanas</td></tr><tr><td>Matriz de membrana basal calificada para hESC</td><td>Matrigel, BD Biosciences, Singapur</td><td>354277</td><td>Recubrimiento de matriz extracelular para apoyar el crecimiento de células H9</td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Leica Microsystems, Singapur</td><td>DMi1</td><td>Para capturar campo claro imágenes</td></tr><tr><td>Cortadora láser</td><td>Epilog Helix 24 Laser System</td><td></td><td>Se utiliza para generar orificios pasantes en láminas de PDMS</td></tr><tr><td>mTeSR&trade; 1 medio&nbsp;</td><td>StemCell&comercio; Technologies, Singapur</td><td>5850</td><td>Medio de mantenimiento para celdas H9</td></tr><tr><td>PDMS&nbsp;</td><td>SYLGARD&reg; 184, Dow Corning Co., EE. UU</td>. <td>3097358-1004</td><td>Se utiliza para pegar la plantilla de PDMS y el reservior</td></tr><tr><td>ROCKi Y27632</td><td>Calbiochem, Merck Millipore, Singapur</td><td>688000</td><td>Mantiene las células H9 como células individuales&nbsp;</td></tr><tr><td>STEMdiff&comercio; APEL&comercio; medio&nbsp;</td><td>StemCell&comercio; Tecnologías, Singapur</td><td>5210</td><td>Medio de diferenciación para células H9 Película</td></tr><tr>de<td>tereftalato de polietileno</td><td>SureMark Singapore</td><td>SQ-6633</td><td>Utilizado para formar plantillas&nbsp;</td></tr><tr><td>Surfactante no iónico compatible con cultivos celulares</td><td>Ácido plurónico F-127, Sigma, Singapur</td><td>P2443</td><td>Reactivo pasivante para repeler la adhesión celular en sustratos no micromodelados</td></tr></tbody></table>

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Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Las células madre pluripotentes humanas (hPSCs), incluidas las células madre embrionarias y las células madre pluripotentes inducidas, tienen la capacidad intrínseca de diferenciarse en las tres capas germinales. Esto los convierte en una fuente celular atractiva para la medicina regenerativa y el modelado experimental de la organogénesis normal y enferma. Sin embargo, la diferenciación de las hPSCs in vitro es heterogénea y espacialmente desordenada. Las tecnologías de micropatrones celulares ofrecen potencialmente los medios para controlar espacialmente los microambientes de células madre y organizar los destinos de diferenciación resultantes. El micropatrón de hPSC debe tener en cuenta los estrictos requisitos para la supervivencia y el mantenimiento de las hPSC. Aquí, describimos el micropatrón de esténcil como un método que es altamente compatible con las hPSC. Los micropatrones de hPSC se especifican mediante las geometrías de los orificios pasantes de la celda, que limitan físicamente las ubicaciones donde las hPSC pueden acceder y adherirse al sustrato recubierto de matriz extracelular subyacente. Debido a este modo de operación, existe una mayor flexibilidad para usar sustratos que puedan soportar adecuadamente hPSC en comparación con otros métodos de micromodelado celular. También destacamos los pasos críticos para la generación exitosa de micropatrones de hPSC. A modo de ejemplo, demostramos que el micropatrón de esténcil de hPSCs puede utilizarse para modular la polarización espacial de las adherencias célula-célula y célula-matriz, lo que a su vez determina los patrones de diferenciación del mesoendodermo. Este método simple y robusto para micromodelar hPSCs amplía las perspectivas de establecer modelos experimentales para investigar la organización y el patrón de los tejidos durante el desarrollo embrionario temprano.

En este trabajo se describe la fabricación de una plantilla de células mediante el uso de un cortador láser para generar 1.000 micras características. La plantilla se compone de 2 partes: una lámina delgada de letreros (aproximadamente 100-200 m de espesor) que contiene la microestructura agujeros pasantes, y una junta de PDMS para contener la solución de recubrimiento ECM o suspensión celular. Aquí, las hojas gruesas de PDMS comercialmente disponibles 127 micras y 2 mm se usaron como la...

Las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) tienen la capacidad intrínseca para diferenciarse y auto-organizarse en patrones de tejidos distintos; aunque esto requiere la presentación de los gradientes ambientales espaciales. Presentamos micropatterning plantilla como un método simple y robusto para generar gradientes bioquímicas y mecánicas para el control de los patrones de diferenciación HPSC.

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Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

El objetivo general de este método de micropatrón basado en plantilla, para células madre pluripotentes humanas, es proporcionar un medio sencillo y robusto para generar gradientes ambientales espaciales que controlen los patrones de diferenciación de las células madre. Este método puede ayudarle a responder preguntas clave sobre el patrón de tejidos utilizando un modelo de células madre humanas, como la forma en que los gradientes espaciales en las fuerzas de adhesión célula-célula y célula-matriz extracelular pueden contribuir a organizar los destinos de diferenciación de las células madre. La ventaja de este método es que no requiere modificaciones adicionales de la superficie para generar patrones adhesivos de matriz extracelular a los que las células puedan adherirse.Esto significa que el método es compatible con diversas configuraciones de matriz extracelular y sustratos, específicas para cada línea celular. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de micropatrones son difíciles de aprender debido a que requieren un manejo preciso y cuidadoso del esténcil y las células.Para este procedimiento, los esténciles de PTMS ya deben estar diseñados y fab

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Investigación

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Developmental Biology

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Con la intención de caracterizar los cambios en los miRNAs en células madre neurales humanas diferenciadas (hNSCs) describimos la diferenciación de hNSC en un sistema tridimensional, la evaluación de los cambios en la expresión de microRNA por la matriz de PCR de miRNA, y el análisis computacional para la predicción de objetivos de miRNA y su validación por ensayo de luciferasa dual.

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Aquí, presentamos pluripotentes humanas protocolos de cultura de la célula de vástago (hPSC), solía diferenciarse hPSCs a CD34+ de progenitores hematopoyéticos. Este método utiliza la manipulación de la fase específica de canónica WNT de señalización especificar las células exclusivamente ya sea definitivo o primitiva hematopoyética programa.

Dirige la diferenciación de progenitores hematopoyéticos primitivo y definitivo de las células madre Pluripotent humanas

Presentamos un protocolo de reversión química rápida, eficiente y a granel de las células madre pluripotentes humanas linaje preparado convencional (hPSC) en un estado de preimplantación epiblasto como pluripotentes ingenua de epigenomically estable. Este método resulta en expresión génica disminución linaje preparado y notable mejora en la diferenciación del multilineage dirigida a través de un amplio repertorio de líneas convencionales hPSC.

Reversión química de células madre pluripotentes humanas convencionales a un estado ingenuo con potencia mejorada del Multilineage diferenciación

El método presentado aquí utiliza micropatrones junto con imágenes cuantitativas para revelar la organización espacial dentro de los cultivos de mamíferos. La técnica es fácil de establecer en un laboratorio de biología celular estándar y ofrece un sistema manejable para estudiar el patrón in vitro.

Mapeo de la Organización Espacial Emergente de Células De mamíferos usando Micropatrones e Imágenes Cuantitativas

Los ligandos de matriz extracelular se pueden patrones en hidrogeles de poliacrilamida para permitir el cultivo de células madre embrionarias humanas en colonias confinadas en sustratos compatibles. Este método se puede combinar con microscopía de fuerza de tracción y ensayos bioquímicos para examinar la interacción entre la geometría del tejido, las fuerzas generadas por células y la especificación del destino.

Patrón de la geometría de las colonias de células madre embrionarias humanas en sustratos compatibles para controlar la mecánica de nivel de tejido

La reprogramación celular requiere la introducción de genes clave, que regulan y mantienen el estado celular pluripotente. El protocolo descrito permite la formación de colonias de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a partir de fibroblastos dérmicos humanos sin métodos virales/integradores pero utilizando ARN no modificados (NM-RNA) combinados con factores de evasión inmune que reducen los mecanismos de defensa celular.

Aislamiento de fibroblastos dérmicos humanos adultos de la piel abdominal y generación de células madre pluripotentes inducidas utilizando un método no integrador

Este protocolo introduce un método de micropatrón libre de litografía que es simple y accesible para aquellos con un fondo de bioingeniería limitado. Este método utiliza plantillas de corte láser personalizadas para proteínas de matriz extracelular micropatrón en una forma de interés para la modulación de morfologías celulares. El procedimiento para el micropatrón se demuestra utilizando cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas.

Micropatrón simple de células únicas sin litografía con plantillas de corte láser

Presentamos protocolos detallados para la generación y caracterización de modelos de desarrollo neocortical basados en células madre pluripotentes inducidas humanas (hIPSC) 2D y 3D, así como metodologías complementarias que permiten el análisis cualitativo y cuantitativo de la biogénesis y función del cilio primario (PC).

Modelos 2D y 3D basados en células madre pluripotentes inducidas por humanos para diseccionar la participación del cilio primario durante el desarrollo neocortical

Los sistemas de diferenciación de células madre pluripotentes (PSC) a células funcionales disponibles se ven obstaculizados actualmente por problemas de variabilidad severa de línea a línea y de lote a lote. Aquí, utilizando la diferenciación cardíaca como ejemplo principal, presentamos un protocolo para monitorizar y modular de forma inteligente el proceso de diferenciación de PSC basado en el aprendizaje automático basado en imágenes.

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Aprende el método de micropatrón con stencil para células madre pluripotentes humanas. Genera gradientes espaciales que controlan patrones de diferenciación sin modificaciones superficiales adicionales.

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