Stencil Micropatterning de las células madre pluripotentes para el sondeo Organización Espacial de la diferenciación Parcas

El objetivo general de este método de micropatrones basado en plantillas, para células madre pluripotentes humanas, es proporcionar un medio simple y robusto para generar gradientes ambientales espaciales que controlen los patrones de diferenciación de las células madre. Este método puede ayudarle a responder preguntas clave en el modelado de tejidos utilizando un modelo de células madre humanas, como por ejemplo cómo los gradientes espaciales en las fuerzas de adhesión célula-célula y matriz celular pueden ayudar a organizar los destinos de la diferenciación de las células madre. La ventaja de este método es que no requiere una modificación adicional de la superficie para generar patrones de ECM adhesivos para que las células se adhieran.

Esto significa que el método es compatible con varias configuraciones de ECM y sustrato, específicas para cada línea celular. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de micropatrones son difíciles de aprender. Porque requiere un manejo preciso y cuidadoso de la plantilla y las celdas.

Para este procedimiento, las plantillas PTMS ya deben estar diseñadas y fabricadas. Del mismo modo, haga que las células EFC humanas crezcan en la matriz de la membrana basal, de modo que las colonias estén listas para la siembra más adelante en el procedimiento. Para comenzar, cargue un plato con 700 microlitros de etanol de grado analítico al 70%, en agua ultrapura.

Luego, coloque la plantilla de PDMS en la solución y coloque el plato en un gabinete de bioseguridad para que se seque durante la noche. Al día siguiente, comprueba que no se hayan formado burbujas debajo de la plantilla. Luego, coloque el plato hasta que las células se puedan sembrar en la plantilla.

Prepare una alícuota de matriz de membrana basal de calidad ESC humana agregando 16,7 mililitros de DMF12, para hacer una solución 1,5x y mantenerla en hielo. Trate el sustrato con 100 vatios de plasma de oxígeno durante 90 segundos. No abra el plato hasta que esté dentro de la cámara de plasma y cúbralo rápidamente después del tratamiento.

Este tratamiento evitará que se formen burbujas cuando el sustrato se sumerja en solución. Ahora, cubra la plantilla con 450 microlitros de solución de matriz de membrana basal preparada 1,5x. A continuación, selle la placa con parafilm e incube durante cinco horas.

Antes de continuar, revise las seis placas de pocillos de las colonias HESC preparadas. Identificar y aspirar colonias de células diferenciadas que han perdido su morfología típica de HESC. Todos deben aparecer redondeados, tener una morfología epitelial muy compacta y tener una alta proporción de núcleo a citoplasma con nucléolos prominentes.

A continuación, lave cada pocillo de células plateadas con dos mililitros de DMF12 dos veces. Después del segundo lavado, agregue un mililitro de enzimas digestivas a cada pocillo, como la accutasa e incube la placa durante ocho minutos a 37 grados centígrados. Después de la incubación, golpee suavemente la placa para separar todas las colonias del sustrato.

A continuación, enjuague cada pocillo con al menos cuatro mililitros de medio por cada mililitro de enzima digestiva aplicada al pocillo y recoja las suspensiones celulares en un solo tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar las células a 200 g durante tres minutos a temperatura ambiente para formar un pellet de células. A continuación, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 400 microlitros de medios de mantenimiento HESC, suplementados con 10 micromolares de inhibidor de rocas.

Tritura las células suavemente tres veces para romper los grumos. A continuación, corrija la densidad de las suspensiones. Mézclalo bien y haz una dilución de 200 microlitros 1:20 en el medio.

Cuente las células en la dilución con un hemocitómetro. Luego, diluya la suspensión principal según sea necesario, utilizando medios con inhibidor de rocas. Para continuar, agregue el número requerido de celdas en cada galería de símbolos preparada.

Solo se debe depositar una sola capa de células, así que distribúyalas uniformemente. Deje que la plantilla permanezca inalterada durante cinco minutos, para que las células puedan asentarse. Luego, transfiera con cuidado las plantillas cargadas a una incubadora, manteniendo los platos nivelados durante toda la transferencia.

Deje que las células se adhieran a las plantillas durante una incubación de una hora. Después de permitir que las células se adhieran, examínelas bajo un microscopio para asegurarse de que lo hicieron correctamente. Transfiera la plantilla de nuevo a la cubierta y aspire las células no adheridas de la plantilla.

A continuación, agregue dos mililitros de surfactante no iónico compatible con el 0,5% en DMF12 en el área que rodea la plantilla. Gira la solución para cubrir la plantilla. Luego, usa un par de pinzas esterilizadas en autoclave para despegar suavemente la plantilla del plato.

Después de quitar la plantilla, inspeccione las células del micropatrón bajo un microscopio. El tensioactivo no iónico evita que estas células se sequen. Deje que las células de micropatrón se incuben en la solución de medios suplementada con surfactante durante 10 minutos a 37 grados centígrados.

Después de 10 minutos, aspire la solución y lave la placa con dos mililitros de medio DMF12 normal, tres veces. Después de los lavados, agregue dos mililitros de medio de mantenimiento HESC con inhibidor de rocas. Una vez más, inspeccione las células para comprobar que los micropatrones se han formado correctamente.

Luego, incuba las células a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, aspire el medio, lave las células una vez con DMF12 y luego agregue dos mililitros de medio de diferenciación suplementado, para inducir a las células a experimentar la diferenciación del mesoendodermo. Más tarde, analice los resultados.

La fabricación de la plantilla de celda utilizando una cortadora láser, proporcionó características de 1000 micras. La plantilla estaba compuesta por una fina lámina de estarcido con agujeros pasantes microestampados y una junta de PDMS utilizada para contener las células. Con esta herramienta, se investigaron los HESCs micropatrificados durante la diferenciación del mesoendodermo.

Las periferias de las colonias de H9-HESC tienen mayores adherencias de integrinas que las células en el interior de la colonia. Por lo tanto, las células se diferencian en células mesoendodermo braquiares T positivas, cuando se inducen con activan, BMP4 y FGF2. Cuando tales células se modelaron en monocapas de diferentes geometrías, ángulos rectos geométricos e isótropos y curvaturas convexas, condujeron a una concentración local de fuerzas de tracción mediadas por integrinas y dieron lugar a una mayor diferenciación del mesoendodermo.

La intensidad de la expresión de T en diferentes localidades dentro de una misma colonia mostró que el grado de inducción del endodermo meso era mayor en las esquinas afiladas de las colonias cuadradas y rectangulares, y en las curvaturas convexas de un arco semicircular. Esto demuestra que las fuerzas mecánicas mediadas por la adhesión celular se pueden modular utilizando el método descrito. Antes de intentar el procedimiento, es importante optimizar el tiempo de recubrimiento de la matriz, la digestión celular y el tiempo de unión, para la línea específica de células madre pluripotentes humanas con las que está trabajando.