Detección de Anastasis en Vivo por CaspaseTracker Biosensor

El objetivo general de este procedimiento es detectar y rastrear la reversión del proceso de muerte celular después de la activación de caspasas en animales vivos utilizando Drosophila melanogaster como modelo. En respuesta al estímulo de muerte, las células experimentan una muerte celular programada, como la apoptosis, que tradicionalmente se ha considerado como una cascada irreversible que conduce a la muerte celular. Curiosamente, sin embargo, después de la eliminación del estímulo de muerte, algunas células moribundas pueden revertir el proceso de muerte celular incluso en la etapa tardía.

A través de un fenómeno de recuperación celular recientemente descubierto llamado anástasis. La microscopía de células vivas muestra que las células moribundas apoptóticas muestran características morfológicas únicas, como la formación de ampollas en la membrana plasmídica, la condensación nuclear y la contracción celular. En general, se espera que estas células mueran.

Sin embargo, después de lavar e incubar las células moribundas con medio fresco, se someten a anástasis, se recuperan y luego pueden dividirse. Es difícil detectar y rastrear la anastasis en animales vivos porque las células recuperadas pueden ser morfológicamente indistinguibles de las células sanas circundantes. Para resolver este problema, se desarrolló el sistema de biosensores CaspaseTracker de mamíferos para identificar y rastrear las células que revierten el proceso de muerte celular después de la ejecución o activación de la caspasa, el sello distintivo de la apoptosis.

Este sistema de biosensores consta de dos componentes: el transactivador activable por caspasa, rtTA, y el indicador de actividad rtTA basado en Cre LoxP. En las células sanas, sin actividad de caspasa, la rtTA está unida a un anclaje de la membrana plasmática a través de un enlazador DEVD escindible de caspasa. Como el rtTA anclado no puede translocarse del citosol al núcleo, el reportero de rtTA permanece inactivo.

Sin embargo, tras la activación en respuesta a la inducción de la muerte celular, las caspasas escinden el enlazador DEVD, liberando a la rtTA para que se transloque al núcleo y active el reportero de rtTA. Una vez en el núcleo, el rtTA se une al elemento de respuesta tet, o TRE, y desencadena la expresión transitoria de Cre recombinasa, lo que conduce a un evento de recombinación irreversible que elimina el casete del codón de parada entre el promotor CAG y las secuencias codificantes de la proteína fluorescente roja DsRed. Esto da como resultado la expresión permanente de DsRed, que sirve como marcador fluorescente permanente para las células que pueden permanecer vivas después de haber experimentado la actividad de las caspasas, así como para su progenie.

La microscopía confocal de células vivas muestra que después de la inducción de la muerte celular transitoria, las células biosensoras CaspaseTracker expresan DsRed durante y después de su recuperación y, por lo tanto, las distinguen de las células no recuperadas, indicadas por flechas blancas, así como de las células biosensoras de control que no estuvieron expuestas al estímulo de muerte celular. La muerte celular programada, como la apoptosis, generalmente se asume como irreversible porque es ejecutada por una destrucción celular desenfrenada y masiva. Sin embargo, encontramos que esa célula moribunda puede recuperarse incluso en la etapa tardía que se ha considerado como el punto de no retorno, como después de la liberación del citocromo c, la activación de la caspasa-3, el daño al ADN, la formación de la membrana plasmática, la contracción celular y la formación de cuerpos apoptóticos.

A esta inversión del proceso de muerte celular la llamamos anástasis, que significa resucitar a la vida en griego. Mediante el uso de microscopía de células vivas, podemos observar la anastasis en células cultivadas. Sin embargo, es técnicamente difícil observar la anastasis en animales vivos porque la célula de muerte recuperada puede parecer células sanas normales que no intentaron la muerte celular en absoluto.

Por lo tanto, desarrollamos un sistema de biosensores CaspaseTracker para detectar y rastrear la anastasis en animales vivos. La versión de Drosophila del sistema CaspaseTracker es un biosensor dual que consta de dos componentes: el factor de transcripción de uso activado por caspasa, GAL4, y el indicador de actividad GAL4, conocido como G-TRACE. En las células sin actividad de caspasa, el factor de transcripción de levadura, GAL4, está unido a un dominio de anclaje de la membrana plasmática a través de un enlazador DQVD escindible en caspasa.

Tras la activación de las caspasas, las caspasas activadas escinden el enlazador DQVD para liberar GAL4, que luego se transloca al núcleo para activar el reportero G-TRACE. El nuclear GAL4 se une a las secuencias activadoras específicas aguas arriba, abreviadas UAS, para desencadenar la expresión transitoria de RFP, que sirve como reportero de la actividad reciente o actual de la caspasa hasta que la caspasa y la actividad de GAL4 se detienen y la proteína RFP se degrada. GAL4 también desencadena la expresión de la FLP recombinasa, que conduce a un evento de recombinación que elimina el casete de parada entre la ubiquitina, Ubi abreviado, promotor y las secuencias de recubrimiento para la GFP dirigida a la energía nuclear.

Esto da como resultado la expresión permanente de GFP nuclear, que sirve como un marcador permanente para las células que han experimentado actividad de caspasas pero permanecen vivas, así como su progenie. Por lo tanto, este sistema puede identificar células con actividad de caspasa en curso o reciente mediante la señal RFP transitoria y actividad de caspasa pasada con la señal GFP permanente. Un biosensor de control tiene la mutación DQVA en el sitio de escisión de la caspasa, que es insensible a la actividad de la caspasa.

Las moscas hembras vírgenes GAL4 sensibles a las caspasas se cruzaron con moscas macho jóvenes G-TRACE, o viceversa, para generar las moscas CaspaseTracker. Para probar la reversibilidad del proceso de muerte celular después de la activación de la caspasa, las moscas primero se exponen a un estrés ambiental transitorio que induce la muerte celular, como el choque frío o la inanición de proteínas. Luego, las moscas estresadas se transfieren de nuevo a las condiciones normales de cultivo para su recuperación.

Los tejidos se obtuvieron de las cámaras de los huevos en los ovarios de las moscas control, estresadas o recuperadas. Las muestras se sometieron a microscopía confocal para detectar las señales fluorescentes del biosensor CaspaseTracker. Para empezar, las moscas DQVD GAL4 sensibles a las caspasas anestesiadas y recientemente cerradas utilizan dióxido de carbono y, con un pincel, transfieren de 7 a 10 hembras vírgenes a un vial de alimento fresco con una pequeña cucharada de pasta de levadura.

Aparea las hembras con 7 a 10 machos reporteros G-TRACE GAL4 jóvenes. Las moscas vírgenes recién encerradas muestran el meconio verde oscuro, indicado por flechas, que son los restos de alimento para las larvas. Las moscas recién encerradas tienden a ser más grandes que las moscas maduras.

Los machos tienen un abdomen más oscuro, indicado por círculos, y tienden a ser más pequeños que las hembras. Configure la cruz a 18 grados centígrados para reducir las señales inespecíficas del biosensor CaspaseTracker en la progenie, ya que la actividad de GAL4 aumenta con la temperatura. Cada tres a siete días, mueva a los adultos a un nuevo frasco con pasta de levadura hasta que su productividad disminuya.

Cuando la progenie esté cerca, conecte las moscas con ambos transgenes de GAL4 y G-TRACE sensibles a las caspasas, que funcionarán como las moscas de la progenie CaspaseTracker. Ambas inserciones están equilibradas por Curly-O. Por lo tanto, las moscas no aladas rizadas tendrán ambos transgenes.

Para un control negativo, recoja progenie transgénica dual de un cruce entre hembras DQVA GAL4 insensibles a las caspasas y machos reporteros G-TRACE GAL4 o viceversa. De los cruzamientos experimentales, transfiera cohortes de 10 a 20 moscas hembras recién cerradas a nuevos viales con pasta de levadura. Agregar algunos machos ayudará a las hembras a la producción de huevos.

Transfiera las moscas bien alimentadas a 18 grados centígrados durante un día para que sus ovarios produzcan cámaras de huevos a través de la OO-génesis. Luego, para inducir a sus cámaras de huevos a sufrir apoptosis, use un choque frío. Transfiera las moscas a un vial nuevo sin comida y congélelas a 7 grados centígrados durante una hora.

Un método alternativo para inducir la apoptosis de la cámara de huevos es utilizar la inanición de proteínas alojando a las moscas con un 8 por ciento de sacarosa y un 1 por ciento de comida en agar a 18 grados centígrados durante tres días. Cambie los viales de alimentos sin proteínas diariamente cuando use este método. Después de estresar a las moscas por cualquiera de los métodos, devuélvalas a la condición normal de alojamiento y alimente con pasta de levadura durante tres días para permitir que se recuperen.

Más tarde, disecciona estas moscas para aislar sus cámaras de huevos y ovarios. Después de anestesiarlos, use dos pares de fórceps para quitarles la cabeza. A continuación, tira de las moscas en la base del abdomen para extirparles los ovarios.

Prepárese para recolectar los ovarios recubriendo las puntas de pipeta de plástico con un 1 por ciento de BSA disuelto en agua o PBS para que las cámaras de huevos no se peguen a las puntas de la pipeta. Después de diseccionar las cámaras de huevos, recójalas en puntas preparadas con aproximadamente medio mililitro de PBS. Luego transfiéralos a un tubo de centrífuga de un mililitro y deje que los huevos se asienten.

Continúe el procedimiento en condiciones de poca luz o completamente oscuras para evitar el fotoblanqueo de las etiquetas fluorescentes. Aspire el PBS y cargue 500 microlitros de paraformaldehído al cuatro por ciento en PBS en el tubo de centrífuga. Deje que los huevos se fijen durante 20 a 30 minutos a temperatura ambiente con una rotación suave.

Evite la fijación prolongada, ya que agotará la señal de las proteínas fluorescentes en las cámaras de los huevos. Una vez fijado, retire el PFA y lave las cámaras de huevos con 500 microlitros de PBS-T tres veces. A continuación, incubar las cámaras de huevos con PBS-T durante la noche a 4 grados centígrados con una rotación suave para permeabilizar las cámaras de huevos.

A la mañana siguiente, agregue 500 microlitros de PBS-T con 5 microgramos de tinte nuclear azul, como Hoechst, a las cámaras de huevos. Déjelos incubar con una rotación suave a temperatura ambiente durante una o dos horas, pero no más, o las señales se volverán inespecíficas. A continuación, lave la cámara de huevos con PBS-T tres veces durante 10 minutos por lavado.

A continuación, con una pipeta fina, aspire todo el PBS-T y aplique 200 microlitros de agente de montaje antiblanqueo. Los tejidos flotan en la parte superior antes de haber absorbido completamente el agente de montaje. Incubar la cámara del huevo en el agente a 4 grados centígrados durante tres horas o toda la noche.

Después de absorber completamente el agente de montaje, los tejidos se hunden hasta el fondo de los tubos y están listos para ser montados. Para empezar, aplique vaselina en el portaobjetos de vidrio o en el cubreobjetos para evitar destruir las cámaras de huevos por sobrecompresión. Para montar las cámaras de huevos teñidas, transfiéralas con 200 microlitros de agente de montaje a un portaobjetos de vidrio y cúbralas con un cubreobjetos de vidrio de 20 milímetros cuadrados.

Selle el cubreobjetos con esmalte de uñas y proceda con el uso de microscopía confocal. En las cámaras de los huevos del ovario de las moscas CaspasaTracker sanas no hubo actividad del biosensor CaspaseTracker, lo que se indica por la falta de fluorescencia verde y roja. Sin embargo, después de someter a las moscas a un estrés ambiental que induce la muerte celular, como la inanición de proteínas durante tres días, las cámaras de huevos se sometieron al proceso de muerte celular con activación de caspasas, lo que indujo señales de biosensores RFP y GFP.

Por el contrario, la mutación del sitio de escisión de la caspasa en las moscas DQVA insensibles a las caspasas de control abolió la sensibilidad del biosensor, lo que indica que las señales del biosensor dependen de la actividad de la caspasa. Luego, las moscas biosensoras hambrientas y sensibles a las caspasas recibieron alimento proteico durante tres días. Las cámaras de huevos de las moscas recuperadas no expresaron el reporte de caspasas transitorias RFP, lo que indica que no hay actividad de caspasa reciente o en curso.

Es importante destacar que las cámaras de óvulos recuperadas solo expresaron GFP, lo que indica que habían revertido el proceso de muerte celular después de la activación de las caspasas. La anastasis también se observa in vivo después de un estrés por temperatura que induce la muerte celular transitoria. En respuesta al choque frío, las cámaras de huevos moribundos expresan los marcadores biosensores RFP y GFP, lo que indica la actividad reciente o en curso de la caspasa, representada por la señal RFP, y la actividad pasada de la caspasa, representada por la señal GFP.

Sin embargo, después de aliviar el estrés volviendo a la condición normal de cultivo durante tres días, las cámaras de huevos en las moscas recuperadas mostraron solo el indicador de caspasas GFP, lo que indica que las células en estas cámaras de huevos sufrieron anástasis en un punto después de la activación de la caspasa. En particular, la señal GFP CaspaseTracker revela que múltiples tipos de células dentro de las cámaras de óvulos son capaces de revertir el proceso de muerte celular y reparar el daño de las caspasas, incluidas las células de la línea germinal, como los ovocitos y las células nodrizas, y las células del folículo somático. Curiosamente, GFP también marcó células en el germario, que contienen células madre, junto con sus cámaras de óvulos asociadas en la misma cadena ovaria.

Por lo tanto, estas cámaras de óvulos GFP positivas pueden haberse derivado de células madre que se sometieron a anastasis. A continuación se muestran las imágenes que muestran los tejidos que muestran la actividad del biosensor CaspaseTracker sin exposición al estrés ambiental. Estas son las partes de la boca, el intestino anterior, el buche, el intestino medio, el intestino posterior, los túbulos de Malpighi, el ano, el oviducto y los ovarios de una mosca hembra diseccionada y recién cerrada del día 0.

La microscopía confocal revela la actividad reciente de las caspasas, según lo indicado por la RFP, y la actividad pasada de las caspasas, indicada por la GFP. Las imágenes ampliadas muestran la actividad reciente o en curso y pasada de las caspasas en el lóbulo óptico, el cardias, los túbulos de Malpighi, el intestino posterior y las paredes musculares de las cámaras de los huevos que se colocalizaron con la tinción de actina F. Algunos tejidos, como el oviducto, solo muestran actividad de caspasas en el pasado.

Estas actividades biosensoriales sugieren una posible actividad anestésica durante el desarrollo embrionario o la homeostasis normal. También podría indicar actividad actual o pasada de caspasas no apoptóticas. Consulte el manuscrito para obtener más detalles.

El biosensor CaspasaTracker in vivo informa específicamente de la actividad de las caspasas, ya que el CaspasaTracker insensible con la secuencia DQVA no se puede escindir de caspasas no tiene actividad del biosensor. La única señal aquí es la señal no específica de autofluorescencia de pigmentos, cutículas y cuerpos grasos. Después de ver este video, debería tener una comprensión general de cómo podemos usar el sistema de biosensores CaspaseTracker para detectar y rastrear la anástasis en animales vivos.

Estos biosensores pueden facilitar el estudio de la moneda y la función conocida de la anástasis. Su identificación de alcance tiene una amplia gama de aplicaciones fisiológicas, patológicas y terapéuticas. Si bien estos biosensores pueden detectar la reversión de la apoptosis después de la activación de la caspasa, también pueden detectar la recuperación de las células después de que intentan otras formas de muerte celular que involucran directa o indirectamente actividades de caspasas.

Al diseñar un experimento, es muy importante incluir controles recíprocos para distinguir la señal del biosensor fluorescente que rastrea las células anestésicas de las células moribundas con actividades de caspasas en curso. Las células sanas con las actividades de caspasas apoptóticas conocidas actuales o pasadas y la señal de autofluorescencia inespecífica del pigmento, la grasa y la crítica. Encuentre la discusión detallada en la versión PDF de este manuscrito.