Name: Edición genoma en Astyanax mexicanus Uso de transcripción activador de efector nucleasas (Talens) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprende a realizar edición genómica con TALENs en Astyanax mexicanus para estudiar la base genética de adaptaciones cavernícolas. Este método permite investigar la función de genes específicos en la evolución de rasgos de peces de cueva.

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Este trabajo fue financiado por el Departamento de Genética, Desarrollo y Biología Celular y la Universidad Estatal de Iowa y por el NIH subvención EY024941 (WJ) .dr. Jeffrey Essner proporcionó comentarios sobre el manuscrito.

Todos los procedimientos con animales estaban en conformidad con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad Estatal de Iowa y la Universidad de Maryland. 1. Diseño TALEN <ol><li> De entrada deseada secuencia diana a un sitio web de diseño TALEN. (Por ejemplo: <a href="https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen">https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen</a> ). Entrada elegido longitudes de matriz espaciador / repetición. <ol><li> Copiar la secuencia genómica en la casilla &quot;Secuencia&quot;. </li><li> Dentro de la pestaña &quot;Usuario Proporciona espaciador / RVD Longitudes&quot; seleccionar la longitud del espaciador y la longitud de la matriz. Nota: Las longitudes del espaciador de 15 pares de bases y repetir longitudes de matriz de 15-17 trabajo bien y hacer el montaje menos complejo. </li></ol></li><li> Seleccionar un par TALEN. pares TALEN diseñado alrededor de un sitio de enzima de restricción único permiten para el genotipado por digestión de enzima de restricciónun producto de PCR. </li><li> Cebadores Diseño para amplificar la región genómica que rodea el sitio de destino TALEN el uso de un sitio web, como Primer3 30-32. Cuando genotipo con una enzima de restricción, cebadores de diseño para amplificar una región que contiene el sitio de enzima de restricción sólo una vez. Se recomienda que esta región se amplifica y se secuenció antes de la construcción para identificar cualquier TALEN polimorfismos presentes en el A. mexicanus población laboratorio para ser utilizado para la microinyección. </li></ol> 2. Asamblea TALEN (Modificado de Protocolo TALEN Kit) 33,34 Para detalles adicionales y solución de problemas, consulte el protocolo 34. <ol><li> Preparar y secuenciar los plásmidos necesarios del kit TALEN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Configurar el # 1 para las reacciones reacciones A y B. Incluir repetir variable diresidues (1-10) RVDS y la pFUS_A vector de destinación en la Reacción A. Incluir RVDS 11- (N-1) y THvector e destino pFUS_B (N-1) en la Reacción B, donde N es el número total de RVDS en la TALEN. <ol><li> Añadir a cada reacción: 1 l de cada plásmido que contiene cada RVD (100 ng / l), el vector de destino (100 ng / l), 1 l Bsa I enzima de restricción, 1 l albúmina de suero bovino (BSA) (2 mg / ml ), 1 l de ligasa, 2 l de tampón de ligasa 10X y x l de agua para un volumen total de 20 l. Por ejemplo, véase la Tabla 1. Nota: La mitad de reacciones también se pueden utilizar. </li><li> Coloque reacciones en un termociclador y ejecute el ciclo: 10 veces (37 ° C / 5 min + 16 ° C / 10 min) + 50 ° C / 5 min + 80 ° C / 5 min. </li></ol></li><li> Se incuban las reacciones con nucleasa. Para cada reacción de añadir 1 l de ATP 25 mM y 1 l de nucleasa. Se incuban las reacciones a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Transformar reacciones. <ol><li> Transformar 2,5 l de cada reacción en 25 l químicamente células competentes. Nota: Hecho en casa c competenteells se pueden utilizar. Sin embargo, las células con baja competencia puede dar lugar a la falta de colonias. <ol><li> Mezclar 2,5 l de la reacción con 25 l de células químicamente competentes. Incubar en hielo durante cinco min. Se incuban las células durante 30 segundos a 42 ° C. </li><li> Colocar los tubos en hielo durante 2 min. Añadir 125 l de caldo de Super óptima con la represión catabólica (SOC). Agitar los tubos a 37 ° C durante 1 hora. </li></ol></li><li> Plate 100 l de las células transformadas en placas LB con espectinomicina (50 g / ml), X-gal e isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). Crecer O / N a 37 ° C. </li></ol></li><li> Escoja 2-3 colonias blancas para cada reacción y comprobar mediante PCR de colonias usando cebadores pCR8_F1 y pCR8_R1 (Tabla 2). <ol><li> Hacer una mezcla maestra de los reactivos. Por ejemplo, véase la Tabla 3. </li><li> Escoja una colonia y untarlo en el fondo de un tubo de PCR, y luego poner los restos de la colonia en 2 ml de LB con espectinomicina(50 mg / ml). Colocar 15 l de la mezcla maestra en el tubo con la colonia. </li><li> Ejecute el siguiente programa de PCR (Tabla 4) </li><li> Compruebe el PCR (ejecutar todo el volumen) en un gel de agarosa al 1,5% mediante electroforesis. Los clones correctos tendrán una banda en el tamaño esperado, así como una mancha y una escalera de bandas. Para un ejemplo de la mancha apropiada, consulte 34,33. </li><li> Grow 2 ml de cultivos de los clones correctos en medio LB O / N a 37 ° C en una incubadora con agitación. </li></ol></li><li> Miniprep los plásmidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Secuencia de verificación de secuencia TALEN con pCR8_F1 y pCR8_R1. Siga los procedimientos descritos anteriormente 35. </li><li> El uso de los clones correctos verificadas por secuenciación, configurar la reacción # 2 (kit TALEN), que situará a los RVDS de los vectores A y B y el final de RVD en el vector de destino. <ol><li> Preparar la mezcla de reacción 2 (Tabla 5). Nota: Jareacciones LF pueden ser utilizados. </li><li> Colocar las reacciones en un termociclador y ejecute el siguiente programa: 37 ° C / 10 min + 16 ° C / 15 min + 37 ° C / 15 min + 80 ° C / 5 min. </li></ol></li><li> Transformar reacciones. <ol><li> Transformar 2,5 l de cada reacción en 25 l químicamente células competentes. <ol><li> Mezclar 2,5 l de la reacción con 25 l de células químicamente competentes. Incubar en hielo durante 5 min. Choque térmico de las células durante 30 segundos a 42 ° C. </li><li> Colocar los tubos en hielo. Añadir 125 l de SOC. Colocar los tubos en una incubadora de agitación a 37 ° C durante 1 hr. </li></ol></li><li> Plate 100 l de las células transformadas en placas LB con ampicilina (100 mg / ml), X-gal e IPTG. Crecer O / N a 37 ° C. </li></ol></li><li> Escoja 1-3 colonias blancas para cada reacción y comprobar mediante PCR de colonias usando cebadores TAL_F1 y TAL_R2 (Tabla 2). <ol><li> Hacer una solución de la polimerasa de Mastermix, agua y cebadores tal como sese describe en la Tabla 3. Escoja una colonia y untarlo en el fondo de un tubo de PCR, y luego poner los restos de la colonia en 2 ml de LB con ampicilina (100 mg / ml). Colocar 15 l de la solución en el tubo con la colonia. </li><li> Ejecutar el programa de PCR (Tabla 6). </li><li> Compruebe la PCR en un gel de agarosa al 1,5% mediante electroforesis. Los clones correctos tendrán un emborronamiento y una escalera de bandas. Para un ejemplo de la mancha apropiada, consulte 34,33. </li><li> Grow 2 ml de cultivos de los clones correctos en medio LB O / N a 37 ° C en una incubadora con agitación. </li></ol></li><li> Miniprep los plásmidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Secuencia de verificación de secuencia TALEN con TAL_F1 y TAL_R2 siguiendo los métodos descritos anteriormente 35. </li></ol> 3. La transcripción de ARNm Talens <ol><li> Digerir 4 g de plantilla de secuencia verificada con 2 l Sac I durante 2 horas a 37 ° C. </li&gt; <li> Ejecutar 2 l de plásmido digerido con Sac en un gel de agarosa al 1,5% mediante electroforesis. Los plásmidos que se digieren correctamente se mostrará una sola banda. </li><li> Se purifica el plásmido digerido con Sac restante siguiendo el protocolo de kit de purificación de PCR. Lavar dos veces con la solución de lavado antes de la elución. Eluir en 30 l de agua libre de nucleasa. </li><li> Siga el protocolo estándar para la producción de T3 mRNA. <ol><li> Configurar medias reacciones utilizando 0,5 g de plantilla linealizado (preparado anteriormente). Incubar a 37 ° C durante 2 hr. </li><li> Añadir 0,5 l de DNasa (incluido en el kit) y se incuba a 37 ° C durante 15 minutos. </li></ol></li><li> Se purifica el mRNA, siguiendo las instrucciones del fabricante. Eluir en 30 l de agua libre de nucleasa. </li><li> Ejecutar un gel de agarosa al 1,5% mediante electroforesis para comprobar el mRNA. <ol><li> Limpiar el aparato de gel con un producto para eliminar la contaminación de ARNasa y preparar un gel de 1,2%. </li><li> Mezcla 1 mRNA l + 4 y# 181; l de agua + 5 l de tinte de carga glioxilo libre de nucleasa. Incubar las muestras a 50 ° C durante 30 min. Centrifugar los tubos brevemente y colocar en hielo antes de ejecutar el gel. </li></ol></li><li> Comprobar la concentración utilizando un método de cuantificación de las concentraciones de ácidos nucleicos y almacenar el RNA en alícuotas a -80 ° C. Elija un tamaño de alícuota de tal manera que el ARN no está congelado / descongelado más de una vez. Nota: Las concentraciones de 500-1000 ng / nl se obtienen típicamente. ARN con una concentración más baja se puede utilizar como el tiempo que se mantiene la integridad del ARN (tal como se evaluó por una banda en lugar de una mancha en el gel). </li></ol> 4. Inyectar Astyanax mexicanus Los embriones con TALEN ARNm <ol><li> Preparar Herramientas para inyección. <ol><li> Verter en las placas de inyección mediante el vertido de 1,2% de agarosa en agua de pescado (agua acondicionada con bicarbonato de sodio y sal de mar a pH 7,4 y la conductividad de 700 mS) en una placa de Petri. Colocar un molde (pieza de plástico con las proyecciones de hacer pozos para peceshuevos) en el interior del plato. Retire el molde cuando la agarosa se ha endurecido y se almacena a 4 ° C. Para más detalles sobre el molde ver 36. </li><li> Tire de agujas para inyección utilizando un extractor de aguja de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Nota: longitud de la aguja apropiada es importante para inyecciones. Agujas que son demasiado largos serán demasiado flexible para inyecciones. El protocolo para agujas de tracción variará con el equipo utilizado para tirar de las agujas. Un ejemplo de una aguja apropiada se muestra en la Figura 1. Para nuestro equipo, que tire las agujas que son de 5-6 cm de longitud, y tienen un diámetro exterior en la punta de aproximadamente 0,011 mm cuando se rompen. Sin embargo, las agujas deben ser calibrados (paso 4.3.4) para determinar el ancho de la abertura. Un programa de ejemplo para tirar de las agujas se puede encontrar en la Tabla 7. </li><li> Preparar pipetas de vidrio para la transferencia de embriones rompiendo la pipeta de modo que la abertura sea suficientemente grande para un huevo pase a través. Flamear el extremo roto hastaya no es agudo. Nota: Es importante utilizar pipetas de vidrio y recipientes de vidrio cuando se trabaja con A. huevos mexicanus y embriones, ya que son pegajosos y se adhieren al plástico. </li></ol></li><li> Recoge 1 de células Etapa huevos. <ol><li> Raza A. mexicanus siguiendo protocolos estándar 37. Nota: Por ejemplo, si los peces se mantienen en un 14 ciclo de luz: oscuridad 10 y usando el tiempo Zeitgerber (ZT) con Zt0 como luces encendidas y ZT14 como las luces apagadas, nuestra peces desovan superficie entre ZT15 y ZT19. la época de reproducción exacta debe determinarse para cada laboratorio individual. </li><li> Inducir el desove de los peces sobrealimentación durante 3-4 días antes del apareamiento y la colocación de los peces en agua dulce. Elevar la temperatura de 2 ° C. Nota: Nuestro temperatura inicial del agua es de aproximadamente 74 ° C. </li><li> Recoger los huevos de peces de la superficie en la oscuridad, comprobando cada 15 min para obtener huevos en la etapa de 1 célula. Cientos de huevos se pueden obtener de un único par de peces superficie. </li><li> Recogerhuevos en recipientes de vidrio para evitar que se pegue a las superficies de plástico y de tipo para aislar embriones en la etapa de 1 célula antes de la inyección mediante la observación de los huevos bajo el microscopio y la recogida de los huevos que son una sola célula. Mantenga los huevos en agua dulce del sistema (agua del tanque en el que se alojan los peces adultos, que ha sido tratado para el pH y la conductividad). </li></ol></li><li> Inyectar TALEN mRNA. <ol><li> Inyectar diferentes cantidades de mRNA total (cantidades iguales de cada TALEN en el par) para determinar la concentración óptima para la inyección como la toxicidad y la eficacia varían por TALEN par. Para empezar, la inyección de concentraciones de ARNm totales que son 400-800 pg. Diluir y combinar mRNA a concentraciones deseadas para la inyección de 1,5 nl. </li><li> Cargar diluyó ARNm en la parte posterior de la aguja y colocar la aguja a un micro-inyector. </li><li> Romper la aguja con unas pinzas. </li><li> Calibrar la aguja. Por ejemplo, expulse 10 veces y recoger el consiguiente descenso de un capilar micro. Por 10 x 100 1.0 desechable81; l, 32 mm micro capilar, la caída debe llenar el micro capilar de 0,5 mm para la inyección de 1,5 nl / 1. Ajustar el tiempo de inyección y la presión según sea necesario. </li><li> Insertar la aguja en la celda única e inyectar el ARNm. Inyectar el mRNA directamente en la célula, no en la yema. </li><li> Recoger los embriones inyectados en recipientes de vidrio. Mantener embriones a 23-25 ​​° C. Retire los embriones muertos (que se convierten en embriones nublado y de forma irregular) regularmente durante los primeros días después de la inyección. Un número récord de embriones muertos y deformes de control (no inyectada) y las placas inyectadas. Nota: El aumento de la concentración de ARNm puede conducir a un aumento de la toxicidad y la deformidad / muerte de los embriones. Por lo tanto, la toxicidad frente a la eficiencia debe ser equilibrado para determinar la mejor concentración de ARNm para inyectar. </li></ol></li></ol> 5. El fenotipo de los pescados Fundador y evaluar la eficiencia TALEN <ol><li> Sacrificar embriones de animales según el protocolo institucional. Nota: Se practicar la eutanasiaembriones se refrigera rápidamente en hielo. </li><li> Recoger los embriones en 0,8 l de PCR tiras de tubos utilizando una pipeta de transferencia. Nota: El genotipado puede realizarse en embriones o piscinas de embriones individuales. </li><li> Extraer el ADN. <ol><li> Coloque los embriones en 100 l de hidróxido de sodio 50 mM (NaOH) y se incuba a 95 ° C durante 30 min, después se enfría a 4 ° C. </li><li> Añadir 1/10 volumen (10 l) de 1 M Tris-HCl pH 8. </li></ol></li><li> Realizar una PCR en la región utilizando los cebadores diseñados en el paso 1.3 (véase las Tablas 8 y 9 para los protocolos de muestra). Para los embriones individuales 1 l de ADN es suficiente para la reacción de PCR. </li><li> Se digiere el producto de PCR resultante con la enzima de restricción apropiada y correr un gel de agarosa al 1,5% mediante electroforesis. <ol><li> Por ejemplo, para la genotipificación del locus albinismo oculocutáneo 2 (OCA2) en embriones inyectados digerir el producto de PCR usando la enzima de restricción Bsr I mediante la adición de 0.5 L de Bsr I directamente a 12,5 l de la reacción de PCR completado, incubando a 65 ° C durante 2 horas. Ejecutar el no digerido y el producto digerido en un gel. Bandas resistentes de enzimas de restricción (es decir, bandas que no digieren) indican que las mutaciones inducidas por TALEN están presentes (Figura 2). </li></ol></li><li> (Opcional) Calcular la tasa de mutación porcentaje determinando el porcentaje de producto sin cortar mediante el análisis de imágenes de los geles en Fiji 38 utilizando la herramienta de análisis de gel para calcular el valor de intensidad de cada banda como se ha descrito previamente 29. </li><li> Determinar la secuencia de los alelos mutantes por clonación TA la banda mutante resistente se purificó en gel de enzima de restricción y secuenciación de clones. <ol><li> Gel purificar la enzima de restricción banda mutante resistente siguiendo las instrucciones del fabricante. TA clonar la banda siguiendo las instrucciones del fabricante. Recoger colonias y crecer en 1,5 ml de LB O / N a 37 ° C en un zarandeoincubadora. </li><li> culturas Miniprep siguientes instrucciones del fabricante. Enviar el ADN para la secuenciación. </li><li> El uso de un programa como el mono, alinear las secuencias mutantes de la secuencia de tipo salvaje. <ol><li> Copiar y pegar las dos secuencias en archivos APE. Elija la herramienta &quot;alinear dos secuencias&quot; en el menú &quot;Herramientas&quot;. </li><li> Especificar las dos secuencias de ADN utilizando los menús desplegables. Nota: puede ser necesario utilizar dependiendo de la dirección de la PCR entró en el vector de clonación el complemento inverso de la secuencia clonada. Si las secuencias no se alinean, repita los pasos marcando la casilla &quot;Rev-Com&quot; en el cuadro &quot;ADN Align&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Evaluar los peces fundador de fenotipos en la etapa adecuada y mediante métodos apropiados para el fenotipo esperado 29 (Por ejemplo, la Figura 3). Los métodos de fenotipificación se basarán en el fenotipo esperado para el gen diana por el investigador usando el protocol. </li></ol> 6. Pantalla de transmisión de la línea germinal Nota: A. mexicanus alcanzar la madurez sexual a los 4-8 meses. <ol><li> Cruzar los peces sexualmente maduros fundador de peces de tipo salvaje. </li><li> Embriones de pantalla o peces adultos usando métodos en los pasos 5.1-5.7 (Figura 4). Para peces adultos, un trozo de la cola se puede enganchar tras la anestesia. <ol><li> Anestesiar pescado sumergiendo pescado en una solución de tricaína (éster etílico del ácido 3-aminobenzoico) para reducir la tensión durante el recorte de la aleta. Tras corte de una aleta, permiten que los peces se recuperen en agua dulce. Los peces se recuperan con rapidez; observar hasta que se recuperen (normalmente son la natación). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Grandes avances se han hecho en los últimos años hacia la comprensión de la base genética de la evolución de los rasgos. Aunque se han identificado los genes candidatos que subyacen a la evolución de una serie de rasgos, se ha mantenido un reto para poner a prueba estos genes in vivo debido a la falta de maleabilidad genética de las especies evolutivamente más interesantes. Aquí mostramos un método para la edición del genoma de A. mexicanus, una especie usada para estudiar la evolución de los animales ...

La comprensión de la base genética de la evolución rasgo es un objetivo de investigación crítica de los biólogos evolutivos. Se ha logrado un progreso considerable en la identificación de loci que subyacen a la evolución de los rasgos y la localización de genes candidatos dentro de estos loci (por ejemplo 1-3). Sin embargo, las pruebas funcionalmente el papel de estos genes se ha mantenido desafiante como muchos organismos utilizados para el estudio de la evolución de los rasgos no son actualmente manejable de forma genética. El advenimiento de las tecnologías de edición genoma ha aumentado considerablemente manipulabilidad genética de una amplia gama de organismos. Nucleasas de transcripción activador de efectoras (Talens) y agrupados espaciadas regularmente repeticiones palindrómicas cortas (CRISPRs) se han utilizado para generar mutaciones específicas en los genes en un número de organismos (por ejemplo 4-11). Estas herramientas, aplicado en un sistema evolutivamente relevante, tienen el potencial de revolucionar la forma en que los biólogos evolutivos estudiar la base genética de la evolución. Astyanax mexicanus es una especie de pez que existe en dos formas: a. (Peces de superficie) que habitan en el río forma superficial y múltiples formas cavernícolas (cavefish) A. cavefish mexicanus evolucionó de ancestros de peces de superficie (revisado en 12). Las poblaciones de cavefish han desarrollado una serie de características, incluyendo la pérdida de los ojos, disminución o pérdida de la pigmentación, el número de papilas gustativas y neuromastos craneales, y los cambios de aumento en el comportamiento, tales como la pérdida de la conducta escolar, aumento de la agresividad, los cambios en la alimentación de la postura y la hiperfagia 13 -19. Cavefish y pescado superficie son interfértiles, y los experimentos de mapeo genético se han realizado para identificar loci y genes candidatos para los rasgos de la cueva 1,20-26. Algunos genes candidatos han sido probados para un papel funcional en la contribución a los rasgos de la cueva en el cultivo celular 1,19, en organismos modelo de otras especies de 21 o 27 por la sobreexpresión o una caída transitoria ucantar morfolinos 28 en A. mexicanus. Sin embargo, cada uno de estos métodos tiene limitaciones. La capacidad de generar alelos mutantes de estos genes en A. mexicanus es crítica para la comprensión de su función en la evolución de cavefish. Por lo tanto, A. mexicanus es un organismo candidato ideal para la aplicación de las tecnologías de edición genoma. Aquí describimos un método para la edición del genoma de A. mexicanus usando Talens. Este método se puede utilizar para evaluar mosaico inyectado peces fundador para fenotipos y para el aislamiento de líneas de pescado con mutaciones estables en los genes de interés 29.

<table><tbody><tr><td>Equipo</fuerte></td>Termociclador <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estación</td><td></td><td></td><td></td>de inyección</tr><tr><td>Aparato</td><td></td><td></td><td></td>de gel</tr><tr>Tirador <td></td><td></td><td></td>de<td>agujas</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td> Compañía</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Suministros</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nota: Hasta donde sabemos, se pueden utilizar suministros de diferentes compañías a menos que se indique</td><td></td><td></td><td></td>lo contrario</tr><tr><td>Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0</td><td>Addgene</td><td>Kit #1000000024</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents LB Agar, Miller (granulado)</td><td>Fisher</td><td>BP9724-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Medios de microbiología: LB Broth, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Teknova TET-15 en 50% de EtOH</td><td>Teknova (pedido a través de Fisher)</td><td>50-843-314</td><td></td></tr><tr><td>Espectinomicina Dihidroclorhidrato, Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP2957-1</td><td></td></tr><tr><td>Super Ampicillin (1,000x DNA</td> <td>Technologies</td><td>6060-1</td><td></td></tr><tr><td>ThermoScientific X-Gal Solution, Thermo</td><td>Sci Fermentas Inc listo para usar (pedido a través de Fisher)</td><td>FERR0941</td><td></td></tr><tr><td>IPTG, Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP1620-1</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Fisher 08-757-13</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BsaI</td><td>New England Biolabs (pedido a través de Fisher)</td><td>50-812-203</td><td>Use BsaI, no BsaI-HF (como se describe en el protocolo Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit)</td></tr><tr><td>BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>provisto de enzimas</td><td></td>de restricción</tr><tr><td>10x T4 tampón de ligasa</td><td>Promega (pedido a través de Fisher)</td><td>PR-C1263</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green Master mix</td><td>Promega (pedido a través de Fisher)</td><td>PRM7123</td><td>Se pueden usar otros Taq, pero la reacción debe ajustarse en consecuencia</td></tr><tr><td>Kit de ligadura rápida</td><td>New England Biolabs (pedido a través de Fisher)</td><td>50-811-728</td><td>Utilizamos Quick Ligase para todas las reacciones de ensamblaje de TALEN</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 E.coli químicamente competente</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-06</td> Se <td>pueden utilizar otras células químicamente competentes o células competentes caseras</td></tr><tr><td>Esp 3I</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (pedido a través de Fisher)</td><td>FERER0451</td><td></td></tr><tr><td>Epicentro de DNasa dependiente de ATP seguro para plásmidos</td><td>(pedido a través de Fisher)</td><td>NC9046399</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>El kit Qiagen debe utilizarse para la preparación inicial del plásmido (como se describe en el protocolo Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit)</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Kit de purificación</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>GeneMate LE Agaraose de disolución rápida</td><td>BioExpress</td><td>E-3119-125</td><td></td></tr><tr><td>Sac I</td><td>Promega (Pedido a través de Fisher)</td><td>PR-R6061</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T3 Kit de transcripción</td><td>Ambion</td><td>AM1348M</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy MinElute Kit de limpieza</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax-Gly Sample Loading Dye&nbsp;</td><td>Ambion (pedido a través de Fisher)</td><td>AM8551</td><td></td></tr><tr><td>Eliminase</td><td>Decon (pedido a través de Fisher)</td><td>04-355-32</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Vidrio desechable de soda-lima Pasteur Pipets</td><td>Fisher</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio estándar</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Microcaps</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotips Microloader Puntas para Microinyector Femtojet</td><td>Eppendorf (pedido a través de Fisher)</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Fisher</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr></tbody></table>

edición genoma en<em&gt; astyanax mexicanus</em&gt; uso de transcripción activador de efector nucleasas (talens)

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

La identificación de alelos de genes subyacentes al cambio evolutivo es esencial para entender cómo y por qué ocurre la evolución. Con este fin, gran parte del trabajo reciente se ha centrado en la identificación de genes candidatos para la evolución de rasgos en una variedad de especies. Sin embargo, hasta hace poco ha sido un reto validar funcionalmente genes candidatos interesantes. Las herramientas recientemente desarrolladas para la ingeniería genética permiten manipular genes específicos en una amplia gama de organismos. La aplicación de esta tecnología en organismos evolutivamente relevantes permitirá una visión sin precedentes del papel de los genes candidatos en la evolución. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) es una especie de pez con formas que habitan en la superficie y en cuevas. Múltiples líneas independientes de formas cavernícolas han evolucionado a partir de peces ancestrales de superficie, que son interfértiles entre sí y con los peces de superficie, lo que permite dilucidar la base genética de los rasgos de las cuevas. A. mexicanus se ha utilizado para una serie de estudios evolutivos, incluido el análisis de ligamiento para identificar genes candidatos responsables de una serie de rasgos. Por lo tanto, A. mexicanus es un sistema ideal para la aplicación de la edición del genoma para probar el papel de los genes candidatos. Aquí reportamos un método para usar nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción (TALENs) para mutar genes en A. mexicanus de superficie. La edición del genoma utilizando TALENs en A. mexicanus se ha utilizado para generar mutaciones en genes de pigmentación. Esta técnica también se puede utilizar para evaluar el papel de los genes candidatos para una serie de otros rasgos que han evolucionado en formas de cueva de A. mexicanus.

TALEN par inyecciones dan como resultado la unión de los RVDS a los nucleótidos de ADN específicas y por lo tanto la dimerización de los dominios de FokI, dando lugar a roturas de doble cadena 39 que pueden ser reparados a través de extremos no homólogos (NHEJ). NHEJ menudo introduce errores que resultan en inserciones o deleciones (indeles). Indeles pueden ser identificados mediante la amplificación de la región que rodea el sitio de destino TALEN y digerir el amplic...

mutagénesis gen de la orientación es ahora posible en una amplia gama de organismos utilizando técnicas de edición genoma. Aquí, demostramos un protocolo para la mutagénesis dirigida de genes usando activador de la transcripción como nucleasas efectoras (Talens) en Astyanax mexicanus, una especie de peces que incluye a los peces de superficie y cavefish.

Edición genoma en<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; Uso de transcripción activador de efector nucleasas (Talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

El objetivo general de este procedimiento es introducir mutaciones en genes específicos del pez de cueva Astyanax mexicanus. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología evolutiva sobre la base genética de la evolución de rasgos cavernícolas. La ventaja principal de esta técnica es que ahora se puede evaluar el efecto de la pérdida del gen específico en Astyanax mexicanus.Después de diseñar y ensamblar nucleasas tipo efectores activadores de la transcripción, o TALEN, según el protocolo descrito, utilice dos microlitros de Sac1 para digerir cuatro microgramos de una plantilla cuya secuencia haya sido verificada, a 37 grados Celsius durante dos horas. Sombre dos microlitros del plásmido digerido con Sac1 en un gel de agarosa al uno punto cinco por ciento y verifique la presencia de una sola banda para confirmar la digestión. Para llevar a cabo la producción de ARNm T tres, utilice cero punto cinco microgramos de plantilla linealizada para preparar reacciones medias siguiendo un protocolo estándar.Incubar a 37 grados Celsius durante dos horas. Luego, añadir cero punto cuatro microlitros de DNasa e incubar a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Después de purificar el ARNm, para comprobar la calidad, utilice un producto que elimine la contaminación por RNasas para limpiar el equipo de electroforesis en gel.Luego, prepare un gel al uno punto dos por ciento. Mezcle un microlitro de ARNm, cuatro microlitros de agua libre de nucleasas y cinco microlitros de colorante de carga con glicoxal. Incube las muestras a 50 grados Celsius durante 30 minutos.Luego centrifugar brevemente los tubos y colocarlos en hielo antes de correr el gel. Después de verificar la concentración del ARNm, preparar alícuotas antes de almacenar a menos 80 grados Celsius. Consultar el protocolo escrito para detalles adicionales.Después de preparar las agujas de inyección y las placas según el protocolo descrito, induzca la puesta de huevos en A.mexicanus sobrealimentando a los peces durante tres o cuatro días antes del apareamiento y coloque los peces en agua fresca. Eleve la temperatura del agua dos grados Fahrenheit hasta aproximadamente 76 grados Celsius. Cada 15 minutos, revise la presencia de huevos en la superficie del agua en la oscuridad y transfiéralos a recipientes de vidrio para evitar que se adhieran a la superficie.Se pueden obtener cientos de huevos de una sola pareja de peces de superficie. Bajo el microscopio, separen los huevos aislados y transfieran aquellos en la etapa de una sola célula al agua fresca del sistema. Carguen el ARNm diluido en la parte posterior de la aguja y desconecten la aguja de un microinyector.Luego, utilizando pinzas, rompa la aguja. Para calibrar la aguja, inyecte 10 veces y recoja la gota resultante en un microcapilar. La gota debe llenar un microcapilar desechable de uno por cien microlitros, 32 milímetros hasta cero punto cinco milímetros por inyección de uno punto cinco nanolitros.Ahora, inserte la aguja en la célula individual e inyecte el ARNm. Recoja los embriones inyectados en recipientes de vidrio e incúbelos a 23-25 grados Celsius. Retire regularmente los embriones muertos durante los primeros días posteriores a la inyección.Registre el número de embriones muertos y deformes procedentes de las placas de control sin inyección y de las placas inyectadas. Consulte el protocolo escrito para obtener más detalles. Después de sacrificar los peces según el protocolo del IACUC de su institución, para extraer el ADN, recoja los embriones en 100 microlitros de hidróxido de sodio 50 milimolar e incube a 95 grados Celsius durante 30 minutos.Luego, enfríe a cuatro grados Celsius. Añada un volumen de una décima parte de tris HCl uno molar pH 8 a los embriones enfriados. A continuación, realice la PCR utilizando cebadores, por ejemplo para el gen albinismo oculocutáneo dos o OCA2.Para embriones individuales, un microlitro de ADN es suficiente para la reacción de PCR. Para genotipificar el locus OCA2, utilice la enzima de restricción DSR1 para digerir el producto de PCR resultante, agregando cero punto cinco microlitros de enzima directamente a doce punto cinco microlitros de la reacción de PCR completada. Después de incubar a 65 grados Celsius durante dos horas, realice la reacción y una muestra del producto de PCR no digerido en un gel de agarosa al uno punto cinco por ciento.Realice análisis adicionales según el protocolo descrito en el texto. Las inyecciones de TALEN pueden provocar roturas en la cadena doble de ADN que pueden repararse mediante la unión de extremos no homólogos, pero que también pueden introducir inserciones o deleciones, o INDELs. Mediante la digestión con enzimas de restricción en los extremos de la región espaciadora de TALEN, los INDELs pueden identificarse por la presencia de una banda resistente a la enzima de restricción.Las inyecciones de TALEN pueden producir mutaciones génicas bialélicas en A.mexicanus, por lo que algunos fenotipos pueden evaluarse en peces fundadores. Por ejemplo, se evaluó OCA2, el gen cuya hipótesis indica que es responsable del albinismo en los peces de cueva. Como se muestra aquí, se identificaron parches albinos en peces inyectados con TALEN dirigidos contra OCA2 que no estaban presentes en peces no inyectados.En esta imagen de gel, se examinaron productos de PCR de 306 pares de bases del exón nueve de OCA2 de A.mexicanus, para detectar la pérdida del sitio de la enzima de restricción en grupos de 10 peces F1 procedentes de un pez fundador inyectado. El amplicón de un embrión control fue digerido, mientras que una porción del amplicón resultó resistente a la digestión con enzima de restricción en los embriones F1 procedentes de peces inyectados. Además, se ha demostrado que las bandas resistentes a la digestión con enzima de restricción contienen INDELs.Una vez dominadas, estas inyecciones pueden realizarse en menos de unas pocas horas si se realizan adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar trabajar cuidadosamente con el ARN para prevenir su degradación y realizar las inyecciones durante la etapa de una sola célula. Tras seguir este procedimiento, se puede realizar un análisis fenotípico para responder preguntas adicionales, como si un gen particular es responsable de un fenotipo clave en peces cuando está mutado en peces de superficie.Esta técnica allanará el camino para que los investigadores en el campo de la biología evolutiva caractericen el papel de genes candidatos en la evolución del pez ciego Astyanax mexicanus. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inyectar embriones de Astyanax mexicanus con ARNm de TALEN.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video demuestra una técnica de edición del genoma basada en nucleasas de dedos de zinc en células madre pluripotentes humanas (hPSCs). Dado que las hPSC pueden diferenciarse potencialmente en varios tipos de células, esta tecnología es útil para estudios patológicos y farmacológicos in vitro de manera específica para cada paciente.

Edición del genoma basada en nucleasa de dedos de zinc: una técnica para modificar el genoma en células madre pluripotentes humanas mediante un mecanismo de reparación dependiente de la homología de doble cadena

Nucleasas de diseñadores como nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) y transcripción nucleasas efectoras del tipo activador (Talens) se pueden utilizar para modificar el genoma de preimplantación de embriones de ratones mediante la activación de ambos al final no homóloga (NHEJ) y recombinación homóloga (HR) itinerarios. Estos avances permiten la rápida generación de ratones con modificaciones genéticas precisas.

Del genoma del ratón Ingeniería Utilizando Nucleasas Designer

Manipulaciones transgénicas y la edición del genoma son críticos para probar funcionalmente las funciones de los genes y elementos cis-regulador. Aquí se presenta un protocolo de microinyección detallado para la generación de modificaciones genómicas (incluyendo construcciones mediadas por Tol2 fluorescentes transgén reportero, Talens, y CRISPRs) para el modelo emergente de pescado, el espinoso de tres espinas.

La microinyección de transgénesis y Genoma edición en tres espinas espinosos

Utilizando un Cas9 Confecciones complejo de ribonucleoproteína (RNP) es un método eficaz para la edición del genoma exacto, eficiente. Aquí, podemos destacar su utilidad en una amplia gama de células y organismos, incluyendo las células humanas primarias y ambos clásicos y emergentes en organismos modelo.

Mayor genoma edición con Cas9 ribonucleoproteína en diversas células y organismos

Se describen métodos para la manipulación de genes en el sistema del modelo evolutivo Astyanax mexicanus. Se describen tres técnicas diferentes: transgénesis mediada de Tol2, manipulación dirigida del genoma utilizando CRISPR/Cas9 y caída de expresión usando morfolinos. Estas herramientas deben facilitar la investigación directa de los genes subyacentes a la variación entre las formas de la superficie y cavernas.

Manipulación de la función del Gene en mexicano Cavefish

Aquí se presenta un protocolo para realizar el desomo genético con tiempo y espacio restringido en las médulas espinales de axolotl inyectando el complejo CAS9-gRNA en el canal central de la médula espinal seguido de electroporación.

Desmontaje genético directo de las células madre neurales de la médula espinal de Axolotl a través de la electroporación de los complejos de proteína-gRNA CAS9

El objetivo de este protocolo es permitir la edición CRISPR/Cas9 sin fisuras del genoma de C. elegans utilizando complejos de ribonucleoproteína ensamblados y el marcador co-CRISPR dpy-10 para el cribado. Este protocolo se puede utilizar para realizar una variedad de modificaciones genéticas en C. elegans, incluidas inserciones, deleciones, reemplazos de genes y sustituciones de codones.

CRISPR/Cas9 Edición del gen C. elegans rbm-3.2 utilizando el marcador de detección co-CRISPR dpy-10 y complejos de ribonucleoproteína ensamblados.

Este protocolo describe cómo realizar una edición eficiente de la base de adenina sin limitación de PAM para construir un modelo preciso de la enfermedad del pez cebra utilizando zSpRY-ABE8e.

Edición de base eficiente sin PAM para el modelado de peces cebra de enfermedades genéticas humanas con zSpRY-ABE8e

La eficiencia del método de edición mejorada del genoma mediante la administración de ácidos nucleicos oviductales (I-GONAD) es comparable a la microinyección tradicional, que requiere la recolección de cigotos de hembras donantes y la transferencia a hembras pseudoembarazadas. Este protocolo demuestra su eficacia mediante la introducción de mutaciones inducidas por CRISPR/Cas9 en el locus ROSA26 en el cromosoma 6.

Edición mejorada del genoma a través de la técnica de electroporación in vivo basada en la administración de ácidos nucleicos oviductales para la generación de ratones knockout

La entrega de editores genómicos como ARN es un medio particularmente potente para modificar los genomas de las células y líneas celulares primarias de mamíferos. El objetivo de este protocolo es entregar editores genómicos como ARNm a células y líneas celulares primarias de mamíferos, seguido de secuenciación y análisis dirigidos de Illumina para cuantificar los resultados de edición.

Edición genómica en células primarias de mamíferos mediante electroporación del ARN editor

Aprende a realizar edición genómica con TALENs en Astyanax mexicanus para estudiar la base genética de adaptaciones cavernícolas. Este método permite investigar la función de genes específicos en la evolución de rasgos de peces de cueva.

Edición genoma en

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