Name: Un régimen del fenotipo de ratones genéticamente modificados empleadas para el estudio genes implicados en enfermedades humanas de envejecimiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Aprende un régimen de fenotipado en ratones modificados genéticamente para estudiar genes relacionados con enfermedades neurodegenerativas humanas como el Parkinson. Este método permite evaluar fuerza muscular y defectos neurológicos de forma sencilla.

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Los fondos para esta investigación provino de la Fundación Médica Adelfa y el Fondo de Investigación del Decano Facultad de Medicina de la Universidad de Yale (JH). Agradecemos al Dr. Koenig Claire para obtener ayuda con los experimentos de comportamiento. Genéticamente líneas de ratón diseñado se generaron en Ozgene (Perth, Australia).

Ética declaración: Los estudios con animales se realizaron de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud en las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Yale. 1. Ensayo de comportamiento de los ratones modificados genéticamente Nota: Todos los ratones deben ser sometidos al mismo régimen de pruebas para limitar las diferencias en la habituación a la manipulación. Las pruebas deben realizarse a la misma hora del día cada vez. <ol><li> Neonatal Hind prueba Limb Nota: La prueba del miembro posterior se lleva a cabo todos los días de día postnatal (P) 4 a P10 para evaluar la fuerza muscular de las extremidades posteriores proximal, debilidad y fatiga. <ol><li> los ratones de transporte a la zona de pruebas y dejar reposar durante 30 minutos antes de la prueba. </li><li> Preparar aparato de ensayo por la limpieza de un 50 ml tubo cónico con 70% de etanol, empujando dos (P8-P4) o un (P9-P10) bolas de algodón para la parte inferior de la tUbe y asegurar en una posición vertical. </li><li> Retirar una cría a partir del peso de la jaula y registro. Mantenga las crías en que sostiene la bandeja en la almohadilla de calor cada vez que no probar. </li><li> suspender suavemente las extremidades posteriores del recién nacido por encima del borde del tubo cónico, de modo que esté orientada hacia abajo hacia las bolas de algodón. Contar el número de intentos de tracción realizados y medida de latencia para caer usando un cronómetro. </li><li> Repetir una vez más y luego etiquetar el cachorro con marcador. Después, identificar las crías P6 por el recorte del dedo del pie. Frotar suavemente con crías de las camas jaula antes de reemplazar. </li><li> Limpiar tubo cónico con 70% de etanol. </li><li> Repetir la prueba en el próximo cachorro hasta que toda la camada ha sido probado. </li><li> Disponer de bola de algodón y tubo cónico. Limpiar todo el equipo con un 70% de etanol. </li></ol></li><li> Prueba de Observación Destetado Nota: La prueba de observación del destete se administra todos los días de P19 a P21 para anotar los niveles de movimiento y la actividad general. <ol><li> los ratones de transporte a una zona de pruebasnd dejar reposar durante 30 minutos antes de la prueba. </li><li> Preparar cuadro de pruebas de plexiglás marcada con una cuadrícula de 6x6 de 2 cuadrados pulgadas en la base por la limpieza con 70% de etanol. Configurar un equipo de vídeo a un lado de tal manera que toda la caja está en el campo de visión. Mantenga el equipo y los alrededores de la misma cada día para evitar la introducción de novedad. </li><li> Retire un niño destetado de la jaula y colocar en una taza limpia de retención. Registrar el peso. </li><li> Iniciar la grabación de vídeo por el rodaje de la tarjeta de identificación de la prueba, con el número de identificación del ratón, la edad y la fecha de la prueba. Transferir el ratón que sostiene la taza de la plaza del centro. Tiempo durante tres minutos, contando el número de líneas atravesadas por las dos patas delanteras del ratón durante la prueba. </li><li> Volver ratón a una grabación de vídeo jaula y limpieza final. </li><li> Limpiar el aparato de ensayo con 70% de etanol. </li><li> Repita hasta que toda la basura se prueba, a continuación, devolver todos los cachorros a la jaula. </li><li> Limpiar todo el equipo de prueba con un 70% de etanol. </li><li&gt; Uso de los videos, cuantificar el número de eventos por medio del conteo de crianza después de la observación visual, donde un ratón se coloca con ambas patas delanteras claras de apoyo, y la preparación de eventos, donde ambas patas delanteras se dedican a la limpieza. </li></ol></li><li> Alambre de malla prueba la fuerza de agarre Nota: La prueba de la fuerza de prensión se lleva a cabo en días alternos entre P22 y P26, para evaluar la fuerza neuromuscular. <ol><li> los ratones de transporte al área de prueba y dejar reposar en la jaula durante 30 minutos antes de la prueba. </li><li> Preparar aparato de limpieza por una caja y acoplamiento de la rejilla de plexiglás con 70% de etanol. Coloque el plástico de burbujas en la parte inferior de la caja y cubrir con papel. </li><li> ratones separados en grupos de tres, poniendo en tazas individuales de cartera. </li><li> Colocar primero ratón en el centro de la malla de alambre y lentamente invertir 10-20 cm por encima de la superficie suave en la parte inferior de la caja de plexiglás. Medir la latencia a caer usando un cronómetro. Terminar la prueba después de haber transcurrido 60 segundos si el ratón no lo haceotoño. </li><li> Volver ratón para sujeción de copa, limpie la malla con un 70% de etanol y reemplazar el papel sobre el plástico de burbujas. Llevar a cabo la prueba en los dos ratones restantes en el grupo antes de regresar a la primera. Repita hasta que cada ratón se ha puesto a prueba un total de tres veces. </li><li> Devolver al grupo a una jaula limpia y continuar con el resto de grupos. Si hay menos de tres ratones en cualquier grupo, asegúrese de que se permite un intervalo de recuperación entre ensayos 5 min. </li><li> Devolver todos los ratones de la jaula de alojamiento, a disponer de papel y equipos de prueba limpia con un 70% de etanol. </li></ol></li></ol> 2. Examen de la estructura de la retina <ol><li> Anestesiar los animales en P30-35 por inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg). Evaluar la profundidad de la anestesia pellizcando la almohadilla plantar y proceder sólo en la ausencia de una respuesta, de acuerdo con las directrices del IACUC. Perfusión con PFA al 4% / PBS 48. </li><li> Para eliminar los ojos, limpiar la piel en la incisión SIde TE con 70% de etanol, antes de cortar a través de la piel en la base del cráneo. Pelar la piel para exponer el cráneo y limpio, con un 70% de etanol. El uso de instrumentos limpios, cortar cuidadosamente a través del cráneo para llegar a las cuencas de los ojos y exponer los ojos. Cortar el nervio óptico, retire suavemente el ojo de la toma y enjuague en PBS. </li><li> Fijar los ojos en 4% PFA / PBS durante 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Coloque los ojos en una pequeña placa de Petri que contiene PBS. Hacer una pequeña incisión en el centro de la córnea utilizando tijeras de eliminación de puntadas. Retire la córnea cortando el borde entre la córnea y la esclerótica. El uso de fórceps para extraer el iris. Por último, pelar las capas de RPE, dejando intacta la retina y el cristalino en su lugar. Nota: El PFA / PBS fijación 4% causará desprendimiento de RPE que permite la RPE a ser fácilmente pelado desde el exterior de la retina. </li><li> Re-fix en 4% PFA / 30% sacarosa / PBS durante 15 min a temperatura ambiente antes de volver el ojo a una placa de Petri que contiene PBS. Tire de la lens utilizando pinzas, con lo que el cuerpo vítreo junto con él. </li><li> Cryoprotect en sacarosa al 30% durante la noche a 4 ° C. </li><li> los ojos de la capa en el compuesto óptimo de corte de temperatura (OCT) y la transferencia a un molde de inclusión que contiene frescos PTU. Oriente el ojo de tal manera que el plano sagital es paralelo con la cara de corte, utilizando como pocos movimientos como sea posible y evitando la introducción de burbujas de aire. Flash congelación por inmersión del molde en un baño de hielo seco / etanol. bloques almacenar a -80 ° C. </li><li> El uso de un criostato, cortar 20 micras secciones sagitales y recoger en portaobjetos ya lavadas. </li><li> Secciones se tiñen con hematoxilina y eosina de acuerdo con protocolos estándar 49. Imagen utilizando un microscopio óptico equipado para microscopía de campo claro. </li></ol> 3. La tinción histoquímica <ol><li> Preparación de la muestra <ol><li> La eutanasia a los animales en P30-35 usando sobredosis de isoflurano (30% en propilenglicol) a través de la inhalación gota abierta. Evaluar la eutanasia por el cesede la respiración, los latidos del corazón y la falta de respuesta a pellizcar la almohadilla plantar. Confirmar la muerte por dislocación cervical y la extracción de órganos, de acuerdo con las directrices del IACUC. </li><li> Para retirar el cerebro, limpiar la piel en el sitio de la incisión con 70% de etanol, antes de cortar a través de la piel en la base del cráneo. Pelar la piel para exponer el cráneo y limpio, con un 70% de etanol. El uso de instrumentos limpios, cuidadosamente cortados a través del cráneo y retirar para exponer el cerebro. Retire las membranas, y retire con cuidado el cerebro de la cavidad del cráneo. Enjuague en PBS. </li><li> Escudo. El cerebro en OCT y la transferencia a un molde de inclusión que contiene frescos octubre Oriente el cerebro de tal modo que el plano sagital es paralelo con la cara de corte, utilizando como pocos movimientos como sea posible y evitando la introducción de burbujas de aire. Flash de congelación por inmersión del molde en un baño de hielo seco / etanol y se almacena a -80 ° C. </li><li> El uso de un criostato, cortar 10 micras secciones sagitales y recoger en portaobjetos ya lavadas. </li></ol></li> &lt;li&gt; NADH diaforasa tinción <ol><li> Preparar tampón de 0,05 M Tris, pH 7,6 mediante la disolución de 5,72 g de Tris-HCl y 1,66 g de base Tris en agua 1L-desionizada. Almacenar a 4 ° C durante un máximo de seis semanas. </li><li> Preparar la solución de NADH (NADH 2,25 mM en tampón Tris 0,05 M). Alícuota y almacenar a -20 ° C. </li><li> Preparar la solución de NBT (2,5 mM nitro-azul de tetrazolio en tampón Tris 0,05 M). Almacenar a 4 ° C durante hasta seis semanas en una botella de vidrio. </li><li> Combinar volúmenes iguales de solución de NADH y solución de NBT para hacer solución de tinción y añadir 1 ml de cada diapositiva. Incubar a 37 ° C en una cámara humidificada durante 30 min. </li><li> Solución de tinción Aspirar y lavar tres veces con dH2O </li><li> Lavar tres veces cada uno en orden ascendente y descendente concentraciones de acetona / dH 2 0 (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) durante 2 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Enjuague tres veces en dH 2 O y montar las secciones con un medio acuoso. Imagen utilizando un microscopio óptico equipado para f brillanteLa microscopía ield. La tinción con azul corresponde a la actividad enzimática. </li></ol></li><li> La tinción histoquímica la succinato deshidrogenasa <ol><li> Preparar 0,2 M de fosfato de sodio monobásico / dH 2 O y 0,2 M de fosfato de sodio dibásico / dH2O </li><li> Hacer tampón de 0,2 M fosfato, pH 7,6 mediante la combinación de 3 partes de fosfato monobásico con fosfato dibásico de 20 partes de sodio. </li><li> Preparar la solución de tinción (succinato de sodio 0,1 M, 1,25 M NBT en tampón fosfato 0,2 M) y se añade 1 ml a cada diapositiva. Incubar a 37 ° C en una cámara humidificada durante 60 minutos. </li><li> Solución de tinción Aspirar y lavar tres veces en dH 2 O. </li><li> Lavar tres veces cada uno en orden ascendente y descendente concentraciones de acetona / dH 2 O (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) durante 2 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Enjuague tres veces en dH 2 O y montar las secciones con un medio acuoso. Imagen utilizando un microscopio óptico equipado para microscopía de campo claro. La tinción con azul corresponde a la norma ENzymatic actividad. </li></ol></li></ol>

Los autores no tienen intereses contrapuestos que divulgar.

Se necesitan tratamientos robustos para limitar el impacto de las condiciones relacionadas con el envejecimiento humano debilitante, pero sigue siendo difícil para muchas condiciones. Para identificar posibles dianas terapéuticas y desarrollar estrategias de intervención, las causas y la patología de las enfermedades asociadas con el envejecimiento primero deben ser entendidos. No todos los ratones modificados genéticamente inmediatamente presentes con fenotipos claros que están relacionados con la enfermedad de interés...

enfermedades asociados con la edad son cada vez más frecuentes en la sociedad moderna. A medida que la ciencia médica mejora y aumenta la esperanza de vida, la población continúa envejeciendo y la carga de estas enfermedades crece. Los tratamientos eficaces son necesarias para disminuir el impacto de enfermedades debilitantes, pero sigue siendo difícil en muchos casos. Sólo mediante la comprensión de las causas y la patología de las enfermedades asociadas con el envejecimiento pueden los científicos comenzar a identificar posibles dianas terapéuticas y desarrollar estrategias de intervención. Las condiciones comunes relacionadas con la edad incluyen trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Parkinson (EP) y la degeneración macular asociada a la edad (DMAE). PD es el trastorno del movimiento más común causada por neurodegeneración en los seres humanos. La mayoría de los pacientes con EP muestran síntomas como temblor en reposo, bradicinesia y rigidez después de 50 años de edad. El inicio temprano también se ha observado en aproximadamente el 10% de los casos. La DMAE es la principal causa de ceguera enlos ancianos, dañando progresivamente fotorreceptores y el epitelio pigmentario de la retina (EPR) en el ojo. La visión central se ve afectada pero la visión periférica es generalmente no afectado. Hay dos formas de DMAE. En la forma &quot;seca&quot;, los depósitos de proteínas extracelulares conocidas como forma de drusas entre el EPR y la membrana de Bruch (BM), que conduce a la atrofia geográfica y la difuminación de la visión central. Los resultados más graves forma &quot;húmeda&quot; de la neovascularización de la coroides a través de BM en las capas del EPR y fotorreceptoras y pueden conducir a hamorrhaging debajo de la retina que causa daño permanente al tejido de la retina. Genoma estudios de asociación de ancho han identificado previamente loci que están asociadas con una mayor susceptibilidad a esta enfermedad y identificó dos regiones de interés: el factor H del complemento (CFH) en el cromosoma 1 y la 10q26 locus, donde la maculopatía susceptibilidad relacionada con la edad 2 (ARMS2) y alta temperatura factor de requerimiento A1 (HTRA1) los genes se encuentran 1-5 </sup&gt;. Las combinaciones de estos alelos aumentan la probabilidad de AMD de una manera dependiente de la dosis y SNPs específicos se pueden asociar preferentemente con cualquiera de las formas húmedas o secas de AMD 3-6. CFH actúa como un regulador negativo de la vía alternativa (AP) del sistema del complemento mediante la inhibición de la activación de C3. Un polimorfismo de nucleótido único (SNP) se ha relacionado con un mayor riesgo de AMD, causando intercambio de tirosina 402 en el exón 9 con histidina debido a una T a C sustitución 1. En AMD se cree que el AP es misregulated debido a una pérdida de la función de CFH pero si el SNP juega un papel causal no está claro. Una hipótesis es que la histidina cargada positivamente se piensa para negar la posibilidad de CFH para unirse a las proteínas que interactúan proteína C reactiva y el sulfato de heparina 1,7. Los estudios in vitro de CFH Y402H proporcionan resultados contradictorios sobre diferencias funcionales entre las variantes, y en vivo en el trabajo &lt;em&gt; Cfh - / - ratones que expresan humanizado CFH está en curso 8. ARMS2 se encuentra aguas arriba de HtrA1 en el genoma de los primates, aunque el gen está ausente en los ratones. HtrA1 es una serina proteasa, pero ARMS2 está mal caracterizada. El desequilibrio de ligamiento entre los SNPs en el locus asociado a AMD ha hecho que sea difícil determinar las contribuciones al riesgo de mutaciones individuales de los genes en esta región, pero trabajos recientes han sugerido que es la sobreexpresión de HtrA1 en lugar de ARMS2 que conduce a la neovascularización y depósitos de proteínas subretinianas 9-11. Sin embargo, la proximidad de los genes en este locus puede permitir interacciones que no pueden ser estudiados utilizando transgenes insertados aleatoriamente. Además de AMD, la familia HtrA de serina proteasas se ha asociado con muchas enfermedades humanas. Todas las proteínas HtrA contienen un dominio de serina proteasa seguido por al menos un dominio PDZ C-terminal. HtrA1, HtrA3 y HtrA4 comparten el grhomología comieres, que consta de un dominio de péptido señal, la unión del factor de crecimiento similar a la insulina, un inhibidor de la proteasa de dominio Kazal, el dominio de serina proteasa y un dominio PDZ. HtrA2 tiene un extremo N-terminal diferente, compuesta de una secuencia de localización mitocondrial, dominio transmembrana y el inhibidor de dominio de unión a la apoptosis seguido por los dominios de la proteasa y PDZ 12-16. HtrA1 mamíferos está regulado por la remodelación inducido por el sustrato en el sitio activo de su dominio de proteasa 17-20, y HtrA2 también puede ser modulada por la interacción entre la serina proteasa y dominios PDZ que suprime la actividad de la proteasa 21. Curiosamente, el dominio PDZ no parece conferir regulación similar a HtrA3 16. Las proteasas HtrA también pueden ser reguladas por factores extrínsecos: se ha demostrado recientemente que existe una interacción entre regulador HtrA1 y protoporfirinas 22 y HtrA2 pueden ser reguladas por la fosforilación tras la activación de la p38 MAP quinasavía de una manera dependiente de PINK1 23. La supresión de los miembros individuales de la familia HtrA en ratones se ha documentado, sin embargo efectos mecanicistas sobre todo no están claros en parte debido a la falta de fenotipos visibles. HtrA1 desempeña una función importante en el control de calidad de proteínas y su regulación deficiente o mutación se ha asociado con muchas enfermedades humanas diferentes, incluyendo la artritis, el cáncer y un mayor riesgo de AMD 3,4,24-32. La pérdida de función HtrA2 en los tejidos neuronales se ha asociado con fenotipos PD en los seres humanos y los ratones, mientras que su pérdida a partir de tejidos no neurales resultados en envejecimiento acelerado 33-37. Desregulación HtrA3 se ha asociado con enfermedades que incluyen preeclampsia y ciertos tipos de cáncer 38,39. Sobre regulación de HtrA4 se ha observado en las placentas de pacientes con preeclampsia, pero los ratones knockout no muestran un fenotipo abierta 40,41. La falta de fenotipos observados en algunos ratones knockout ha sidopostula que ser el resultado de la compensación entre el miembro de la familia HtrA: se cree que tanto HtrA4 y HtrA1 interactuar con la familia TGF-B de las proteínas, lo que permite la compensación por HtrA1 a la supresión de HtrA4 41. Del mismo modo, se piensa que desde HtrA1 y HtrA3 tienen un alto grado de homología de dominio que podrían tener funciones complementarias 42. Sin embargo, se ha sugerido que las proteínas HtrA pueden tener papeles parcialmente antagónicos, compitiendo para regular objetivos comunes 43. Para investigar más a fondo estos factores de riesgo se generaron tres líneas de ratones humanizados knock-in. En Cfh TM1 (CFH * 9) jhoh y TM2 Cfh (CFH * 9) jhoh, el exón 9 del gen Cfh se sustituye con el exón 9 del homólogo humano. TM1 Cfh (CFH * 9) jhoh codifica la tirosina no enfermedad asociada resto en la posición 402, mientras que Cfh TM2 (CFH * 9) jhoh lleva el Y402H, SNP riesgo asociado. EnARMS2 tm1jhoh la secuencia ARMS2 humana fue dirigida a una región aguas arriba de HtrA1. Una secuencia de parada loxP-flanqueado colocado aguas arriba de la secuencia del gen, pero aguas abajo del promotor UBIC incluido se escindió mediante el cruce de ratones OzCre, que expresan la recombinasa Cre bajo el control del promotor de Rosa26, como se describió anteriormente 34. Además de estos knock-in líneas, se generaron alelos knockout condicional para Cfh y HtrA1 (Cfh tm1jhoh y tm1jhoh HtrA1), así como los demás miembros de la familia HtrA conocidos: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (tm1jhoh HtrA3) y HtrA4 ( tm1jhoh HtrA4). Los agujeros ciegos de la línea germinal se crearon mediante el cruce de ratones OzCre a animales modificados para flanquear exones específicos con sitios loxP, tales que la supresión provoca un cambio de marco y / o supresión del dominio activo (Cfh; exón 3, HtrA1; exones 2-3, HtrA2: exones 2-4, HtrA3; exón 3, HtrA4; exones 4-6) 34,41. Una deleción neural de HtrA2, elimina el uso de la recombinasa Cre bajo el control del promotor de nestina (HtrA2 flox; Tg (Nes-cre) 1Kln / J), también se ha descrito 34. Sólo los ratones que carecen de HtrA2, sistémica o en los tejidos neuronales, muestran fenotipos claros, que presentan fenotipos parkinsonianos. Dado que algunos de estos genes de interés se postulan para ser localizado en las mitocondrias 11,44-47, y la supresión de HtrA2 generó fenotipos parkinsonianos, un régimen de fenotipificación con un enfoque mitocondrial y neurológico se describen aquí y se proporcionan resultados representativos de las pruebas de interés . Con el fin de examinar ratones genéticamente modificados producidos para investigar humano, la enfermedad relacionada con la edad a fondo y sistemáticamente se estableció un programa inicial fenotipificación, que consiste en una serie de pruebas relacionadas con los dos principalesenfermedades de interés: AMD y el Parkinson.

<table><tbody><tr><td>Etanol</td><td>Decon (Fisher Scientific)</td><td>435541</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>1443222</td><td></td></tr><tr><td>bolas de algodón</td> Walmart <td></td> estera térmica Sunbeam <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>0000756-500-000</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de retención (bandeja de cubitos de hielo)</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cronómetro electrónico</td><td>GOGO</td><td>PC396</td><td></td></tr><tr><td>Caja de plexiglás</td><td>construida en taller</td><td></td><td>de 12" por 12"&nbsp;</td></tr><tr><td>Videocámara Vixia HF R400</td><td>Canon</td><td>8155B004</td><td></td></tr><tr><td>9 oz Tazas transparentes</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Malla de alambre de 1/4 de pulgada</td><td>Home Depot</td><td>204331884 (en línea) / 554219 (en tienda)</td><td>12" por 12"&nbsp;</td></tr><tr><td>Plástico de burbujas</td><td>VWR</td><td>470092-416</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de muestra recta</td><td>VWR</td><td>82027-438</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de disección de punta fina</td><td>VWR</td><td>82027-408</td><td></td></tr><tr><td>Tijera fina</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>Solución de paraformaldehído al 16% Electrónica</td><td>Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>10x solución salina tamponada con fosfato pH 7,4</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072-04000</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>JT Baker</td><td>4072-01</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos superfrost</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td>solución de</tr><tr><td>tinción de hematoxilina</td><td>Fisher Scientific (Ricca)</td><td>353016</td><td></td></tr><tr><td>Eosina Y solución de tinción Fisher</td><td>Scientific (Ricca)</td><td>2845-32</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de Tris</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02000-01000</td><td></td></tr><tr><td>Dinucleótido de nicotinamida adenina, hidrato de sal disódica reducida</td><td>Sigma</td><td>N8129</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro azul de nitrotetrazolio</td><td>Sigma</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>JT Baker</td><td>9006-05</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico monohidratado</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico heptahidratado</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Succinato de sodio dibásico hexahidratado</td><td>Sigma</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount medio de montaje acuoso</td><td>Vector Labs</td><td>H-5501-60</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-M</td><td>60 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>Microscopio AxioImager A1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trípode de cámara</td><td>de vídeo Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperatura óptima de corte (OCT)</td><td>Fischer Scientific</td><td>23730571</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat Sectioning&nbsp; Máquina</td><td>Leica&nbsp;</td><td>CM1900</td><td>Descontinuado pero reemplazado por CM1950</td></tr></tbody></table>

un régimen del fenotipo de ratones genéticamente modificados empleadas para el estudio genes implicados en enfermedades humanas de envejecimiento

A Phenotyping Regimen for Genetically Modified Mice Used to Study Genes Implicated in Human Diseases of Aging

Las enfermedades relacionadas con la edad son cada vez más prevalentes y la carga continúa creciendo a medida que nuestra población envejece. Se necesitan tratamientos eficaces para disminuir el impacto de las afecciones debilitantes, pero en muchos casos siguen siendo difíciles de alcanzar. Solo mediante la comprensión de las causas y la patología de las enfermedades asociadas con el envejecimiento, los científicos pueden comenzar a identificar posibles objetivos terapéuticos y desarrollar estrategias de intervención. Las afecciones más comunes relacionadas con la edad son los trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Parkinson y la ceguera. La degeneración macular asociada a la edad (DMAE) es la principal causa de ceguera en los ancianos. Los estudios de asociación de genoma completo han identificado previamente loci que se asocian con una mayor susceptibilidad a esta enfermedad e identificado dos regiones de interés: el factor H del complemento (CFH) y el locus 10q26, donde se encuentran los genes de la susceptibilidad a la maculopatía relacionada con la edad 2 (ARMS2) y el factor A1 de requerimiento a alta temperatura (HtrA1). La CFH actúa como un regulador negativo de la vía alternativa (AP) del sistema del complemento, mientras que la HtrA1 es una serina proteasa extracelular. ARMS2 se encuentra aguas arriba de HtrA1 en el genoma de los primates, aunque el gen está ausente en los ratones. Para estudiar los efectos de estos genes, se generaron líneas de ratón knock-in humanizadas de Cfh y ARMS2, knockouts de Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 y HtrA4, así como una deleción neuronal condicional de HtrA2. De todos los ratones modificados genéticamente producidos, solo los ratones que carecían de HtrA2, ya sea sistémicamente o en los tejidos neurales, mostraron fenotipos claros. Con el fin de examinar a estos ratones de forma exhaustiva y sistemática, se estableció un primer programa de fenotipado, que consistió en una serie de pruebas relacionadas con dos enfermedades principales de interés: la DMAE y el Parkinson. Los ratones modificados genéticamente pueden ser sometidos a experimentos apropiados para identificar fenotipos que puedan estar relacionados con las enfermedades asociadas en humanos. Aquí se presenta un régimen de fenotipado con un enfoque mitocondrial junto con los resultados representativos de las pruebas de interés.

Esta sección describe ejemplos de los resultados que se pueden obtener usando estos métodos. En la prueba de las extremidades posteriores, el número de intentos de tracción hecha y la latencia para el otoño son sumados por dos pruebas consecutivas para cada día. Esta prueba puede ser utilizada para comparar genéticamente diferentes grupos para distinguir los ratones con reducida fuerza neuromuscular tm1jhoh HtrA2 (HtrA2 KO) ratones en la Figura 1A -. ...

Se presenta un enfoque de genética inversa para comprender las familias de genes asociadas con enfermedades humanas, utilizando el ratón como sistema modelo, y se describe el posterior programa de fenotipado del ratón. Debido a que los ratones defectuosos en un gen de interés, HtrA2, manifestaron síntomas parkinsonianos, el régimen de fenotipado se centra en la identificación de defectos neurológicos.

Un régimen del fenotipo de ratones genéticamente modificados empleadas para el estudio genes implicados en enfermedades humanas de envejecimiento

Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to ...

El objetivo general de este régimen de pruebas es establecer una serie de ensayos sencillos que puedan utilizarse como una tubería inicial de fenotipado para orientar investigaciones posteriores detalladas sobre fenotipos conductuales y la estructura y función de los tejidos. Si los fenotipos conductuales y celulares de las enfermedades humanas se recapitulan en el modelo murino. La principal ventaja de esta técnica es que las pruebas pueden realizarse en laboratorios sin experiencia previa en este tipo de experimentos, sin necesidad de inversiones significativas, y aun así proporcionar información útil para estudios posteriores más detallados.Realice la prueba de las extremidades posteriores diariamente desde el día cuatro hasta el día 10 postnatal para evaluar la fuerza, debilidad y fatiga de los músculos proximales de las extremidades posteriores. Para comenzar, permita que los ratones se aclimaten al área de prueba durante 30 minutos. Mientras tanto, prepare un tubo cónico nuevo de 500 mililitros lavándolo con etanol al 70 % y luego introduciendo una o dos bolitas de algodón en el fondo del tubo.Sujete este tubo en posición vertical para la prueba. Cuando no se esté realizando la prueba, mantenga a las crías con la madre para conservar su temperatura. Después de la aclimatación de media hora, retire una cría de la jaula y registre su peso.Luego, suspender suavemente al neonato por sus extremidades traseras sobre el borde del tubo, de modo que la cría quede mirando hacia el algodón. A continuación, contar el número de intentos de tracción realizados por la cría y medir su latencia para caer. Después de esperar 30 segundos, repetir la prueba.Después de la segunda prueba, etiquete la cría con un marcador. Luego, frote suavemente la cría con el material de cama de la jaula de cría y devuélvala a la madre. Dado que las crías más viejas de P8 no pueden marcarse, identifíquelas mediante corte en los dedos de los pies.Antes de pasar al siguiente cría, limpie el tubo de ensayo con etanol al 70 %. Aplique la prueba de observación de destete diariamente desde el día P19 hasta el P21 para evaluar el movimiento y los niveles generales de actividad. Comience permitiendo que los ratones se aclimaten al área de prueba durante 30 minutos.Mientras las crías se aclimatan, prepare la arena. Marque una caja de plexiglás para pruebas con una cuadrícula de seis por seis de cuadrados de dos pulgadas. Antes de usar la caja, límpiela con etanol al 70 %.Luego, coloque una cámara de video de manera que una vista lateral de toda la caja llene el campo de visión. Estandarice la apariencia del entorno para evitar introducir novedades. Antes de la prueba, transfiera la cría destetada a un vaso de contención limpio y registre su peso.Luego, comience la grabación de video. Primero, filme una tarjeta de identificación de prueba con el número de identificación del ratón, su edad y la fecha actual. Luego, transfiera el ratón desde la copa de contención hasta el cuadrado central.Durante tres minutos, cuente el número de líneas cruzadas por las dos patas delanteras. Después de tres minutos, devuelva el ratón a una jaula limpia y finalice la grabación de video. Entre cada prueba, limpie la caja con etanol al 70 %.A partir de los videos, cuente los eventos de erguidos, que se producen cuando un ratón se pone de pie con ambas patas delanteras separadas del soporte. También cuente los eventos de aseo, que ocurren cuando ambas patas delanteras están ocupadas en limpiarse. Realice la prueba de fuerza de agarre en días alternos entre los días P22 y P26 para evaluar la fuerza neuromuscular.Como es habitual, permita que los ratones tengan 30 minutos para adaptarse al área de prueba. El aparato de prueba es una caja de plexiglás con una rejilla de malla. Limpie ambos con etanol al 70 %.Luego, forre el fondo de la caja con una capa de papel de burbujas para amortiguar y cubra el papel de burbujas con papel para absorber las excreciones. Proceda a separar los ratones de prueba y colóquelos en tazas individuales. Ahora, coloque el primer ratón en el centro de la malla de alambre e invierta lentamente la malla a 10-20 centímetros por encima de la superficie blanda de la caja.Mida la latencia para caer o finalice la prueba después de 60 segundos, si el ratón no cae. Luego, regrese el primer ratón al recipiente de contención. Entre pruebas, limpie la malla con etanol al 70 % y reemplace el papel sobre la espuma protectora.Luego, realice la prueba en los otros dos ratones del grupo. Después de que cada ratón haya sido probado una vez, repita el proceso dos veces más para obtener tres ensayos por ratón. Si hay menos de tres ratones en un grupo, asegúrese de que haya un tiempo de recuperación entre ensayos de al menos cinco minutos.Para una tinción de diaforasa NADH, combine volúmenes iguales de solución de NADH recién preparada y solución de NBT recién preparada. Luego, agregue un mililitro de solución de tinción a cada portaobjetos e incube las preparaciones en una cámara humedecida a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Para una tinción de succinato deshidrogenasa, prepare una solución de succinato de sodio 0,1 molar, NBT 1,25 molar y tampón fosfato 0,2 molar.Luego, agregue un mililitro a cada portaobjetos. Coloque los portaobjetos en una cámara humidificada e incube durante una hora a 37 grados Celsius. Después de la incubación con cualquiera de los colorantes, aspire la solución de tinción y lave los portaobjetos tres veces con agua destilada.Luego, lave las laminillas mediante una serie de baños de acetona cuya concentración aumenta y luego disminuye. Con cada concentración de acetona, realice tres lavados durante dos minutos por lavado. Por último, enjuague las laminillas tres veces con agua destilada.Luego, monte los portaobjetos con un medio acuoso. Se examinaron ratones sin expresión de HTRA2 utilizando la batería descrita de pruebas y se compararon con controles de camada. No se observó ningún cambio en el número de tracciones ni en la latencia para caer entre P4 y P6. Entre P7 y P10, se observó una reducción en la fuerza neuromuscular.En la prueba de actividad, se observó una actividad reducida en los ratones knockout de HTRA2. Los ratones knockout de HTRA2 también mostraron una reducción en la fuerza en la prueba de agarre en malla metálica. Las tinciones de H y E muestran que los ratones knockout de HTRA2 no presentaron cambios aparentes en la estructura retiniana en comparación con los controles en el día P35.Finalmente, se utilizó la tinción histoquímica para la actividad del complejo de la cadena de transporte de electrones con el fin de identificar cambios en las funciones de las enzimas respiratorias. Se observó una tinción disminuida en los ratones knockout de HTRA2 en comparación con los controles. Esto se notó en el cerebelo y el estriado, pero no en la corteza.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la actividad y la fuerza neuromuscular de ratones modificados genéticamente, así como de cómo combinar estos estudios con ejes celulares. Gracias por verlo y mucha suerte con sus experimentos.

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