Un régimen del fenotipo de ratones genéticamente modificados empleadas para el estudio genes implicados en enfermedades humanas de envejecimiento

El objetivo general de este régimen de pruebas es establecer una serie de pruebas simples que se puedan utilizar como una línea inicial de fenotipado para dirigir investigaciones detalladas posteriores sobre los fenotipos de comportamiento y la estructura y función de los tejidos. Si los fenotipos conductuales y celulares de las enfermedades humanas se recapitulan en el modelo de ratón. La principal ventaja de esta técnica es que las pruebas se pueden realizar en laboratorios sin experiencia previa en este tipo de experimentos sin una inversión significativa, pero aún así con estudios más detallados.

Realice la prueba de las extremidades traseras diariamente desde el cuarto día hasta el 10 después del parto para evaluar la fuerza, la debilidad y la fatiga de los músculos proximales de las extremidades traseras. Para comenzar, deje que los ratones se aclimaten al área de prueba durante 30 minutos. Mientras tanto, prepare un nuevo tubo cónico de 500 mililitros lavándolo con etanol al 70% y luego empujando una o dos bolas de algodón en el fondo del tubo.

Asegure este tubo en posición vertical para la prueba. Cuando no estén siendo examinados, mantenga a los cachorros con la madre para mantener su temperatura. Después de la aclimatación de media hora, saque a un cachorro de la jaula y registre su peso.

A continuación, suspenda suavemente al neonato por sus extremidades traseras sobre el borde del tubo, de modo que el cachorro quede frente al algodón. A continuación, cuente el número de intentos de extracción realizados por el cachorro y mida su latencia para caer. Después de esperar 30 segundos, repita la prueba.

Después de la segunda prueba, etiquete al cachorro con un marcador. Luego, frote suavemente al cachorro con ropa de cama de la jaula de la casa y devuélvalo a la madre. Debido a que los cachorros P8 mayores no se pueden marcar, identifíquelos con un corte en el dedo del pie.

Antes de pasar al siguiente cachorro, limpie el tubo de ensayo con etanol al 70%. Administre la prueba de observación de destete diariamente desde P19 hasta P21 para calificar el movimiento y los niveles generales de actividad. Comience dejando que los ratones se aclimaten al área de prueba durante 30 minutos.

Mientras los cachorros se aclimatan, prepara la arena. Marque una caja de prueba de plexiglás con una cuadrícula de seis por seis cuadrados de dos pulgadas. Antes de usar la caja, límpiala con etanol al 70%.

A continuación, coloque una cámara de vídeo de modo que una vista lateral de toda la caja llene el campo de visión. Estandarizar la apariencia del entorno para evitar introducir novedades. Antes de la prueba, transfiera el destete a una taza de retención limpia y registre su peso.

Luego comenzó la grabación de video. Primero, filme una tarjeta de identificación de prueba con el número de identificación del mouse, su antigüedad y la fecha actual. A continuación, transfiera el ratón de la taza de sujeción al cuadrado central.

Durante tres minutos, cuente el número de líneas cruzadas por ambas patas delanteras. Después de tres minutos, regrese el mouse a una jaula limpia y finalice la grabación de video. Entre cada prueba, limpie la caja con etanol al 70%.

A partir de los videos, cuente los eventos de cría, que es cuando un ratón se para con ambas patas delanteras libres de apoyo. También cuente los eventos de acicalamiento, que ocurren cuando ambas patas delanteras se dedican a la limpieza. Realice la prueba de fuerza de agarre en días alternos entre P22 y P26 para evaluar la fuerza neuromuscular.

Como de costumbre, dé a los ratones 30 minutos para que se adapten al área de prueba. El aparato de prueba es una caja de plexiglás con una rejilla de malla. Limpie ambos con etanol al 70%.

A continuación, forra el fondo de la caja con una capa de plástico de burbujas para acolchar y cubre el plástico de burbujas con papel para absorber las excreciones. Proceda a separar los ratones de prueba y cárguelos en tazas individuales. Ahora, coloque el primer mouse en el centro de la malla de alambre e invierta lentamente la malla de 10 a 20 centímetros por encima de la superficie blanda de la caja.

Mida la latencia para caer o finalizar la prueba después de 60 segundos, si el mouse no se cae. A continuación, vuelva a colocar el primer ratón en el vaso de sujeción. Entre pruebas, limpie la malla con etanol al 70% y vuelva a colocar el papel sobre el plástico de burbujas.

A continuación, realice la prueba en los otros dos ratones del grupo. Después de probar cada ratón una vez, repita el proceso dos veces más durante tres pruebas por ratón. Si hay menos de tres ratones en un grupo, asegúrese de que haya un tiempo de recuperación entre ensayos de al menos cinco minutos.

Para una tinción de diaforasa de NADH, combine volúmenes iguales de solución de NADH recién hecha y solución de NBT recién hecha. A continuación, añada un mililitro de solución de tinción a cada portaobjetos e incube los portaobjetos en una cámara humidificada a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Para una tinción de succinato hidrogenasa, prepare una solución de succinato de sodio 0,1 molar, NBT 1,25 molar y tampón de fosfato 0,2 molar.

A continuación, añade un mililitro a cada portaobjetos. Empaque los portaobjetos en una cámara humidificada e incube los portaobjetos a 37 grados centígrados durante una hora. Después de incubar con cualquiera de las manchas, aspire la solución de tinción y lave los portaobjetos tres veces con agua destilada.

A continuación, lave los portaobjetos a través de una serie de baños de acetona que aumentan y disminuyen en concentración. Con cada concentración de acetona, realice tres lavados durante dos minutos por lavado. Por último, enjuague los portaobjetos tres veces con agua destilada.

A continuación, monte las guías con un medio acuoso. Los ratones sin expresión de HTRA2 se examinaron utilizando la batería de pruebas descrita y se compararon con los controles de compañeros de camada. No se observaron cambios en el número de tirones ni en la latencia de caída entre P4 y P6. Entre P7 y P10 se observó una reducción de la fuerza neuromuscular.

En la prueba de actividad, hubo una reducción de la actividad de los ratones knockout de HTRA2. Los ratones knockout HTRA2 también mostraron una reducción en la resistencia en la prueba de agarre de malla de alambre. La tinción H y E muestra que los ratones knockout HTRA2 no tenían cambios aparentes en la estructura de la retina en comparación con los controles en P35.

Finalmente, se utilizó la tinción histoquímica para la actividad del complejo de la cadena de transporte de electrones para identificar cambios en las funciones de las enzimas respiratorias. Hubo una disminución de la tinción en los ratones knockout de HTRA2 en comparación con los controles. Esto se observó en el cerebelo y el cuerpo estriado, pero no en la corteza.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la actividad y la fuerza neuromuscular de ratones modificados genéticamente, así como cómo combinar estos estudios con ejes celulares. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.