Name: Eliciando y analizando canciones masculinas de vocalización ultrasónica (USV) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Aprende a registrar y analizar vocalizaciones ultrasónicas en ratones machos adultos usando estímulos sociales variados. Este método permite estudiar la comunicación vocal y trastornos neuropsiquiátricos en modelos animales.

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Este trabajo fue apoyado por los fondos del Instituto Médico Howard Hughes a EDJ. Damos las gracias a Pr. Sylvie Granon (NeuroPSI - Universidad Paris sur XI - FRANCIA) por prestarnos el hardware del altavoz. También damos las gracias a los miembros del Laboratorio Jarvis por su apoyo, discusiones, correcciones y comentarios sobre este trabajo, especialmente Joshua Jones Macopson por su ayuda con figuras y pruebas. Damos las gracias al Dr. Gustavo Arriaga por su ayuda con el software Mouse Song Analyzer, actualizándolo para nosotros a V1.3, y otros aspectos de este protocolo. V1.0 del software fue desarrollado por Holy y Guo, y v1.1 y v1.3 por Arriaga.

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<li>Holfoth, D. P., Neilans, E. G., Dent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+of+partial+from+whole+ultrasonic+vocalizations+using+a+go%2Fno-go+task+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Acoust.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Discrimination of partial from whole ultrasonic vocalizations using a go/no-go task in mice.</a> J. Acoust. Soc. Am. 136, 3401(2014).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo proporciona enfoques para recolectar, cuantificar y estudiar vocalizaciones de cortejo de ratones macho en el laboratorio a través de una variedad de estímulos relacionados principalmente con mujeres. Como se ha expuesto anteriormente en Chabout, et al. 23 y en los resultados representativos, el uso de este método nos permitió descubrir locuciones dependientes del contexto y sintaxis que importan para las hembras receptoras. La estandarización de estos estímulos proporcionará la colección de un número confiable de USVs y permitirá un análisis detallado de las canciones y repertorios masculinos de cortejo. Cuando una hembra viva está presente con el macho, el protocolo no nos permite identificar claramente el emisor de las vocalizaciones. Sin embargo, estudios anteriores demostraron que la mayoría de las vocalizaciones emitidas en ese contexto fueron por los varones 26 , 29 . La mayoría de los estudios que usan un congénito (masculino o femenino)Como un estímulo para los hombres creen que la cantidad de vocalizaciones femeninas en estos contextos es despreciable 4 , 5 , 22 , 30 . Sin embargo, un trabajo reciente utilizó la triangulación para localizar la vocalización del emisor en condiciones de alojamiento en grupo 31 , y mostró que dentro de una díada, la hembra contribuye a ~ 10% de los USVs. En el presente protocolo el uso de la hembra anestesiada permite al usuario estudiar las vocalizaciones masculinas en presencia de una hembra sin su vocalización. En contraste con las expectativas de este estudio reciente [ 31] , no encontramos ninguna diferencia en el número de sílabas emitidas entre el FE y AF [ 23] . Es posible que las hembras vivas no contribuyeran de manera significativa a las grabaciones o que los machos vocalizaron menos en presencia de hembras vivas frente a fem anestesiadasCervezas Sin embargo, creemos que los experimentos futuros deberían considerar el uso de este método de triangulación para evaluar el efecto potencial de la contribución femenina. Hay otro software disponible que puede hacer algunos de los pasos que hemos descrito, aunque no creemos en una manera suficiente para las preguntas que pedimos utilizando una combinación de tres programas: Software A, Mouse Song Software de análisis de sintaxis utilizando cálculos de D + E de cálculo de hoja de cálculo personalizado y descodificación de sintaxis utilizando R. Por ejemplo, un artículo reciente propuso un software denominado VoICE que permite al usuario extraer automáticamente las variables acústicas de los sonogramas o directamente sobre unidades que habían sido manualmente Seleccionado por el usuario 32 . Pero, los análisis automatizados o semiautomáticos de secuencias no son tan detallados como nuestro enfoque. Algunos programas comerciales pueden analizar automáticamente las características acústicas, pero noClasificación de las sílabas; El usuario tiene que ordenar las diferentes sílabas después. Grimsley, Gadziola, et al. 33 desarrolló un programa de órganos vocales de ratón virtual basado en tablas que agrupa sílabas basadas en características acústicas compartidas, pero no proporciona detección automática de las sílabas. Su programa 34 es único en que crea secuencias novedosas de canciones grabadas usando modelos de Markov, y por lo tanto tiene características más avanzadas que la simple edición. La mayoría de los estudios previos de comunicación en ratones se han centrado en el lado del emisor 35 , 36 . Pocos estudios han explorado el lado del receptor 30 , 37 , 38 . Los protocolos de reproducción y discriminación proporcionan una prueba sencilla para estudiar el lado del receptor, como el descrito recientemente por Asaba, Kato, etAlabama. 39 . En ese estudio, los autores usaron una caja de prueba de dos opciones separada con espuma acústica en lugar de la caja de laberinto en Y descrita aquí. Ambas opciones tienen ventajas y desventajas. En primer lugar, el Y-laberinto no aísla el sonido de un brazo a otro, pero la caja de dos opciones sí. Sin embargo, al usar el diseño del laberinto en Y, el animal puede evaluar rápidamente las dos canciones que se tocan simultáneamente y avanzar hacia la preferida. Sin embargo, los experimentos de reproducción en general ayudan a los experimentadores a determinar el significado y por lo tanto las funciones de las vocalizaciones generadas para los animales conspécificos. En conclusión, después de dominar las técnicas de este protocolo y los análisis, los lectores deben ser capaces de abordar muchas preguntas que influyen en el contexto, la genética y la neurobiología de USV de ratón. Utilizando los ratones B6D2F1 / J, los estímulos asociados femeninos casi siempre disparan los USV de los machos que hemos probado en nuestro laboratorio. Es crítico paraCt suficientes sílabas (&gt; 100 en 5 min) para poder obtener un fuerte análisis estadístico. Para solucionar problemas, si no se registran USV (o no lo suficiente), compruebe la configuración para asegurarse de que se graban sonidos. Haga una inspección en vivo de lo que está sucediendo en la jaula durante la grabación mirando el sonograma en tiempo real en la pantalla del ordenador después de la introducción del estímulo. De lo contrario intentar volver a exponer al macho a una hembra sexualmente madura / receptiva durante la noche y luego alojarlos solo durante varios días o hasta una semana antes de grabar de nuevo. Basado en observaciones anecdóticas, encontramos que algunos machos cantan mucho en un día (durante casi los 5 minutos completos), y no mucho al día siguiente, y luego otra vez otro día. No sabemos la razón por la que ocurre tal variabilidad dentro del sujeto, pero suponemos que es probablemente una motivación o estacional para los varones, y el estado de estro para la orina femenina. Si no se registra ningún USV, intente registrar al animal en varios días para recoger estos efectos variables. NoComo en los pájaros cantores, no hemos notado diferencias manifiestas en la cantidad de canto en función del momento del día. Encontramos que los machos no cantan mucho (&lt;100 sílabas en 5 min) antes de que tengan 7 semanas de edad. Los métodos de detección presentados aquí pueden extraer miles de sílabas y todos los parámetros acústicos en pocos minutos. Pero como cualquier método de detección automática, es muy sensible al ruido de fondo. El uso del software de detección de Song Song con grabaciones ruidosas (por ejemplo, de animales registrados con lecho) puede requerir un ajuste del &quot;umbral&quot; de detección para permitir más flexibilidad. Sin embargo, esto también aumentará el número de sílabas falsas positivas y la detección automática podría fallar. En tales circunstancias, se puede usar la codificación manual. Como se indicó anteriormente, el número, los repertorios y la latencia de las vocalizaciones son ampliamente variables dependiendo de la tensión, por lo que se puede tener que cambiar los parámetros (duración de la grabación,Estímulo, detección automatizada de sílabas, etc. ) para algunas cepas para asegurar grabaciones óptimas para análisis estadísticos.

En relación con los seres humanos, los ratones producen vocalizaciones de baja y alta frecuencia, las más tarde conocidas como vocalizaciones ultrasónicas (USVs) por encima de nuestro rango auditivo. Los USVs se producen en una variedad de contextos, incluyendo de madre-cachorro de recuperación, las interacciones juveniles, a las interacciones de adultos opuestos o del mismo sexo [ 4 , 12] . Estos USVs se componen de un repertorio multisilábico diverso que se puede categorizar manualmente 9 o automáticamente 10 , 11 . El papel de estos USVs en la comunicación ha estado bajo creciente investigación en los últimos años. Estos incluyen el uso de los USVs como lecturas de modelos de ratones neuropsiquiátricos, el desarrollo o los trastornos del comportamiento [ 7 , 8] , y internos motivacionales / estados emocionales [ 13] . Se piensa que los USV transmiten información confiable sobre elQue es útil para el receptor 14 , 15 . En 2005, Holy y Guo 11 , avanzaron la idea de que los ratones macho adultos USVs se organizaron como una sucesión de elementos de llamada multisilábico o sílabas similares a los pájaros cantores. En muchas especies, un repertorio multisilábico permite al emisor combinar y ordenar sílabas de diferentes maneras para aumentar la información potencial que lleva la canción. Se cree que la variación en esta sintaxis tiene una relevancia etológica para el comportamiento sexual y las preferencias de pareja 16 , 17 . Estudios posteriores mostraron que los ratones machos fueron capaces de cambiar la composición relativa de los tipos de sílabas que producen antes, durante y después de la presencia de una hembra 5 , 18 . Es decir, los ratones machos adultos usan sus USVs para el comportamiento de cortejo, ya sea para atraerO mantener un contacto estrecho con una hembra, o facilitar el apareamiento 19 , 20 , 21 . También se emiten en las interacciones hombre-varón, probablemente para transmitir información social durante las interacciones 4 . Para capturar estos cambios en los repertorios, los científicos suelen medir las características espectrales (parámetros acústicos, tales como amplitud, frecuencias, etc. ), el número de sílabas o llamadas de USV y la latencia del primer USV. Sin embargo, pocos realmente mirar a la dinámica de la secuencia de estos USVs en detalle [ 22] . Recientemente nuestro grupo desarrollado un nuevo método para medir los cambios dinámicos en el USV sílaba secuencias [ 23] . Hemos demostrado que el orden de la sílaba dentro de una canción acerca de (es decir, la sintaxis) no es aleatorio, que cambia dependiendo del contexto social, y que los animales que escuchan detectan estos cambios como pertinentes desde el punto de vista etológico. NotamosEn muchos investigadores que estudian la comunicación animal no atribuyen al término &quot;sintaxis&quot; el mismo significado exacto que la sintaxis usada en el habla humana. Para los estudios de comunicación animal, significamos simplemente una secuencia ordenada, no aleatoria, de sonidos con algunas reglas. Para los seres humanos, además, se sabe que secuencias específicas tienen significados específicos. No sabemos si este es el caso de los ratones. En este artículo y en el video asociado, nuestro objetivo es proporcionar protocolos fiables para registrar a los ratones machos en los tribunales a través de diversos contextos y realizar reproducciones. El uso de tres software utilizado secuencialmente para: 1) grabaciones automatizadas; 2) detección y codificación de sílabas; Y 3) análisis en profundidad de las características de la sílaba y la sintaxis se demuestra ( Figura 1 ]. Esto nos permite aprender más acerca de la estructura y la función de los ratones machos. Creemos que estos métodos facilitan el análisis de datos y pueden abrir nuevos horizontes en la caracterización de la comunicación vocal normal y anormalSe modelos de comunicación y trastornos neuropsiquiátricos, respectivamente.

<table><tbody><tr><td>Nevera de playa insonorizada</td><td>Ver Gus papel tiene más información sobre el tipo</td><td></td> específico <td>Dimensiones interiores (L 27 x W 23 x H 47 cm):</td></tr><tr><td>Micrófono de ultrasonido de condensador CM16/CMPA</td><td>Avisoft Bioacoustics, Berlín, Alemania</td><td>#40011</td><td>Incluye cable de extensión&nbsp;</td></tr><tr><td>Tarjeta de sonido Ultrasound Gate 1216H</td><td>Avisoft Bioacoustics, Berlín, Alemania</td><td>#34175</td><td>Tarjeta de sonido de 12 canales</td></tr><tr><td>Ultrasound Gate Player 216H</td><td>Avisoft Bioacoustics, Berlín, Alemania</td><td>#70117</td><td>Reproductor de reproducción de 2 canales</td></tr><tr><td>Altavoz electrostático ultrasónico ESS polaroid</td><td>Avisoft Bioacoustics, Berlín, Alemania</td><td>#60103</td><td>2 altavoces de reproducción</td></tr><tr><td>Jaula de pruebas&nbsp;</td><td>Ace</td><td>#PC75J</td><td>30 x 8 x 13 cm de altura; plexiglás</td></tr><tr><td>separación de plexiglás</td><td>hecho en</td> <td>casa-4</td> <td>x 13 cm plexiglás con agujeros de 1 cm</td></tr><tr><td>Cámara de video</td><td>Logitech</td><td>C920</td><td>logitech HD Pro webcam C920</td></tr><tr><td>Almohadilla térmica&nbsp;</td><td>Rayo</td><td>de sol 722-810-000</td><td></td></tr><tr><td>Laberinto en Y&nbsp;</td><td>Hecho en</td> <td>casa-Dimensiones</td> <td>interiores (L 30 x W 11 x H 29 cm):</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avisoft Recorder (Software A)</td><td>Avisoft Bioacoustics, Berlín, Alemania</td><td>#10101, #10111, #10102, #10112</td><td>http://www.avisoft.com</td></tr><tr><td>MATLAB R2013a (Software B)</td><td>MathWorks</td><td>-</td><td>MATLAB R2013a (8.1.0.604)</td></tr><tr><td>Mouse Song Analyzer v1.3 (Software C)</td><td>Diseñado a medida por Holy, Guo, Arriaga & Jarvis; Se ejecuta con el software B</td><td></td><td>http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Mouse_Song_Analyzer_ v1.3-2015-03-23.zip</td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel 2013 (Software D)</td><td></td><td>Microsoft-Microsoft</td> <td>Office</td></tr><tr><td>Excel Song Analysis Guide v1.1 (Software E)</td><td>Diseñado a medida por Chabout & Jarvis. Hojas de calculadora de Excel, se ejecuta con el software D</td><td></td><td>http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Song-analysis_Guided.xlsx</td></tr><tr><td>Decreto de sintaxis v1.1 (Software F)</td><td>Diseñado a medida por Sakar, Chabout, Dunson, Jarvis - en R studio</td><td></td><td>https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td></tr> <tr><td>Graphiz (Software G)</td><td>AT& T Investigación y otros&nbsp;</td><td></td><td>http://www.graphviz.org</td></tr><tr><td>Avisoft SASLab (Software H)</td><td>Avisoft Bioacoustics, Berlín, Alemania</td><td>#10101, #10111, #10102, #10112</td><td>http://www.avisoft.com</td></tr><tr><td>Reactivos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xilacina (20 mg/mL)</td>HCl de ketamina <td>anaseda</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(100 mg/mL)</td><td>Henry Schein</td><td>#045822</td><td></td></tr><tr><td>agua</td><td></td><td></td><td></td>destilada</tr><tr><td>ungüento para los ojos&nbsp;</td><td>Puralube Ungüento Veterinario&nbsp;</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Placas</td><td></td><td></td><td></td> de Petri</tr> <tr><td>con puntas</td><td></td><td></td><td></td>de algodón</tr></tbody></table>

eliciando y analizando canciones masculinas de vocalización ultrasónica (usv)

Eliciting and Analyzing Male Mouse Ultrasonic Vocalization (USV) Songs

Los ratones producen vocalizaciones ultrasónicas (USVs) en una variedad de contextos sociales durante el desarrollo y la edad adulta. Estos USVs se utilizan para la recuperación de madre-cachorro 1 , las interacciones juveniles 2 , opuesto e interacciones del mismo sexo 3 , 4 , 5 , y las interacciones territoriales [ 6] . Durante décadas, los USVs han sido utilizados por los investigadores como proxies para estudiar los trastornos neuropsiquiátricos y de desarrollo o conductuales 7 , 8 , 9 y, más recientemente, para comprender los mecanismos y la evolución de la comunicación vocal entre los vertebrados 10 . Dentro de las interacciones sexuales, los ratones machos adultos producen canciones de USV, que tienen algunas características similares a las canciones de cortejo de los pájaros cantores 11 . El uso de tal repertorio multisilábicoToires puede aumentar la flexibilidad potencial y la información que transportan, ya que pueden variar en la forma en que los elementos se organizan y recombinan, a saber, la sintaxis. En este protocolo se describe un método fiable para obtener canciones USV de ratones machos en diversos contextos sociales, tales como exposición a orina femenina fresca, animales anestesiados y mujeres de celo. Esto incluye condiciones para inducir una gran cantidad de sílabas de los ratones. Reducimos el registro de ruidos ambientales con cámaras de sonido de bajo costo y presentamos un método de cuantificación para detectar, clasificar y analizar automáticamente los USVs. Este último incluye la evaluación de la tasa de llamadas, el repertorio vocal, los parámetros acústicos y la sintaxis. Se describen diversos enfoques y conocimientos sobre el uso de reproducciones para estudiar la preferencia de un animal por tipos de canciones específicos. Estos métodos se utilizaron para describir los cambios acústicos y de sintaxis en diferentes contextos en ratones machos, y las preferencias de las canciones en ratones hembra.

En el presente protocolo, se caracterizaron los cambios en el comportamiento vocal y la sintaxis de los ratones B6D2F1 / J machos. En general, utilizando este protocolo, pudimos registrar, en promedio por varón por sesión de 5 minutos, 675 ± 98,5 sílabas clasificadas en respuesta a UR femenina, 615,6 ± 72 en FE, 450 ± 134 en AF, 75,6 ± 38,9 en AM y 0,2 ± 0,1 en UR macho (n = 12 machos). Las tasas fueron ~ 130 sílabas / min para la mujer UR, ~ 120 sílabas / min para FE, o ~ 100 sílabas / min para AF contextos ( Figura 5A ]. Los machos producen una cantidad mucho mayor de sílabas en respuesta a la orina recién recogida relativa a la orina recolectada durante la noche 10 , 23 . Los varones también cantan considerablemente menos en presencia de una orina masculina o masculina anestesiada nueva Figura 5A ). Los varones también cambian su repertorio a través del contexto 23 . Por ejemplo, los machos B6D2F1 / J aumentan significativamente Producción de sílabas de salto múltiple de salto de "m" en la condición de orina femenina ( Figura 5B ). También cambian las características acústicas de las sílabas individuales a través del contexto. Por ejemplo, B6D2F1 / J machos cantan sílabas con una mayor amplitud y ancho de banda en el contexto de la orina femenina, y una mayor pureza espectral en el contexto de la mujer despierta en comparación con los otros ( Figura 6 ] [ 23] . Este protocolo también proporciona un medio para medir las características dinámicas de la secuencia y, por tanto, los cambios de sintaxis. Utilizando un método adaptado de Ey, et al. 22 , se utiliza el ISI para definir los vacíos entre las secuencias ( Figura 7A ] [ 23] , y luego utilizar las brechas para distinguir y analizar los patrones temporales de secuencias de sílabas. Hemos demostrado longitudes más largas de secuencia se producen en el contexto femenino despierto ( Figura 7B ]F "&gt; 23. Esta técnica nos permite calcular la relación de secuencias complejas (compuestas por al menos 2 apariciones del tipo" m "de la sílaba) frente a secuencias simples (compuestas de uno o ningún tipo" m "y, Se encontró que con los machos B6D2F1 / J el contexto de orina femenina desencadenó una proporción más alta en comparación con los otros ( Figura 7C ) 23 , indicando que produjeron sílabas más complejas en la condición de la orina femenina, pero también que dichas sílabas están distribuidas Sobre más secuencias. También somos capaces de calcular las probabilidades de transición condicional de un tipo de sílaba a otro (24 tipos de transición total incluyendo las transiciones desde y hacia el estado de "silencio") [ 23] . Encontramos que en diferentes contextos, la elección de los ratones de los tipos de transición para las sílabas de inicio dado difiere, y que hay más sintaxis divEn la condición de la orina femenina ( Figura 8 ) 23 . Estas observaciones son consistentes con los informes anteriores que muestran que los varones pueden cambiar las características acústicas o la composición del repertorio de sus vocalizaciones en respuesta a diferentes estímulos y experiencias 4 , 5 , 24 . Por último, el presente protocolo proporciona orientación para probar las preferencias femeninas con reproducciones. Encontramos que las hembras B6D2F1 / J prefieren canciones más complejas (que contienen 2 o más sílabas "m") en relación con canciones simples 23 . La mayoría de las mujeres eligieron permanecer más a menudo en el lado del Y-laberinto que jugó las canciones complejas ( Figura 4B ). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54137/54137fig1.jpg"> Figura 1: Diagrama de Flujo de SofUso y análisis. A cada programa y código asociado se le da un nombre de letra para ayudar a explicar su identidad y uso en el texto principal. In () son los programas específicos que utilizamos en nuestro protocolo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54137/54137fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54137/54137fig2.jpg"> Figura 2: Configuración para la grabación de canciones de ratones masculinos. (A) Imagen de una caja de grabación de atenuación de sonido y configurada para grabar vocalizaciones de USV. (B) Ejemplo de sonograma de una grabación realizada con el Software A ( Tabla 1 ), incluyendo características espectrales detalladas calculadas por "Mouse Song Analyzer v1.3": duración, intervalo entre sílabas (ISI), frecuencia de pico min (Pf min) Frecuencia de pico máxima (Pf máx.), Inicio de frecuencia de pico (Pf inicio), frecuencia de pico (Fin Pf) y ancho de banda. (C) Sonogramas de otro macho cantando a una hembra viva, dentro de la caja de atenuación de sonido y fuera de la caja en el banco de laboratorio en la misma habitación. Nuestras observaciones anecdóticas indican que las grabaciones en la caja del mismo animal muestran mayor volumen (mayor intensidad) y menos armónicos, pero no hay evidencia de ecos en la caja sin espuma de sonido. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54137/54137fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54137/54137fig3.jpg"> Figura 3: Captura de pantalla del "Mouse Song Analyzer v1.3" whis_gui Ventana que muestra las diferentes opciones disponibles para los análisis. Los parámetros mostrados son los que se usan para registrar USVs masculinos en las figuras y los análisis de datos presentados (excepto la duración de la nota mínima fue de 3 ms). .com / files / ftp_upload / 54137 / 54137fig3large.jpg "target =" _ blank "&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54137/54137fig4.jpg"> Figura 4: Selecciones femeninas entre reproducciones de canciones complejas y sencillas. (A) Imagen del aparato Y-laberinto utilizado y medidas de la dimensión. (B) Tiempo empleado por las hembras en cada brazo, jugando ya sea a partir de un complejo (orina femenina provocada) o más simple (desencadenada femenina elicited) canción del mismo macho. Se presentan datos para n = 10 ratones hembra B6D2F1J como media ± SE, con valores individuales también mostrados; 9 de las 10 mujeres mostraron preferencia por la sílaba / secuencia más compleja. * P &lt;0,05 prueba de t de Student pareada. Figura modificada de Chabout, et al. 23 con permiso.Blank "&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54137/54137fig5.jpg"> Figura 5: Número de sílabas emitidas y repertorio en condiciones diferentes . (A) Tasa de producción de sílaba de varones en diferentes contextos. (B) Composiciones del repertorio de los machos cuando están en presencia de los contextos de orina femenina (UR), hembra anestesiada (FA), hembra despierta (FE) y anestesiada (AM). Los datos se presentan como media ± SEM. P &lt;0,03; ** p &lt;0,005; *** p &lt;0,0001 para la prueba post-hoc de t de Student pareada después de la corrección de Benjamini y Hochberg (n = 12 varones). La figura de Chabout, et al. 23 con permiso. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54137/54137fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Together.within-page = "1"&gt; <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54137/54137fig6.jpg"> Figura 6: Ejemplos de características espectrales en diferentes contextos. (A) Amplitud. * P &lt;0.025 para la prueba post-hoc de t de Student pareada después de la corrección. (B) Gama de frecuencia o ancho de banda. *: P &amp; lt; 0,041; **: p &amp; lt; 0,005; ***: p &lt;0,0001 después de la corrección. (C) Pureza espectral de las sílabas. * P: &amp; lt; 0,025; **: p &amp; lt; 0,005; ***: p &lt;0,0001 después de la corrección. Abreviaturas: orina femenina (UR), hembra anestesiada (AF), hembra despierta (FE), y anestesiada macho (AM). Las figuras modificadas de Chabout, et al. 23 con permiso. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54137/54137fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 37fig7.jpg "/&gt; Figura 7: Mediciones de Secuencia. (A) Uso del ISI para separar la secuencia. El ISI corto (IS) y el ISI medio (MI) se utilizan para separar sílabas dentro de una secuencia, y ISI largo sobre 250 ms (LI) separa dos secuencias. (B) Longitud de las secuencias, medida como el número de sílabas por secuencia, producido por los machos en diferentes contextos. *: P &amp; lt; 0,025; ** p &lt;0,005; *** p &lt;0,0001 después de la corrección. (C) Relación de canciones complejas sobre canciones simples producidas por varones en diferentes contextos. * P &amp; lt; 0,041; ** p &lt;0,005; *** p &lt;0,0001 después de la corrección. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 12 varones). La figura de Chabout, et al. 23 con permiso. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54137/54137fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 8: Diagramas de sintaxis de la sílaba de secuencias basadas en probabilidades condicionales para cada contexto. El espesor de la flecha es proporcional a la probabilidad condicional de un tipo de transición en cada contexto promediado desde n = 12 machos: P (ocurrencia de una transición dada la sílaba de inicio). Para mayor claridad, no se muestran transiciones raras por debajo de una probabilidad de 0,05. La figura de Chabout, et al. 23 con permiso. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54137/54137fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Los ratones producen un complejo repertorio multisilábico de vocalizaciones ultrasónicas (USVs). Estos USVs son ampliamente utilizados como lecturas de trastornos neuropsiquiátricos. Este protocolo describe algunas de las prácticas que aprendimos y desarrollamos para inducir, recopilar y analizar consistentemente las características acústicas y la sintaxis de las canciones del ratón.

Eliciando y analizando canciones masculinas de vocalización ultrasónica (USV)

Mice produce ultrasonic vocalizations (USVs) in a variety of social contexts throughout development and adulthood. These USVs are used for mother-pup ...

El objetivo general de este procedimiento es recopilar y realizar de forma fiable un análisis acústico de las vocalizaciones ultrasónicas o USV de un ratón macho adulto en una variedad de contextos sociales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la comunicación vocal y los trastornos asociados. Incluyendo trastornos neuropsiquiátricos y trastornos autistas utilizando modelos de ratón.Una de las principales ventajas de esta técnica es que proporciona un medio para obtener USV en varios contextos. Por lo general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades para hacer que sus ratones se comporten, por lo que debe manipularlos con cuidado y suavidad para que canten. El alojamiento estándar de animales es suficiente para este protocolo.Tres días antes de hacer una grabación en jaulas neutras, exponga a los machos a una hembra sexualmente madura y receptiva durante la noche. En cada jaula se pueden emparejar hasta tres machos con una hembra. Al día siguiente retira las hembras.Mantenga a los machos alojados en sus grupos durante al menos dos días más antes de la primera sesión de grabación. Para registrar los USV de un macho preparado, transfiera suavemente al animal por la cola a una jaula limpia sin ropa de cama. Coloque esta jaula dentro de una caja insonorizada.A continuación, cubra la jaula con la tapa abierta con alambre. Cierre la caja y deje que el animal se habitúe a ella durante 15 minutos. Mientras tanto, prepare un estimulante para el ensayo como se describe en la siguiente sección. Para usar muestras de orina fresca, recójalas dentro de los cinco minutos posteriores a la sesión de grabación.Primero agarra un ratón por el pescuezo como para una inyección de drogas. Luego, con una punta de algodón sujeta por pinzas, frote y empuje suavemente la vejiga del animal para extraer una gota de orina y empaparla completamente con el algodón. Luego, seleccione un ratón de una jaula diferente y repita el proceso usando la misma punta de algodón.Es importante usar una mezcla de orinas frescas. Guarde la punta de algodón en un plato limpio hasta que la necesite Para preparar una hembra alerta como estímulo, seleccione una que esté en la etapa de pre-celo o celo. El ratón tendrá una amplia abertura vaginal y tejido rosado que lo rodea.Aísla a una hembra así hasta que la necesites. Para preparar un ratón anestesiado, simplemente proporcione anestesia como de costumbre. Confirme el estado anestesiado con un pellizco en el dedo del pie y aplique ungüento oftálmico.Hasta que lo necesite, mantenga al animal anestesiado en una jaula limpia sobre una toalla de papel con una almohadilla térmica debajo de la jaula configurada para minimizar el calor. Asegúrese de controlar regularmente la respiración y la temperatura corporal de los animales. El ratón anestesiado puede ser utilizado hasta en tres sesiones consecutivas.Cuando esté listo para grabar, haga clic en el botón de grabación en el software mientras presenta simultáneamente el estímulo. Para presentar orina o un animal vivo, simplemente colóquelo dentro de la jaula. Sin embargo, para presentar un animal anestesiado, colóquelo encima de la tapa de la jaula.Luego, cierre silenciosamente la caja y grabe los USV durante cinco minutos más o menos. Para finalizar una grabación, presione el cuadrado de parada en el software. Revise al animal anestesiado al menos cada 15 minutos.Hasta que haya recuperado la decúbito esternal. Luego puede ser devuelto a su jaula de origen. Entre las pruebas, limpie la jaula de prueba con alcohol al 70% y agua destilada.Procese las grabaciones acústicas utilizando el software de análisis de canciones del ratón. De este modo, su sílaba, su estructura acústica y su sintaxis pueden analizarse y reestructurarse para su reproducción según sea necesario. Primero lave el aparato de reproducción con alcohol al 70% seguido de agua destilada.Use un laberinto en Y opaco de color negro con brazos de 30 centímetros. En los extremos de dos brazos hay orificios perforados a nivel del suelo que se ajustan a los altavoces de ultrasonido. Después de lavar, seca el laberinto con una toalla.Una vez seco, configúrelo con los altavoces de reproducción y la cámara de video de techo montada. Para comenzar la prueba, primero coloque a la hembra en el laberinto durante un período de habituación de 10 minutos. Después de 10 minutos, si la hembra no está en el brazo inicial, empújela suavemente hacia el brazo inicial y cierre suavemente la ventana de separación de plástico.A continuación, inicie la grabación de vídeo e inicie las grabaciones de audio en reproducción en bucle. Por ejemplo, reproduzca una canción capturada de la estimulación urinaria en un brazo y reproduzca una canción capturada de la estimulación femenina en el otro brazo. Ahora permita que la hembra explore el laberinto durante cinco minutos.Esto constituye una sesión. Después de cinco minutos, detenga la grabación y devuelva la hembra al brazo inicial. Manténgalo allí durante un minuto mientras lo limpia con agua destilada para eliminar la orina o los excrementos.Hazlo entre todas las sesiones. Para la segunda sesión, cambie la reproducción grabada a los brazos opuestos y grabe a la hembra explorando este escenario durante cinco minutos. Para la tercera y cuarta sesión, repita los dos parámetros de la sesión anterior para un total de 20 minutos de grabaciones de prueba.Detenga siempre la grabación de vídeo al final de todas las sesiones. Una semana más tarde, realice otra prueba en la misma cohorte de animales. Pero usa diferentes ejemplos de canciones.Haga esto para reforzar la confiabilidad de los hallazgos. Para el análisis, mida el tiempo que pasan las hembras en cada brazo para cada sesión. Utilizando el protocolo presentado, se caracterizaron los cambios en el comportamiento vocal y la sintaxis de los ratones machos B6D2F1J.Durante una sesión de grabación de cinco minutos, un hombre promedio respondió de manera muy diferente a los tres estímulos. Los hombres también cambiaron su repertorio en todo el contexto. Por ejemplo, en respuesta a la orina fresca, los hombres produjeron una fracción significativamente mayor de vocalizaciones de varias sílabas en sus canciones.Los hombres también cambiaron las características acústicas de las sílabas individuales a través del contexto. Por ejemplo, cantaban ciertas sílabas a una amplitud y ancho de banda más altos en el contexto de la orina femenina. Y a mayor pureza espectral en el contexto femenino despierto.En una prueba de preferencia de canciones, las hembras en un laberinto en Y eligieron pasar más tiempo en el brazo con canciones complejas que contenían dos o más vocalizaciones de varias sílabas. A diferencia del brazo opuesto donde solo se tocaban canciones sencillas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo recolectar USV de ratón en una variedad de contextos sociales, cómo reproducirlos a los ratones y cómo hacer un análisis acústico y de secuencia de sus vocalizaciones.Una vez dominado, las grabaciones de comportamiento se pueden realizar en un plazo de cinco a 10 minutos por ratón. Debe permitir varias horas para el análisis. Y asegúrese de manipular a los ratones con cuidado, para no alterar las respuestas conductuales.

eliciting-and-analyzing-male-mouse-ultrasonic-vocalization-usv-songs

Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

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