El análisis fenotípico y funcional de las células reguladoras T activadas Aislado de la coriomeningitis linfocítica crónica por el virus ratones infectados

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la función supresora in vitro de las células T reguladoras, aisladas de ratones infectados con virus crónicos. Este método puede ayudar a responder preguntas sobre el fenotipo y la función supresora in vitro de las células T reguladoras activadas durante una infección viral crónica. Esta técnica puede evaluar el efecto directo de las células T reguladoras en el individuo con una respuesta positiva a las células T in vitro.

Esta es una gran ventaja de esta técnica. Comience transfiriendo cinco veces diez al quinto linfocitos esplénicos totales en 50 microlitros de tampón facs a cada pocillo de una nueva placa de 96 pocillos de fondo U, seguido de 150 microlitros de tampón facs. Centrifugar la placa y desechar el sobrenadante.

A continuación, agite los gránulos de celdas y lave las células dos veces más en 200 microlitros de tampón facs por pocillo. Después del segundo lavado, vuelva a suspender los pellets en 50 microlitros de cóctel de anticuerpos por pocillo, durante 20 minutos en la oscuridad a cuatro grados centígrados. A continuación, lavar las células dos veces en tampón facs y decantar el sobrenadante.

A continuación, fije las celdas durante 20 minutos en la oscuridad a cuatro grados centígrados con 100 microlitros de tampón de fijación, seguido de dos lavados con tampón de lavado de permeabilización. Después del segundo lavado, resuspender las células en 50 microlitros de anticuerpo anti-FOXP3. Para preparar las perlas recubiertas anti CD3 CD28, transfiera el volumen adecuado de perlas magnéticas a un tubo de 15 mililitros y agregue un volumen igual de PPS.

Mezcle suavemente la solución pipeteando y centrifugue las perlas magnéticas. Al final del lavado, deseche el sobrenadante y diluya las perlas en 50 microlitros de medio completo por pocillo. A continuación, siembre 50 microlitros de uno por diez a la quinta célula T reguladora CD25 CD4 positiva por pocillo en una placa inferior U de 96 pocillos, seguida de 50 microlitros de uno por diez a la quinta linfocitos T respondedores CD8 positivos por pocillo.

Cuando se hayan plateado todas las celdas, agregue 50 microlitros de las perlas recubiertas diluidas anti CD3 CD28 a cada pocillo, y agregue hasta 50 microlitros de medio para elevar el volumen total de cada pocillo a 200 microlitros. Luego cubra la placa con papel de aluminio y colóquela a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono durante 72 horas. Para analizar la producción de citocinas de células T CD8 positivas, después de tres días de cultivo, transfiera los sobrenadantes a otra placa de 96 pocillos y analice los sobrenadantes mediante ELISA, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Para analizar la proliferación de los linfocitos T CD8 positivos, lavar tres veces la placa de células con tampón facs. A continuación, vuelva a suspender los gránulos en 50 microlitros de un cóctel de anticuerpos adecuado contra las células T CD8 positivas proliferadas durante 20 minutos en la oscuridad a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, lavar las células dos veces en tampón facs y fijarlas durante 20 minutos en la oscuridad a cuatro grados centígrados con 100 microlitros de tampón de fijación.

Por último, lavar las células dos veces más en tampón facs y resuspender los pellets en 200 microlitros de tampón facs. A continuación, mida el porcentaje de proliferación de linfocitos T CD8 positivos marcados con filato mediante citometría de flujo. En los linfocitos esplénicos obtenidos de ratones vírgenes e infectados, la PD-1 está específicamente regulada al alza tanto en las células CD4 negativas convencionales FOXP3 positivas como en las células CD8 negativas para FOXP3 de ratones infectados clon 13 de LCMV.

La frecuencia de linfocitos T reguladores CD4 positivos para FOXP3 es dos veces mayor en los ratones infectados con el clon 13 de LCMV que en los ratones naïve, y la mayoría de las células CD4 positivas para FOXP3 también muestran un fenotipo alto de PD-1 activado. Los linfocitos T respondedores CD8 positivos pueden separarse con éxito sin contaminación significativa por otras células inmunitarias. Después del aislamiento de las células T reguladoras, se puede obtener una población dominante de células T CD25 positivas para CD25 con una pureza superior al 80 por ciento.

La estimulación de los linfocitos T reguladores y respondedores aislados por perlas recubiertas de CD3 CD28 da como resultado la inhibición de los linfocitos T respondedores CD8 positivos de manera dependiente de la dosis. De hecho, cuando los linfocitos T respondedores CD8 positivos se cocultivan con linfocitos T reguladores crónicos en una proporción de uno a uno, la proliferación de linfocitos T respondedores CD8 positivos se inhibe significativamente. La producción de interferón gamma por parte de las células respondedoras CD8 positivas también se inhibe significativamente cuando las células T respondedoras CD8 positivas se cocultivan con células T reguladoras activadas de ratones infectados crónicamente, en comparación con el cocultivo con células T reguladoras en reposo de ratones naïve.

Hemos descubierto que esta técnica se puede completar en 80 horas si se realiza correctamente. Mientras intenta este procedimiento, es importante recordar que debe utilizar células T reguladoras recién aisladas inmediatamente después de su aislamiento. Después de este desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la medicina exploraran la función de las células T reguladoras en una enfermedad inflamatoria crónica.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar un procedimiento de supresión de células T reguladoras in vitro, utilizando un sistema de cocultivo de células T reguladoras y de respuesta.