Name: El análisis fenotípico y funcional de las células reguladoras T activadas Aislado de la coriomeningitis linfocítica crónica por el virus ratones infectados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Aprende a evaluar la función supresora in vitro de células T reguladoras aisladas de ratones infectados con virus de coriomeningitis linfocítica crónica. Este método permite analizar el fenotipo y la actividad inmunorreguladora en infecciones virales persistentes.

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Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación en Ciencias Básicas a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de Educación (2015R1A6A3A01020610 a HJP) y una subvención del Proyecto Coreano de Investigación y Desarrollo de Tecnología de la Salud, Ministerio de Salud, Bienestar y Asuntos Familiares, República de Corea (HI15C0493 a SJH).

En este estudio, los ratones se mantuvieron en una instalación específica libre de patógenos del Centro de Investigación de Animales de Laboratorio de la Universidad de Yonsei de Yonsei. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices de Corea Administración de Alimentos y Drogas utilizando los protocolos aprobados por el Comité Internacional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Investigación de Animales de Laboratorio de Yonsei en la Universidad de Yonsei. 1. Preparación de soluciones <ol><li> Preparar 2% de medio RPMI diluyendo suero bovino fetal (FBS) al 2% y penicilina-estreptomicina al 1% en RPMI </li><li> Preparar medio RPMI completo. Para RPMI noticias agregar 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina, 1% de L-glutamina, y 50 mM 2-mercaptoetanol. </li><li> Prepare el buffer de fluorescencia de clasificación de células activadas (FACS). Para ello la solución salina es así, buffer fosfato suplemento (PBS) con 2% de FBS. </li><li> Preparar tampón de aislamiento de células T. Para ello, complementar PBS con 2% de SFB y 2 mM ethylenediaminetetraaácido ascético. </li></ol> 2. Aislamiento de linfocitos del bazo <ol><li> Retire los bazos de los ratones no tratados previamente o infectados por el CL13 LCMV como se ha descrito previamente 19 y colocarlos en 60 mm x 15 mm placas de Petri que contenían 10 ml de 2% medio RPMI. NOTA: En estos experimentos de estudio, de 5 a 6 semanas de edad C57B1L / 6J hembra recibió 2 x 10 6 unidades formadoras de placa (pfu) de LCMV CL13 a través de una inyección intravenosa a través de la vena de la cola. Sacrificar los ratones en el día 16 después de la infección (16 d pi) 25. ratones ingenuos analizar emparejados-ge estaban en el mismo día. </li><li> Colocar un filtro de células en un tubo de 50 ml y enjuague con 2 ml de 2% de medio RPMI. Coloque el bazo en el filtro de células 70 micras y se muelen usando el émbolo de una jeringa. Enjuague el filtro de células con 2 ml de 2% medio RPMI y sacarlo de tubo de 50 ml. </li><li> Llenar el tubo con un 2% de medio RPMI y se centrifuga a 300 g durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender elsedimento celular en 1 ml de tampón de lisis ACK. Se incuban las muestras a temperatura ambiente (RT) durante 5 min. Nota: El volumen de tampón de lisis ACK indicado arriba es para un bazo. Ampliar el volumen en consecuencia para las muestras de bazo agrupadas. </li><li> Llenar el tubo con un 2% de medio RPMI y se centrifuga a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y volver a suspender las células a una densidad de 1 x 10 7 células / ml en medio RPMI completo. NOTA: Para el recuento de células vivas, células de tinción con azul de tripano y cuenta sólo las células vivas que no están teñidas utilizando hemocitómetro. </li></ol> 3. Fenotipificación de esplénica convencional T (T conv) Las células y las células T reg NOTA: Antes de aislamiento de células T reg, examinar el fenotipo de linfocitos esplénicos aislados de los ratones no tratados previamente o infectados por tinción de las células con varios anticuerpos y análisis de los mismos por citometría de flujo. <ol><li> Transferencia de 50 l de las células(5 x 10 5 células) entre los linfocitos esplénicos totales en cada pocillo de una nueva placa de 96 pocillos de fondo en U y añadir 150 l de tampón FACS por pocillo. Centrifugar a 300 xg durante 2 minutos a 4 ° C. </li><li> Descartar el sobrenadante. Agitar el sedimento de células y añadir 200 l de tampón de FACS por pocillo. Centrifugar a 300 xg durante 2 minutos a 4 ° C (2 veces). </li><li> Preparar el cóctel de anticuerpos para marcadores de superficie celular de tinción en 50 l de tampón FACS por pocillo con los siguientes anticuerpos y reactivos. colorante Anti-CD4 violeta, colorante verde Anti-CD25, anti-PD-1 de colorante violeta, Anti-CD8-PerCP Cy5.5 reactivo de detección de tinte y la viabilidad celular en el infrarrojo cercano (IR) colorante reactivo fluorescente. NOTA: A fin de analizar el fenotipo de las células T reg activados, anti-CD103 23,25 se puede añadir para la tinción de la superficie celular marcador. </li><li> Resuspender el sedimento celular con 50 l de cóctel de anticuerpo por pocillo. Incubar durante 20 minutos en la oscuridad a 4 ° C. Se lavan las células dos veces contampón FACS mediante centrifugación a 300 xg durante 2 minutos a 4 ° C. </li><li> Después de la etapa de lavado final, se decanta el sobrenadante y fijar las células durante 20 min en la oscuridad a 4 ° C con 100 l de tampón de fijación preparados de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Lavar las células dos veces con el tampón de lavado de permeabilización (preparado de acuerdo con el protocolo del fabricante) por centrifugación a 300 xg durante 2 minutos a 4 ° C. </li><li> Preparar la solución de anticuerpos para la tinción intracelular Foxp3, y volver a suspender el sedimento celular con 50 l de solución de anticuerpo Anti-Foxp3. NOTA: Para analizar más a fondo los fenotipos de conv T y las células T reg, anti-CTLA se puede agregar en este paso. </li><li> Incubar durante 20 minutos en la oscuridad a 4 ° C y repetir el paso 3.6. Después de la etapa de lavado final, resuspender el sedimento celular en 200 l de tampón de FACS y examinar el fenotipo de las células por citometría de flujo 25. </li><li> Puerta de la población de células vivasción. Para el análisis de los fenotipos de las células T durante la infección conv LCMV CL13, examinar la frecuencia de Foxp3 - PD-1 + células entre las células CD4 + o T CD8 +. NOTA: En base a los resultados experimentales, el porcentaje de Foxp3 - PD-1 + es más del 50% en las poblaciones de células CD4 + y CD8 + a los 16 d pi con LCMV CL13. <ol><li> Para analizar la frecuencia y fenotipos de las células T reg, examinar las frecuencias de Foxp3 + o Foxp3 + PD-1 + células entre las células T CD4 +. NOTA: En base a los resultados experimentales, el porcentaje de Foxp3 + o células Foxp3 + PD-1 + es más de 20% en la población de células T CD4 +, respectivamente. </li></ol></li></ol> 4. Aislamiento de células Treg CD4 + CD25 + T NOTA: Los volúmenes de todos los reactivos indicados a continuación es para unaa partir del número de células de 1 x 10 7 esplenocitos totales. <ol><li> Preparar las células como se describe en la sección 2, utilizando ratones infectados crónicamente ingenuos y LCMV. Se lavan las células por adición de 10 ml de tampón de aislamiento de células T. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante por completo y volver a suspender el sedimento celular en 40 l de tampón. </li><li> Para el enriquecimiento de células T CD4 + utilizando el sistema de separación celular magnética, añadir 10 l de cóctel de biotina-anticuerpo y mezclar bien. Incubar durante 10 minutos a 4 ° C. </li><li> Añadir 30 l de tampón, 20 l de anti-biotina micro-perlas para el etiquetado de las células no CD4 + T y 10 l de anticuerpo CD25-PE para el etiquetado fluorescente de células CD25 +. Mezclar bien e incubar durante 15 minutos en la oscuridad. </li><li> Añadir 2 ml de tampón y pasar las células a través de un filtro de 40 micras de células en un nuevo tubo de 50 ml para eliminar los restos celulares. Se lavan las células por centrifugación a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.Eliminar el sobrenadante por completo y volver a suspender el sedimento celular en 500 l de tampón a una densidad de hasta 1,25 x 10 8 células. </li><li> Aplicar las células en la columna y recoger las células no marcadas que pasan a través de la columna. Lavar la columna mediante la adición de 2 ml de tampón y se centrifuga a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante por completo y volver a suspender las células T CD4 + aisladas en 90 l de tampón. </li><li> Para el marcaje magnético de células CD25 +, añadir 10 l de microperlas anti-PE, mezclar bien e incubar durante 15 minutos en la oscuridad a 4 ° C. </li><li> Añadir 2 ml de tampón y se lavan las células por centrifugación a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante por completo y volver a suspender el sedimento celular en 500 l de tampón a una densidad de células de hasta 1 x 10 8. </li><li> Para enriquecer los reg células T CD4 + CD25 +, aplique las células en la columna de selección positiva, y se lava la column mediante la adición de 2 ml de tampón. Repita el lavado tres veces. </li><li> Cuando la columna está vacía después de la última etapa de lavado, añadir 1 ml de tampón en la columna, y expulsar el marcado magnéticamente CD4 + CD25 + células utilizando el émbolo. </li><li> Repita los pasos 4.8 a 4.9 para mejorar la pureza de los aislados reg células CD4 + CD25 + T. Se lavan las células con tampón FACS mediante centrifugación a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células aisladas reg CD4 + CD25 + T en una concentración de 2 x 10 6 células / ml en medio RPMI completo. </li><li> Para comprobar la pureza de las células T reg + aisladas-CD4 + CD25, utilizar 2 x 10 5 células de los totales reg células aisladas-CD4 + CD25 + T. Teñir las células con 50 l de tampón FACS que contiene anti-CD4 FITC y la viabilidad celular reactivo de detección de cerca-IR colorante reactivo fluorescente. NOTA: CD25 ya se marcó con PE durante el aislamiento. </li><li> Incubar durante 20 minutos en la oscuridad a 4 ° C. Se lavan las células con tampón FACS mediante centrifugación a 300 xg durante 2 minutos a 4 ° C. Después del lavado, resuspender el sedimento celular en 100 l de tampón de FACS y comprobar la pureza por citometría de flujo. </li><li> Puerta de la población de células vivas. Para analizar la pureza de las células T reg, confirmar el porcentaje de células CD4 + CD25 +. NOTA: En base a los resultados experimentales, el porcentaje de células CD4 + CD25 + entre las células purificadas es por encima de aproximadamente 80%. </li></ol> 5. Aislamiento de células T CD8 + y etiquetado de las células T CD8 + NOTA: Los volúmenes de todos los reactivos se indican a continuación son para un número de células a partir de 1 x 10 7 esplenocitos totales. <ol><li> Preparar las células como se describe en la sección 2 utilizando ratones no tratados previamente. Se lavan las células mediante la adición de 10 ml de piel de ante de aislamiento de células Ter. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante por completo, y volver a suspender el sedimento celular en 40 l de tampón. </li><li> Para el aislamiento de células T CD8 + usando el sistema de separación celular magnética, añadir 10 l de cóctel de biotina-anticuerpo para el etiquetado + T cell no CD8 y mezclar bien. Incubar durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Añadir 30 l de tampón y 20 l de microperlas anti-biotina. Mezclar bien e incubar durante 10 minutos a 4 ° C. </li><li> Aplicar las células en la columna y recoger las células no marcadas que pasan a través de la columna. Lavar la columna mediante la adición de 2 ml de tampón tres veces. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante por completo y volver a suspender las células T CD8 + aisladas en 2 ml de tampón. </li><li> Para comprobar la pureza de las células aisladas, preparar 50 l de solución de anticuerpo en tampón FACS. Volver a suspender las 2 x 10 5 células aisladas entre T CD8 + cells en 50 l de solución de anticuerpo. NOTA: Para preparar la solución de anticuerpo, añadir anti-CD8 FITC, y el reactivo de detección de la viabilidad celular (fluorescente cerca-IR colorante reactivo) en tampón de FACS. </li><li> Incubar durante 20 minutos en la oscuridad a 4 ° C. Se lavan las células con tampón FACS mediante centrifugación a 300 xg durante 2 minutos a 4 ° C. Después del lavado, resuspender el sedimento celular en 100 l de tampón FACS, y comprobar la pureza de las células mediante citometría de flujo. </li><li> Puerta de la población de células vivas. Para comprobar la pureza de las células T CD8 +, confirmar el porcentaje de células T CD8 +. NOTA: En base a los resultados experimentales, el porcentaje de células CD8 + entre las células purificadas es por encima de aproximadamente 90%. </li><li> Añadir PBS a las células T CD8 + aisladas. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar el sobrenadante. Resuspender las células T CD8 + aisladas a una concentración de 1 x 10 7 células / ml en PBS. </li><li> Para etiquetar la ce T CD8 +LLS para el ensayo de supresión in vitro, diluir la proliferación de células de colorante de seguimiento violeta en PBS para obtener una concentración de 5 mM a temperatura ambiente. NOTA: Los excitación y de emisión aproximados picos de la proliferación celular colorante guía violeta utilizado en el estudio son 405 y 450 nm, respectivamente. </li><li> Mezclar volúmenes iguales de bien la proliferación de células de colorante de seguimiento violeta (5 M) y la suspensión de células (1 x 10 7 células / ml de células T CD8 +) en un tubo de 15 ml, y se incuba a 20 min a 37 ° C. Vortex el tubo cada 10 min. </li><li> Llenar el tubo con medio RPMI completo frío, y dejar el tubo durante 10 min a RT. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a TA. Eliminar el sobrenadante por completo, y volver a suspender las células a una concentración de 2 x 10 6 células / ml con medio RPMI precalentado completas. Se incuban las células durante 15 min a TA. </li></ol> 6. Configuración del ensayo de supresión in vitro utilizando células CD4 + CD25 + T &lt;sub&gt; Reg y células T CD8 + <ol><li> Para preparar anti-CD3 / CD28 perlas recubiertas de, transferir el volumen apropiado de perlas magnéticas a una 15 ml de tubo (2,5 l / 1 x 10 5 células). Añadir un volumen igual de PBS y mezclar. Lavar por centrifugación a 300 xg durante 2 min a 4 ° C y descartar el sobrenadante. Diluir las perlas magnéticas en medio completo (50 l / pocillo). </li><li> Alícuota de 50 l de reg células + T CD4 + CD25 por pocillo de placa de 96 pocillos de fondo en U (1 x 10 5 células / pocillo). Añadir 50 l de células T CD8 + como de respuesta T (T resp) células por pocillo (1 x 10 5 células / pocillo). Añadir 50 l de perlas de anti-CD3 / CD28 recubierto diluido en por pocillo. NOTA: En este paso, la etiqueta y configurar los pocillos de control de la siguiente manera: &quot;Sólo no estimulada de células T CD8 +&quot; sin perlas anti-CD3 / CD28-revestido; &quot;Sólo las células T CD8 +&quot; con anti-CD3 / CD28 perlas recubiertas con; Sólo &quot;células T CD8 +&quot;Con perlas de CD28 con recubrimiento anti-CD3 /;&quot;. Células T reg única &quot;con-anti CD3 perlas / CD28 revestido con células T reg pueden diluirse por medio completo y co-cultivadas con células T resp en una proporción diferente de T resp células: las células T reg (1: 0,25-1: 1). </li><li> Añadir 50 l o volumen apropiado de medios de comunicación en todos los pocillos hasta un volumen total de 200 l. Cubrir la placa con papel de aluminio y se incuba en un incubador de CO2 a 37 ° C durante 72 horas. </li></ol> 7. Análisis de las células CD8 + T de proliferación celular y la producción de citoquinas de las células T CD8 + <ol><li> Para el análisis de la producción de citoquinas, después de 3 días de cultivo, separar el sobrenadante de cada pocillo a otra placa y realizar ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). NOTA: El sobrenadante puede alícuotas y se almacenó a -70 ° C. En este experimento, se utilizó la placa recubierta con anticuerpo anti-ratón de IFN-γ para detectar IFN-γ acuerdo produccióning el protocolo del fabricante s. Para determinar la producción de IFN-γ de la proliferación de células T CD8 + en un solo nivel celular, tinción intracelular de citoquinas se puede realizar. </li><li> Después de separar el sobrenadante de cada pocillo, se lava la placa que contiene las células con tampón FACS y se centrifuga a 300 xg durante 2 minutos a 4 ° C (3 veces). </li><li> Después del lavado, descartar el sobrenadante. Resuspender el sedimento celular con 50 l de cóctel de anticuerpos para la tinción de las células T CD8 + proliferado. Incubar durante 20 minutos en la oscuridad a 4 ° C. NOTA: Para preparar cóctel de anticuerpos, añadir anti-CD4 FITC, anti-CD8-PerCP Cy5.5, y el reactivo de detección de la viabilidad celular (fluorescente cerca-IR colorante reactivo) en tampón de FACS. NOTA: Los anticuerpos contra diversos marcadores tales como CD44 o CD69 se pueden combinar con otros anticuerpos para confirmar la activación de las células T CD8 +. Recuerde que las células T CD8 + que ya han sido etiquetados con la proliferación celular de seguimiento violet tinte en el Paso 5.10. </li><li> Lavar dos veces por centrifugación a 300 xg durante 2 min a 4 ° C. Después de la etapa de lavado final, descartar el sobrenadante, y fijar las células durante 20 min en la oscuridad a 4 ° C con 100 l de tampón de fijación. </li><li> Lavar dos veces por centrifugación a 300 xg durante 2 min a 4 ° C. Resuspender las células con 200 l de tampón de FACS y se mide la proliferación de las células T CD8 + marcados con colorante de seguimiento de violeta de proliferación celular por citometría de flujo. <ol><li> Puerta de la población de células T CD8 + entre las células vivas. Medir los porcentajes de células divididas y no divididas de acuerdo con la dilución de la proliferación de las células de colorante de seguimiento de violeta y la dilución de células T CD8 + de acuerdo con la siguiente ecuación. % De inhibición = [(% de células proliferadas T CD8 + en la ausencia de células T reg -% de las células T CD8 + proliferado en la presencia de células T reg) / (% de células T CD8 + proliferado enla ausencia de células T reg)] x 100. analizar más a fondo los datos mediante el uso de la citometría de flujo del software 25. </li></ol></li></ol>

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</ol>

S.-J.H. tiene una patente y recibe regalías de patentes relacionadas con la vía PD-1. Los otros autores no tienen conflictos de intereses financieros.

Aunque existe sólo un pequeño número de células T reg en ratones y seres humanos, es importante para entender su función ya que desempeñan un papel crucial en la regulación de la respuesta inmune y el mantenimiento de la tolerancia inmune. El número y supresores funciones de T reg células aumenta durante una infección por el virus crónica 15-20, así como la progresión del cáncer 13,14. Esto es probablemente debido a la estimulación de antígeno continuado. Para evaluar la T <su...

Células T reguladoras (Treg) expresan caja forkhead P3 (Foxp3) como un factor de transcripción para su desarrollo y función 1. Además, las células T reg expresan varias otras moléculas tales como CD25 2, el gen de activación de linfocitos 3 (LAG-3) 3, inducida por glucocorticoides factor de necrosis tumoral receptor 4, y linfocitos T citotóxicos asociada a la proteína 4 (CTLA-4) 5 en su superficie o región intracelular. Durante la infección crónica con diversos tipos de agentes patógenos tales como virus, bacterias 6,7 8,9, y parásitos 10-12, o en el curso del desarrollo del cáncer de 13,14, las células T reg se diferencian en células activadas, se presentan función de supresión mejorada células de orientación efectora CD4 + y T CD8 +. Varios trabajos han sugerido que las células T reg expandidas y activadas contribuyen a los respons a alteraciones celulares T CD8 +e durante amigo retrovirus (FV), la infección 15-17. Células T reg inducidas-FV inhiben IFN-γ o expresión de granzima B y reactividad citotóxica de las células T CD8 + 15-17. Por otra parte, en un modelo de infección por el virus herpes simplex, se informó de que el agotamiento de células T CD4 + reg + CD25 resultó en la expansión de células T CD8 + específicos del virus y daños graves en los tejidos por la infiltración de células T CD4 + inmunopatogénicos 18-20. Los ratones infectados crónicamente con la cepa clon 13 del virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV CL13) 21 a 24 han sido ampliamente utilizados para caracterizar el fenotipo y la función de las células T efectoras (T eff) y células T reg durante la infección crónica por virus. Durante la infección por LCMV persistente, las células T eff específico del virus pierden progresivamente su función efectora y se convierten en células T agotados (T) exh. Por otra parte, Treg células refuerzan su capacidad para suprimir la respuesta de células T específica para el virus 25. La disminución de la capacidad de funcionamiento de las células T eff puede explicarse por varios factores tales como la regulación positiva de los receptores inhibidores sobre las células T eff, función alterada de las células presentadoras de antígeno, la producción de citocinas inmunorreguladoras, y aumento de la frecuencia o el incremento de la función de T reg 26 células. Entre los factores implicados en la supresión de células T, la muerte celular programada proteína-1 (PD-1) que expresan las células EXH T y las células T reg han sido ampliamente considerado como las características de persistencia de antígeno y el medio ambiente de supresión. Recientemente, se informó de que el bloqueo de la vía de PD-1 y la ablación de células T reg conducen a la función de células T mejorado y la disminución de la carga viral durante la infección crónica por LCMV 27. Además, las células T reg se activan durante la infección crónica de ratones con LCMV 23,25 </sarriba&gt; y su función supresora se fortalece 25. PD-1 es altamente expresado en las células T reg así como las células T EXH, y el nivel de PD-1 expresada por las células T reg se correlaciona con la fuerza de su función supresora para inhibir la proliferación de células T 25. A continuación, se describe un método para comparar las características de las células T reg activados aislados de ratones infectados con LCMV CL13 y reg células T en reposo aislados de ratones no tratados previamente. Por otra parte, explicamos una serie de procesos para separar las reg células T activadas y examinar su fenotipo ex vivo, así como medir su actividad supresora in vitro.

<table><tbody><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse CD4</td><td>RM4-5</td><td>BD Biosciences</td><td>553047</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos con fondo en U BD</td><td></td><td>Biosciences 353077</td><td></td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td> de fijación <td>BD Biosciences</td><td>554655</td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse CD25</td><td>7D4</td><td>BD Biosciences</td><td>553072</td></tr><tr><td>Filtro de células, 70 mm</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td></tr><tr><td>Filtro de células, 40 mm</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td></tr><tr><td>Violeta Brillante 421 Anti-ratón CD279 (PD-1)</td><td>29F.1A12</td><td>BioLegend</td><td>135217</td></tr><tr><td>Violeta Brillante 605 Anti-Ratón CD4</td><td>RM4-5</td><td>Biolegend</td><td>100547</td></tr><tr><td>APC Anti-Ratón/Rata Foxp3&nbsp;</td><td>FJK-16s</td><td>eBioscience</td><td>17-5773</td></tr><tr><td>Foxp3/Conjunto de tampones de tinción de factor de transcripción</td><td>eBioscience</td><td>00-5223</td>PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a 53-6.7 eBiosicence 45-0081 Ratón IFN-gamma Platinum ELISA eBiosicence BMS606 RPMI 1640 GE Ciencias de la Vida SH30027 PBS (1x)<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30256</td></tr><tr><td>ACK Tampón</td><td></td> de lisado <td>Gibco</td><td>A10492-01</td></tr><tr><td>L-glutamina, solución</td><td></td> de 200 mM <td>Gibco&nbsp;</td><td>25030</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina, 10.000 U/ml</td><td></td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10378-016</td></tr><tr>Kit <td></td> de <td>tinción de células muertas en infrarrojo cercano LIVE/DEAD</td> Life <td>technologies</td><td>L-34975</td></tr><tr><td>CD8a+ Kit de aislamiento de células T, ratón</td><td></td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-104-075</td></tr><tr><td>CD4+ CD25+ Kit de aislamiento de células T reglamentarias, ratón</td><td></td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-091-041</td></tr><tr><td>MACS Columnas de separación, columnas</td><td></td> <td>LDMiltenyibiotec</td><td>130-042-901</td></tr><tr><td>MACS Columnas de separación, columnas</td><td></td> LS <td>Miltenyibiotec</td><td>130-042-401</td></tr><tr><td>EDTA, 0,5 m (pH 8,0)</td><td></td><td>Promega</td><td>V4231</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td></td><td>Sigma Life Science</td><td>M7522</td></tr><tr><td>Suero</td><td></td> fetal bovino <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30919.03</td></tr><tr><td>CellTrace Kit</td> <td>de proliferación celular violeta</td><td>Citómetro</td><td></td>de flujo Thermo Fisher Scientific C34557</tr><tr><td>BD Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td>Flowjo TreeStar Hematocytomer Marienfeld superior <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

el análisis fenotípico y funcional de las células reguladoras t activadas aislado de la coriomeningitis linfocítica crónica por el virus ratones infectados

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Células reguladoras T (T reg), que expresan Foxp3 como un factor de transcripción, son subconjuntos de células T CD4 +. Células T reg desempeñan papeles cruciales en la tolerancia inmune y el mantenimiento de la homeostasis mediante la regulación de la respuesta inmune. La función principal de las células T reg es la de suprimir la proliferación de células T efectoras T (FEP) y la producción de citoquinas tales como IFN-γ, TNF-α e IL-2. Se ha demostrado que la capacidad de las células T reg &#39;para inhibir la función de las células T eff es mayor durante la infección por patógenos persistente y el desarrollo del cáncer. Para aclarar la función de las células T reg en condiciones de reposo o inflamadas, una variedad de ensayos de supresión in vitro utilizando células de ratón o de reg T humanas se han ideado. El objetivo principal de este estudio es desarrollar un método para comparar las diferencias en el fenotipo y la función supresora de descanso entre y reg T activadasCélulas. Para aislar reg células T activadas, los ratones fueron infectados con el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) clon 13 (CL13), una cepa crónica de LCMV. Células T reg aisladas del bazo de ratones infectados por LCMV CL13 exhiben tanto el fenotipo activado y actividad supresora mejorada en comparación con las células en reposo T reg aisladas de ratones no tratados previamente. A continuación, se describe el protocolo básico para el análisis ex vivo fenotipo de distinguir reg células T activadas de descansar células T reg. Además, se describe un protocolo para la medición de la actividad supresora de las células T reg totalmente activadas.

Hemos generado ratones con infección por el virus persistente mediante la inyección de ellos con 2 x 10 6 pfu de LCMV CL13 por vía intravenosa. Para investigar los cambios fenotípicos en las células T reg y las células T durante la infección conv virus crónica, linfocitos esplénicos obtenidos de ratones no tratados previamente y infectadas se tiñeron con diversos anticuerpos y se analizaron por citometría de flujo. A los 16 d PI, PD-1 se regula...

Aquí, describimos un protocolo para analizar el fenotipo de células T reguladoras (Treg) aisladas de ratones infectados por el virus de la coriomeningitis linfocítica crónica e ingenua. Además, proporcionamos un proceso para evaluar la actividad supresora de las células Treg.

El análisis fenotípico y funcional de las células reguladoras T activadas Aislado de la coriomeningitis linfocítica crónica por el virus ratones infectados

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la función supresora in vitro de las células T reguladoras, aisladas de ratones infectados crónicamente con virus. Este método puede ayudar a responder preguntas sobre el fenotipo y la función supresora in vitro de las células T reguladoras activadas durante una infección viral crónica. Esta técnica puede evaluar el efecto directo de las células T reguladoras sobre el individuo con una respuesta positiva a las células T in vitro.Esta es una gran ventaja de esta técnica. Comience transfiriendo cinco veces diez a la quinta de linfocitos esplénicos totales en 50 microlitros de tampón FACS a cada pocillo de una nueva placa de 96 pocillos de fondo en U, seguido de 150 microlitros de tampón FACS. Centrifugue la placa y deseche el sobrenadante.Luego agite los pellet celulares y lave las células dos veces más con 200 microlitros de tampón FACS por pocillo. Después del segundo lavado, re suspenda los pellet en 50 microlitros de cóctel de anticuerpos por pocillo, durante 20 minutos a la oscuridad a cuatro grados Celsius. A continuación, lave las células dos veces con tampón FACS y deseche el sobrenadante.A continuación, fije las células durante 20 minutos en la oscuridad a cuatro grados Celsius con 100 microlitros de tampón de fijación, seguido de dos lavados con tampón de lavado para permeabilización. Después del segundo lavado, re suspenda las células en 50 microlitros de anticuerpo anti-FOXP3. Para preparar las perlas recubiertas de anti-CD3 CD28, transfiera el volumen apropiado de perlas magnéticas a un tubo de 15 mililitros y agregue un volumen igual de PPS.Mezcle suavemente la solución mediante pipeteo y centrifugue las perlas magnéticas. Al finalizar el lavado, deseche el sobrenadante y diluya las perlas en 50 microlitros de medio completo por pocillo. A continuación, siembre 50 microlitros de cinco por diez a la cuarta células T reguladoras CD4 positivas CD25 positivas por pocillo en una placa de 96 pocillos con fondo en U, seguido de 50 microlitros de cinco por diez a la cuarta células T respondedoras CD8 positivas por pocillo.Una vez que todas las células hayan sido sembradas, añada 50 microlitros de las perlas recubiertas con anticuerpos anti-CD3 y CD28 diluidas a cada pocillo y agregue hasta 50 microlitros de medio para llevar el volumen total de cada pocillo a 200 microlitros. Luego, cubra la placa con papel de aluminio y colóquela a 37 grados Celsius en un incubador de dióxido de carbono durante 72 horas. Para analizar la producción de citocinas por los linfocitos T positivos para CD8, transcurridos tres días de cultivo, transfiera los sobrenadantes a otra placa de 96 pocillos y analice los sobrenadantes mediante ELISA, según las instrucciones del fabricante.Para analizar la proliferación de las células T CD8 positivas, lave la placa de células tres veces con tampón FACS. Luego, re suspenda los pellet en 50 microlitros de un cóctel de anticuerpos adecuado contra las células T CD8 positivas proliferadas durante 20 minutos a oscuras a cuatro grados Celsius. Al final de la incubación, lave las células dos veces con tampón FACS y fíjelas durante 20 minutos a oscuras a cuatro grados Celsius con 100 microlitros de tampón de fijación.Finalmente, lave las células dos veces más con tampón FACS y resuspenda los pellet en 200 microlitros de tampón FACS. Luego, mida el porcentaje de proliferación de células T CD8 positivas doblemente marcadas con Phylate mediante citometría de flujo. En linfocitos esplénicos obtenidos de ratones no inmunizados e infectados, PD-1 se regula específicamente hacia arriba tanto en células CD4 positivas convencionales FOXP3 negativas como en células CD8 positivas FOXP3 negativas de ratones infectados con LCMV clon 13.La frecuencia de linfocitos T reguladores positivos para FOXP3 y CD4 es dos veces mayor en ratones infectados con el clon 13 del LCMV que en ratones no tratados, siendo que la mayoría de las células positivas para FOXP3 y CD4 también presentan un fenotipo activado con alta expresión de PD-1. Los linfocitos T respondedores positivos para CD8 pueden separarse exitosamente sin contaminación significativa por otras células inmunitarias. Tras el aislamiento de linfocitos T reguladores, puede obtenerse una población dominante de linfocitos T positivos para CD25 y CD4 con una pureza superior al 80 por ciento.La estimulación de linfocitos T reguladores y respondedores aislados mediante microesferas recubiertas con anticuerpos anti-CD3 y CD28 provoca la inhibición de los linfocitos T respondedores CD8 positivos de manera dependiente de la dosis. De hecho, cuando los linfocitos T respondedores CD8 positivos se cultivan en cocultivo con linfocitos T reguladores crónicos en una proporción uno a uno, la proliferación de los linfocitos T respondedores CD8 positivos se encuentra significativamente inhibida. La producción de interferón gamma por las células respondedoras CD8 positivas también se encuentra significativamente inhibida cuando los linfocitos T respondedores CD8 positivos se cultivan en cocultivo con linfocitos T reguladores activados procedentes de ratones crónicamente infectados, en comparación con el cocultivo con linfocitos T reguladores en reposo procedentes de ratones no inmunizados.Hemos descubierto que esta técnica puede completarse en 80 horas si se realiza adecuadamente. Mientras intenta este procedimiento, es importante recordar utilizar células T reguladoras recién aisladas inmediatamente después de su aislamiento. Tras este avance, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la medicina exploraran la función de las células T reguladoras en una enfermedad inflamatoria crónica.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar un procedimiento in vitro de supresión por linfocitos T reguladores, utilizando un sistema de co-cultivo de linfocitos T reguladores y linfocitos T respondedores.

phenotypic-functional-analysis-activated-regulatory-t-cells-isolated

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un protocolo de forma rápida, sencilla y rentable para la generación de donantes de origen multivirus CTL específicos (RCTL) para la perfusión del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas de trasplante (HSCT) con riesgo de desarrollar infecciones por CMV, EBV o Adv. Este proceso de fabricación es conforme a las GMP y debe garantizar la aplicación más amplia de células T inmunoterapia más allá de los centros especializados.

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Hemos desarrollado un ensayo in vitro para investigar el papel de las vías inmunorreguladoras en la regulación de la secreción de citoquinas por las células-T CD4 específicas del VIH.

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Los macrófagos son células plásticas del sistema hematopoyético que tienen un papel crucial en la inmunidad protectora y la homeostasis. En este informe se describen las técnicas in vitro optimizadas para caracterizar fenotípicamente y funcionalmente los macrófagos reguladores infiltrantes del injerto que se acumulan en el órgano trasplantado bajo condiciones tolerógenas.

Caracterización funcional de macrófagos reguladores que inhiben la inmunidad reactiva al injerto

Los linfocitos son los principales actores en las respuestas inmunitarias adaptativas. En este trabajo se presenta un protocolo de purificación de linfocitos para determinar las funciones fisiológicas de las moléculas deseadas en la activación de linfocitos in vitro e in vivo. Los procedimientos experimentales descritos son adecuados para comparar las capacidades funcionales entre linfocitos control y modificados genéticamente.

Aislamiento y activación de los linfocitos murinos

Muchos sistemas experimentales se han utilizado para entender los mecanismos que regulan el desarrollo de células T y la función en una respuesta inmune. Aquí se describe un enfoque genético usando la transducción retroviral, que es económico, eficiente en tiempo, y lo más importante, muy informativos en la identificación de las vías de regulación.

Retroviral transducción de células T colaboradoras como un enfoque genético para estudiar mecanismos que controlan su diferenciación y función

Este documento describe los protocolos de evaluación de la respuesta Tfh y GC B en el modelo de ratón de infección por el virus de la gripe.

Evaluación de las células auxiliares foliculares T y la respuesta del centro germinal durante la infección por el virus de la gripe A en ratones

Este artículo presenta dos protocolos optimizados para examinar las células inmunitarias residentes y derivadas periféricas dentro del sistema nervioso central, incluyendo el cerebro, la médula espinal y las meninges. Cada uno de estos protocolos ayuda a determinar la función y composición de las células que ocupan estos compartimentos en estado estacionario y en condiciones inflamatorias.

Aislamiento de tejidos del sistema nervioso central y meninges asociadas para el análisis posterior de las células inmunitarias

El estudio actual muestra protocolos para evaluar el compromiso del destino temprano de las células TFH específicas del virus y manipular la expresión génica en estas células.

Acceso a la diferenciación temprana de células T CD4+ auxiliares foliculares específicas del virus en ratones infectados con LCMV agudo

El estudio demuestra el papel de la piel en la modulación de las respuestas inmunitarias en ratones a través de la inmunización epicutánea (EC). La inmunización de la AE con un antígeno proteico puede suprimir las respuestas inmunitarias en la hipersensibilidad de contacto o revertir la supresión inducida por la piel cuando se combina con patrones moleculares asociados a patógenos. La inmunización anticonceptiva anticonceptiva (AE) se muestra prometedora como un enfoque eficaz y sin agujas para...

Modelo murino de inmunomodulación inducida epicutáneamente

Este protocolo proporciona una estrategia de cocultivo in vitro para investigar los efectos de las células T reguladoras sobre la proliferación y diferenciación de las células T efectoras.

In Vitro Análisis funcional de células T reguladoras: enfoque en la proliferación y diferenciación

Aprende a evaluar la función supresora in vitro de células T reguladoras aisladas de ratones infectados con virus de coriomeningitis linfocítica crónica. Este método permite analizar el fenotipo y la actividad inmunorreguladora en infecciones virales persistentes.

El análisis fenotípico y funcional de las células reguladoras T activadas Aislado de la coriomeningitis linfocítica crónica por el virus ratones infectados (Video) | JoVE Journal

El análisis fenotípico y funcional de las células reguladoras T activadas Aislado de la coriomeningitis linfocítica crónica por el virus ratones infectados

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