Totalmente automatizada de dispositivos de microfluidos para centrífuga Ultrasensible detección de proteínas a partir de sangre entera
16 de abril de 2016
Este protocolo demuestra cómo lograr la sensibilidad de detección femtomolar de proteínas en 10 μL de sangre total en 30 min. Esto se puede lograr mediante el uso de esteras nanofibrosas electrohiladas integradas en un laboratorio en un disco, que ofrece una gran área de superficie, así como una mezcla y un lavado efectivos para mejorar la relación señal-ruido.
El objetivo general de este procedimiento es mejorar la sensibilidad de detección de ELISA utilizando nanofibras naturales hiladas. Este video demuestra cómo lograr la sensibilidad de detección femtomolar de proteínas en 10 microlitros de muestras de sangre completa en 30 minutos. En una plataforma de laboratorio en un disco, la fuerza centrífuga se utiliza para transferir el líquido a través de las cámaras, y todo el proceso está completamente automatizado.
La sensibilidad de detección podría mejorarse en gran medida mediante la integración de nanofibras. Sin embargo, el problema es que la nanofibra es muy frágil y difícil de manipular. En este vídeo, presentamos un proceso sencillo para unir frágiles esteras de nanofibras de dióxido de titanio en un disco de plástico.
Para fabricar esteras de nanofibras de dióxido de titanio sobre sustrato de silicona mediante electrohilado, el sustrato de silicona primero se silaniza, se recubre con PDMS y se precura. A continuación, se transfiere una estera de nanofibras a este PDMS precurado y este producto se perfora para producir una pieza circular para su fijación. Cubra la cámara de reacción con una gota de PDMS como adhesivo y fije la pieza circular al fondo de la cámara.
Luego, cure el PDMS en el horno. Finalmente, ensamble las capas de disco en un dispositivo completo para ELISA. Esta técnica de transferencia de nanofibras nos permite utilizar la alta superficie de las nanofibras para el bioanálisis.
El dispositivo microfilítico centrífugo ofrece la integración y automatización completas de todo el proceso requerido en ELISA. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos existentes es que permite detectar concentraciones femtomolares de proteínas a partir de tan solo 10 microlitros de sangre total. Prepare las soluciones precursoras tal como se describe en el protocolo de ensayo adjunto.
A continuación, cargue la solución en el electrohilador y fabrique las nanofibras mediante electrohilado, utilizando las condiciones óptimas. Cuando se preparen las esteras de nanofibras poliméricas, calcinarlas en un horno al vacío. Después de la calcinación, finalmente se preparan las esteras de nanofibras de dióxido de titanio.
Prepare el diseño microfilítico mediante el uso de software de diseño 3D como SOLIDWORKS y transfiera el diseño a la fresadora CNC. Opere la fresadora CNC para fabricar el disco con canales y cámaras. El disco y la estera de nanofibras ya están listos para ser integrados.
Prepare una cámara de vacío, sustrato de silicona y fluorosilano. Silanizar el sustrato de silicona con fluorosilano al vacío durante 30 minutos. Prepare el PDMS invitado preparando el prepolímero con un agente de curado en una proporción de 10 a uno, y centrifuga la capa sobre el sustrato de silicona silanizada a 650 RPM durante 60 segundos.
Cura el PDMS recubierto de la oblea silanizada a 65 grados centígrados durante 10 minutos para que quede adhesivo. Ahora transfiera esas esteras de nanofibras a la silicona recubierta de PDMS aplicando la presión adecuada con un objeto plano como un portaobjetos de vidrio. Hornee la muestra a 80 grados centígrados durante una hora para curar completamente el adhesivo PDMS.
Dispense unas gotas de etanol en las esteras de nanofibras unidas a la capa de PDMS y haga un agujero de seis milímetros de diámetro con un PunchIt. A continuación, retire las esteras de nanofibras perforadas unidas al PDMS del sustrato de silicona. A continuación, cubra la cámara de reacción de unión en el disco con unos 20 microlitros de mezcla de PDMS y coloque las nanofibras unidas al PDMS en las cámaras.
A continuación, incuba el disco integrado en la estera de nanofibras a 80 grados centígrados durante una hora. Prepare una solución de 1% de volumen por volumen de GPDES en etanol. A continuación, trata las nanofibras del disco con plasma de oxígeno.
Dispense 100 microlitros de solución GPDES en cada estera de nanofibras e incube a temperatura ambiente durante dos horas en un recipiente sellado. Después de la incubación, retire la solución de GPDES golpeando el disco en un limpiaparabrisas. Lavar con etanol, retirar y hornear a 80 grados centígrados durante una hora.
Después de hornear, lavar con etanol y golpear para quitar. Repita este proceso y seque con un chorro de nitrógeno. Para la inmovilización de anticuerpos, dispense una solución diluida de anticuerpos capturados.
Mantenga los discos en una cámara humidificada e incube a 37 grados durante cuatro horas. Lave la solución restante con tampón de lavado. Ahora, ensambla el disco con una cinta adhesiva de doble cara.
Aplique una presión razonable para ensamblar las capas en un disco completo. Llene las cámaras de reacción de unión con tampón de bloqueo e incube a 37 grados centígrados durante una hora. Lavar dos veces con tampón de lavado y guardar el disco a 40 grados centígrados hasta su uso.
Cargue los reactivos, los tampones de lavado y 10 microlitros de sangre entera en las cámaras de reactivos y muestras. Coloque el disco en una máquina de visualización personalizada para el inmunoensayo automatizado. El sistema de visualización contiene un rotor conectado a un ordenador para el funcionamiento automatizado del disco junto con una luz estroboscópica y una cámara CCD para la toma de imágenes.
Gire el disco a 3.600 RPM durante 60 segundos para separar los glóbulos rojos. Mezclar el plasma con los anticuerpos de detección. Transfiera la mezcla a la cámara de reacción integrada con estera de nanofibras de dióxido de titanio.
Después de la inmunorreacción, lave las nanofibras transfiriendo el tampón de lavado a la cámara de reacción. Luego, transfiera la solución de sustrato quimioluminiscente a la cámara de reacción de unión e incube en modo de mezcla durante un minuto. Finalmente, transfiera la solución de sustrato reaccionado a la cámara de detección.
Cuando termine toda la reacción, transfiera el disco a un sistema de detección y lea la señal quimioluminiscente mediante el uso de un software personalizado. El funcionamiento del disco y el sistema de detección pueden integrarse en una sola plataforma. Al optimizar el voltaje y el fluorato, se obtuvieron esteras de nanofibras uniformes como se muestra en esta imagen SEM.
Con el fin de optimizar el tiempo de curado del PDMS, se midió la fuerza de adhesión. Si era demasiado corto, la estera de nanofibras se incrustaba en PDMS o se despegaba si era demasiado larga. Después de la optimización, la estera de nanofibras se fijó de manera estable en el PDMS.
En este gráfico se muestra el rango lineal para la detección de proteínas C reactivas desde dos plataformas. Utilizando el laboratorio de integridad de nanofibras en el disco, pudimos lograr una sensibilidad de detección altamente mejorada de la proteína C reactiva a partir de solo 10 microlitros de suero en 30 minutos. Las tecnologías disponibles en la actualidad, como el ELISA basado en placas de 96 pocillos, requieren un mayor volumen de muestra y un tiempo de detección más largo.
En general, el ELISA basado en disco integrado en nanofibras mostró un amplio rango dinámico de seis órdenes de magnitud con un límite de detección de seis femtomoles de proteína C reactiva. Esta sensibilidad de detección, ayudada por la alta superficie proporcionada por la nanofibra integrada en el disco, superó a la del ELISA convencional, que estaba limitado a 2.000 femtomoles. Después de ver este video, esperamos que tenga una buena comprensión de cómo preparar un dispositivo microfilítico centrífugo, cómo integrar nanofibras fasales y cómo realizar la detección de proteínas usando ELISA.
Esta técnica puede ser útil para detectar proteínas de bajo enlace en una cantidad muy pequeña de muestras biológicas.
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Descripción general
Este protocolo demuestra cómo lograr una sensibilidad de detección a nivel femtomolar de proteínas en 10 µL de sangre completa dentro de 30 minutos. El método utiliza membranas de nanofibras electrohiladas integradas en una plataforma de laboratorio-en-un-disco, mejorando la relación señal-ruido mediante una mezcla y lavado eficaces.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Biotecnología
- Detección de proteínas
- Nanotecnología
Antecedentes
- ELISA es un método común para la detección de proteínas.
- Mejorar la sensibilidad de detección es crucial para diagnósticos precisos.
- Las nanofibras naturales hiladas pueden aumentar la sensibilidad, pero son frágiles.
- Los sistemas automatizados tipo laboratorio-en-un-disco pueden agilizar el proceso.
Objetivo del estudio
- Mejorar la sensibilidad de detección del ELISA.
- Mostrar el uso de nanofibras en una configuración de laboratorio sobre un disco.
- Proporcionar un método para manipular membranas de nanofibras frágiles.
Métodos Utilizados
- Integración de membranas de nanofibras de dióxido de titanio en un disco plástico.
- Uso de la fuerza centrífuga para transferir líquidos a través de cámaras.
- Automatización de todo el proceso de detección.
- Evaluación de la sensibilidad de detección en muestras de sangre completa.
Resultados principales
- Alcanzó sensibilidad femtomolar para la detección de proteínas.
- Comprobó capacidades efectivas de mezclado y lavado.
- Mostró la viabilidad de usar nanofibras frágiles en una aplicación práctica.
- Validó el proceso automatizado para análisis rápido.
Conclusiones
- La integración de nanofibras mejora significativamente la sensibilidad de detección.
- La tecnología de laboratorio en un disco ofrece un enfoque prometedor para ensayos de proteínas.
- Este método puede adaptarse para diversas aplicaciones diagnósticas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Esta tecnología aborda la necesidad crítica de detección ultrasensible de proteínas en muestras clínicas de bajo volumen, permitiendo el descubrimiento temprano de biomarcadores a partir de cantidades mínimas de sangre completa. Al integrar nanofibras electrohiladas en una plataforma microfluídica centrífuga, logra una sensibilidad en el rango femtomolar en menos de 30 minutos, mejorando significativamente el límite de detección frente al ELISA convencional. Este avance apoya la validación de objetivos y la identificación de candidatos al reducir los falsos negativos en el cribado de proteínas de baja abundancia, impactando directamente en las decisiones de desactivación de riesgos en fases preclínicas y de priorización de carteras.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la detección de proteínas diana de baja abundancia en sangre completa, mejorando la confianza en las asociaciones entre dianas y enfermedades.
- Valor operativo: Reduce el consumo de muestra a 10 µL, lo que permite multiplexar especímenes clínicos valiosos en múltiples ensayos.
- Valor predictivo: El límite de detección en el rango femtomolar mejora la relación señal-ruido, facilitando una cuantificación más confiable de biomarcadores en flujos de trabajo de descubrimiento.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Proporciona una plataforma estandarizada y automatizada para el desarrollo de inmunoensayos con manipulación y mezcla de fluidos reproducibles.
- Valor operativo: Elimina los pasos manuales de pipeteo, reduciendo la variabilidad y aumentando el rendimiento en campañas de cribado de anticuerpos.
- Preparación del ensayo: Permite análisis multiplexados con consumo mínimo de reactivos, facilitando la validación de objetivos basada en paneles.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica al permitir la cuantificación consistente de proteínas en diferentes tipos y volúmenes de muestras.
- Reducción de Riesgos: La alta sensibilidad disminuye la probabilidad de pasar por alto señales farmacocinéticas o farmacodinámicas tempranas en modelos de enfermedad.
- Utilidad Preclínica: Compatible con volúmenes sanguíneos pequeños de animales, lo que permite estudios longitudinales sin necesidad de muestreo terminal.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en la fase inicial del descubrimiento, apoyando la validación de dianas guiada por hipótesis mediante la detección cuantitativa de proteínas en matrices clínicamente relevantes.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la reducción de riesgos mecanicistas al permitir la detección de biomarcadores específicos de vías en sangre completa, mejorando la confianza en el blanco.
- Selección: Ofrece un rendimiento de inmunoensayo listo para automatización con medición precisa de fluidos y lavados, esencial para la validación reproducible de hits.
- Análisis: Genera lecturas cuantitativas quimioluminiscentes en seis órdenes de magnitud, permitiendo comparaciones precisas de la expresión proteica entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Facilita la alineación de biomarcadores mediante la detección de proteínas clínicamente relevantes (por ejemplo, PCR, cTnI) en sangre mínimamente procesada.
- Reutilización Empresarial: El diseño de laboratorio-en-un-disco permite la adaptación de la plataforma a diferentes inmunoensayos, promoviendo la estandarización de reactivos y flujos de trabajo.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva en la validación de objetivos mediante límites de detección y rango dinámico mejorados.
- Valor operativo: La automatización completa reduce el tiempo de manipulación manual y la variabilidad entre usuarios, mejorando la reproducibilidad del ensayo entre diferentes centros.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones de avance o interrupción del desarrollo basadas en datos robustos de biomarcadores obtenidos a partir de muestras limitadas, reduciendo el riesgo de abandono en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Facilita el avance ajustado al riesgo al proporcionar una cuantificación confiable de objetivos de baja abundancia en las primeras etapas del proceso.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en electrohilado, manipulación de nanofibras y diseño de microfluidos para una fabricación exitosa.
- Depende del acceso a fresado CNC, tratamiento con plasma y equipos de vacío para la preparación del disco y la manta de nanofibras.
- Necesita la estandarización de los protocolos de recubrimiento y curado de PDMS para garantizar una adhesión consistente de las nanofibras entre lotes.
- La adaptación a dianas proteicas alternativas requiere una reoptimización de la química superficial y de las condiciones de incubación.
- Las limitaciones prácticas incluyen la necesidad de condiciones ambientales controladas durante la transferencia de nanofibras y la posible variabilidad en la uniformidad de la manta de fibras.
