Name: Totalmente automatizada de dispositivos de microfluidos para centrífuga Ultrasensible detección de proteínas a partir de sangre entera (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Aprende a detectar proteínas con sensibilidad femtomolar en sangre completa mediante un dispositivo microfluídico automatizado con nanofibras de dióxido de titanio integradas en plataforma lab-on-a-disc.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) subvenciones (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), una subvención de la tecnología de la salud R coreana + D Proyecto, Ministerio de Salud y Bienestar Social (A121994) y el SII-R020-D1 financiado por el Gobierno de Corea.

NOTA: Se extrajo sangre de individuos sanos y se recogió en un tubo de recogida de sangre. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los voluntarios. 1. La fabricación de TiO2 NF Mat <ol><li> Preparación de solución de precursor 22 <ol><li> Disolver 1,5 g de tetraisopropóxido de titanio (TTIP) en una mezcla de etanol (99,9%, 3 ml) y ácido acético glacial (3 ml) y se mezcla la solución a temperatura ambiente (25 ° C) durante 30 min en un agitador magnético. </li><li> Disolver 11% en peso de polivinilpirrolidona (PVP) en 3,64 g de etanol (99,9%) y se agita la solución a 65 ° C durante 1 hora usando un agitador magnético de la placa caliente. </li><li> Combinar y agitar las dos soluciones a 65 ° C durante 4 horas en un agitador magnético de la placa caliente. </li></ol></li><li> electrospinning <ol><li> Cargar la solución preparada en una jeringa conectada a una aguja de acero inoxidable de 200 micras Diame interiorter. Verter la solución directamente en la jeringa después de retirar el émbolo. </li><li> Introducir la solución constantemente a una velocidad de flujo de 0,3 ml / h durante 10 min sobre una oblea de Si (2 cm x 2 cm) se coloca sobre un sustrato conectado a tierra a un voltaje DC elevado (15 kV). Durante el electrospinning, ajustar la distancia entre la aguja y el sustrato de tierra a 10 cm. </li></ol></li><li> La calcinación de la estera de NF <ol><li> Coloca la base de NF en un horno y aumentar la temperatura hasta 500 ° C con una tasa de rampa de 3 ° C / min en condiciones de alto vacío (5 x 10 -5 torr). </li><li> Mantener la temperatura a 500 ° C durante 3 hr. Enfriar la temperatura de las muestras a la RT (25 ° C) en el horno. </li></ol></li></ol> 2. Integración de TiO2 NF Mat en una centrífuga de discos de microfluidos <ol><li> La fabricación de un disco <ol><li> Utilice el software de diseño 3D (por ejemplo, SolidWorks o similar) para representar cámaras, canales, o válvulas de cada capa de disco. Convertir los archivos de diseño a código informático de control numérico (CNC) utilizando el código de generación de software (por ejemplo, Edgecam o similar). Utilizar los softwares de acuerdo con el manual de instrucciones 23,24 Nota:. Las dimensiones de los canales típicos utilizados en este dispositivo son de 1,0 mm x 0,3 mm (anchura x profundidad). </li><li> Abra el software de funcionamiento de la máquina fresadora CNC (por ejemplo., DeskCNC o similar) y cargar el código CNC para el software operativo y haga clic en el siguiente orden: &quot;AUTO&quot; -&gt; &quot;G CÓDIGO ABIERTO&quot; -&gt; Seleccione el código CNC generado. </li><li> Fije la placa de PC en la máquina fresadora CNC: utilizar placas de 1 mm de PC para la capa superior y placas de PC 5 mm para la capa de disco. Hacer funcionar la máquina fresadora CNC para cortar cada capa del disco haciendo clic en el botón &quot;START&quot;. </li></ol></li><li> Transferencia de TiO 2 NF estera en el disco<ol><li> Colocar un sustrato de silicio y una pequeña placa de Petri que contiene 40 l de (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) -1-triclorosilano en una cámara de vacío bajo vacío durante 30 min. El fluorosilano se vaporiza y se reviste sobre el sustrato. </li><li> Mezclar polidimetilsiloxano (PDMS) pre-polímero con un agente de curado en una relación de 10: 1 y desgasificar en una cámara de vacío. Spin-capa de PDMS sobre un sustrato de silicio a 650 rpm durante 60 segundos. </li><li> Curar los PDMS revestidas sobre el sustrato de silicio en un horno a 65 ° C durante 10 min para lograr un estado adherente. NOTA: Tiempo de curado se puede variar dependiendo de las condiciones ambientales, y la fuerza de adhesión puede ser probada mediante un ensayo de pegajosidad utilizando un reómetro. </li><li> La transferencia de la estera de TiO2 NF preparado por electrospinning y calcinación en la silicona PDMS-revestidas utilizando una pinza. A continuación, aplicar manualmente una presión conforme en el TiO2 NF estera transferido con un objeto plano (por ejemplo., Portaobjetos de vidrio) y extraer el objeto. Poneresta muestra en el horno a 65 ° C durante 4 horas o a 80 ° C durante 1 hora para curar la capa de PDMS completamente. </li><li> Escudo cámaras de reacción de unión en el disco con 20 l el / curado mezcla de agente de PDMS (10: 1), que actúa como una capa adhesiva para fijar TiO 2 NF estera en el disco. </li><li> Dispensar 50 l de etanol (99,9%) sobre el TiO 2 NF estera en la capa de PDMS, cortar la estera de NF con una perforación de orificios de 6 mm de diámetro, y transferir el corte TiO 2 NF estera a las cámaras de reacción de unión recubiertas con 20 l de los PDMS en el paso anterior. NOTA: En este paso, el etanol será útil para separar el corte TiO2 NF estera del sustrato de Si. </li><li> Incubar el TiO2 NF esterilla integrada en el disco en el horno a 65 ° C durante 4 horas o a 80 ° C durante 1 hora para curar el PDMS por completo. </li></ol></li><li> Modificación de la superficie del TiO2 NF estera en el disco <ol><li> Prepare 1% v / v de (3-glicidoxipropil) silano methyldiethoxy (GPDES) en etanol (99,9%). </li><li> Se trata el disco integrada TiO2 NF estera con plasma de oxígeno a 140 W, el flujo de oxígeno de 50 sccm de 180 seg. Dispensar 100 l de solución de GPDES en cada estera de nanofibras y se incuba a RT (25 ° C) durante 2 hr. </li><li> Lavar el sustrato brevemente por la dispensación de etanol (99,9%) usando una botella de lavado, a continuación, eliminar el etanol completamente invirtiendo el disco y secante contra una toallita limpia. De curado a 80 ° C durante 1 hr. Lavar dos veces con etanol (99,9%) de la misma manera como se indicó anteriormente, para eliminar las moléculas adsorbidas físicamente GPDES y no unidos. </li><li> Secar con una corriente de nitrógeno, seca al vacío. NOTA: El disco puede ser almacenado en un recipiente sellado a temperatura ambiente (25 ° C) hasta su uso. </li></ol></li><li> Inmovilización de anticuerpos sobre la superficie <ol><li> Hacer una solución de 200 g / ml de anticuerpos de captura (anti ratón monoclonalhsCRP humano o de ratón monoclonal anti-cTnI) diluyendo los anticuerpos con un tampón de fosfato salino tamponado (PBS) (pH 7,4). Dispensar 5 l de la solución sobre cada estera de NF en un disco utilizando una micropipeta. Ver la lista de materiales para obtener más información acerca de los anticuerpos. </li><li> Mantener los discos en una cámara humidificada y se incuba a 37 ° C durante 4 h. Lavar los anticuerpos recubiertos NF estera con tampón PBS-BSA al 0,1%. Llenar la cámara con 100 l de tampón de lavado utilizando una micropipeta, eliminar el tampón por aspiración o decantación. Por último, invertir el disco y borrar contra un trapo limpio, y luego montar el disco. </li></ol></li><li> conjunto de discos <ol><li> Dibujar el diseño del disco en la cinta adhesiva de doble lado con un programa de CAD (por ejemplo, AutoCAD o similar). Cargar el diseño CAD para el plotter de corte. </li><li> Cortar la cinta adhesiva de doble cara utilizando el plotter de corte. Pelar una capa de protección de la cinta adhesiva de doble y adjuntar it en la parte superior de la capa de disco. Despegar la otra capa de protección y unir la capa superior de la capa de disco. </li><li> Cargar el disco montado de forma preliminar en la máquina de prensado y alinear con precisión las capas superior / adhesivo / disco utilizando las marcas de alineación en cada capa para conectar cada una de las válvulas, canales y cámaras. Aplique presión conforme el uso de la máquina de prensado. </li></ol></li></ol> 3. Inmunoensayo <ol><li> Llenar las cámaras con tampón BSA-PBS al 1% utilizando una micropipeta y se incuba el disco a 37 ° C durante 1 hr. Eliminar el tampón por aspiración utilizando una micropipeta. Realice este paso para bloquear los sitios sin reaccionar y para reducir la adsorción no específica de la proteína en un disco. </li><li> Lavar dos veces con 0,1% BSA-PBS por llenado y aspiración de las cámaras utilizando una micropipeta. NOTA: En esta etapa el disco se puede almacenar a 4 ° C hasta su uso. </li><li> Carga de 10 l de sangre entera antígeno-enriquecida o suero libre de PCR para la detección de la PCR en el disco utilizando un micropipettmi. Para hacer los gráficos de calibración, utilizar concentraciones de CRP de 1 pg / ml a 100 ng / ml; y cTnI de 10 pg / ml a 100 ng / ml. Nota: debido a los mayores niveles de CRP en la sangre total, que es generalmente en el rango de M, se utilizó suero libre de CRP para demostrar el bajo límite de detección del dispositivo. </li><li> Girar el disco a 3600 rpm (391 xg) durante 60 segundos para separar las células de sangre rojas. </li><li> Abrir la válvula # 1 por la irradiación con láser, y la transferencia de 4 l de plasma sobrenadante a la cámara que contiene 8 l de la detección de anticuerpos conjugados con HRP haciendo girar el disco a 2400 rpm durante 3 seg. NOTA:. Los procesos generales de actuación de la válvula y la visualización de la operación de disco se describen en detalle en un informe anterior 21 </li><li> Aplicar un modo de mezcla (15 Hz s -1, 15 °) durante 5 segundos para la unión de los anticuerpos de proteínas y detección. </li><li> Abrir la válvula # 2, y transferir la mezcla preparada en la etapa 6 a la cámara de reacción de unión (2400 rpm, 3 seg). A continuación, aplicar un modo de mezcla (60 Hz s -1, 2 °) durante 20 minutos para lograr una inmunoreacción entre la mezcla y los anticuerpos de unión en los TiO 2 NFS. Después de la reacción, la válvula abierta # 3 y transferir la mezcla residual a la cámara de residuos (2.400 rpm, 10 sec). </li><li> Transferir el tampón de lavado (600 l) a la cámara de reacción de unión mediante la apertura de la válvula # 4 y hace girar el disco (2400 rpm, 4 segundos). A continuación, aplicar un modo de mezcla (30 Hz s-1, 30 °) durante 120 segundos para lavar las federaciones nacionales de TiO2 en la cámara. </li><li> Se lavan las federaciones nacionales de TiO2 dos veces más siguiendo misma condición del paso 3.8, y eliminar el tampón de lavado residual por completo haciendo girar el disco a 2.400 rpm durante 20 segundos. A continuación, cierre la válvula # 5. </li><li> Para la reacción quimioluminiscente, aplicar un modo de mezcla (30 Hz s -1, 2 °) durante 1 min después de la transferencia de la solución de sustrato quimioluminiscente a la cámara de reacción de unión mediante la apertura de la válvula # 6 e hilaturael disco a 2400 rpm durante 10 seg posteriormente. </li><li> Transferir la solución de sustrato reaccionado a las cámaras de detección mediante la apertura de la válvula # 7 y girando el disco a 2400 rpm durante 10 s. </li><li> Medir las señales de quimioluminiscencia de la solución de sustrato reaccionado usando un tubo fotomultiplicador (PMT) módulo equipado sistema de detección. NOTA: El sistema de detección es una máquina hecha a la medida usando las siguientes partes: motor paso a paso, los componentes óptico-mecanicos, platinas de traslación, y PMT disponible en el mercado. Las partes y óptico-motor paso a paso se ensamblan para mantener el dispositivo, y el motor puede girar el disco. La detección se realiza por PMT fija en las partes óptico-mecanicos, y se encuentra por encima de las cámaras de detección del dispositivo. Mediante la manipulación del motor paso a paso, las cámaras de detección están alineados justo debajo de la zona de detección de PMT. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El ensayo en TiO 2 NF disco integrado es una técnica rápida, de bajo costo y conveniente para la detección ultrasensible de proteínas de baja abundancia presentes en muy bajo volumen de sangre. Esta técnica tiene la ventaja de usar pequeños volúmenes de muestra (10 l) y es susceptible para el análisis de múltiples muestras simultáneamente. Esto proporciona un gran potencial como un dispositivo de multiplexación inmunoensayo. El dispositivo tiene la ventaja de que no requiere etapas de pretratamiento de la mue...

Varias plataformas para el diagnóstico de la enfermedad se han desarrollado sobre la base de materiales a nanoescala 1,2 tales como nanocables, 3 nanopartículas, nanotubos de 4, 5 y nanofibras (NFS) 6-8. Estos nanomateriales ofrecen excelentes perspectivas en el diseño de nuevas tecnologías para bioensayos altamente sensibles debido a sus propiedades físico-químicas únicas. Por ejemplo, las nanofibras de óxido de zinc mesoporoso se han utilizado para la detección sensible femto-molar de biomarcadores de cáncer de mama. 9 Recientemente, los nanomateriales a base de dióxido de titanio (TiO 2) han sido exploradas para aplicaciones bioanalíticos 10 teniendo en cuenta su estabilidad química, 11 desnaturalización de la proteína insignificante , 12 y biocompatibilidad. 13 Además, los grupos hidroxilo en la superficie de TiO 2 facilitar la modificación química y la unión covalente de biomoléculas. 14,15 modelado TiO 2 thin películas 16 o TiO 2 nanotubos 17 se han utilizado para mejorar la sensibilidad de detección de una proteína diana por aumento de la superficie; sin embargo, el proceso de fabricación es bastante complejo y requiere un equipo caro. Por otra parte, las federaciones nacionales electrospun están recibiendo atención debido a su gran área de superficie, así como proceso sencillo y fabricación de bajo costo; 18,19 sin embargo, la característica frágiles o suelto de la electrospun TiO2 NF tapete hace que sea difícil de manejar y integrar con los dispositivos de microfluidos. 6,20 por lo tanto, las esteras de TiO2 NF rara vez se utilizan en aplicaciones de bioanálisis, particularmente aquellos que requieren condiciones de lavado agresivos. En este estudio, para superar estas limitaciones, hemos desarrollado una nueva tecnología para la transferencia de la electrospun NF esteras sobre la superficie de cualquier sustrato diana mediante la utilización de una capa de adhesivo de polidimetilsiloxano delgada (PDMS). Furthermore, hemos demostrado con éxito la integración de electrospun TiO 2 NF esteras en un dispositivo de microfluidos centrífuga de policarbonato (PC). El uso de este dispositivo, una detección de alta sensibilidad, totalmente automatizado e integrado de la proteína C-reactiva (CRP), así como la troponina I cardíaca (cTnI) se logró en 30 min a partir de solamente 10 l de sangre entera. 21 Debido a la combinación ventajas de las propiedades de los NF y la plataforma centrífuga, el ensayo exhibieron una amplia gama dinámica de seis órdenes de magnitud de 1 pg / ml (~ 8 fM) a 100 ng / ml (~ 0,8 pM) con un límite inferior de detección de 0,8 pg / ml (~ 6 fM) para la PCR y un rango dinámico de 10 pg / ml (~ 0,4 pM) a 100 ng / ml (~ 4 nM) con un límite de detección de 37 pg / ml (~ 1,5 pM) de cTnI. Estos límites de detección son ~ 300 y ~ 20 veces menor en comparación con sus correspondientes resultados de ELISA convencionales. Esta técnica se podría aplicar para la detección de cualquier proteína objetivo, con los anticuerpos apropiados. En general, este dispositivo de coULD contribuyen en gran medida en el diagnóstico in vitro y ensayos bioquímicos ya que puede detectar cantidades raras de proteínas diana con gran sensibilidad incluso de cantidades muy pequeñas de muestras biológicas, por ejemplo, 10 l de sangre entera. A pesar de que sólo demostró la detección de proteínas de suero usando ELISA en este estudio, la tecnología de transferencia e integración de electrospun NFS con dispositivos de microfluidos podría aplicarse más ampliamente en otras reacciones bioquímicas que requieren una gran área superficial para la alta sensibilidad de detección.

<table><tbody><tr><td>Oblea de Si</td><td>LG SILTRON</td><td>Oblea pulida, grado de prueba</td><td>Diámetro (mm) = 150, orientación = < 100>, dopante = boro, RES (Ohm-cm) = 1 - 30, espesor (&mu; m) = 650 - 700</td></tr><tr><td>Policarbonato (PC)&nbsp;</td><td>Daedong Plástico</td><td>PCS#6900</td><td>Espesor (mm) = 1 y 5&nbsp;</td></tr><tr><td>Tetraisopropóxido de titanio, 98%,</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>205273</td><td></td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidona, Mw = 1.300.000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437190</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>Etanol anhidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctilo)-1-triclorosilano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>PDMS y agente de curado</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>GPDES</td><td>Gelest Inc</td><td>SIG5832.0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>J T Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FE-SEM</td><td>FEI</td><td>Nova NanoSEM</td><td></td></tr><tr><td>Espectroscopía de fotoelectrones de rayos X</td><td>ThermoFisher</td><td>K-alpha</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de modelado 3D</td><td>M& I Laboratorio CNC, Corea</td><td></td><td>Fresadora CNC</td></tr><tr><td>Máquina dispensadora de cera</td><td>Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Corea</td><td></td><td>Cinta</td></tr><tr><td>adhesiva de doble cara</td> personalizada <td>FLEXcon, EE. UU.</td><td>DFM 200 transparente 150 POLY H-9 V-95</td><td></td></tr><tr><td>Plotter de corte</td><td>Graphtec Corporation, Japón</td><td>Graphtec CE3000-60 MK2</td><td></td></tr><tr><td>Barnizadora</td> giratoria <td>MIDAS</td><td>SPIN-3000D</td><td></td></tr><tr><td>Horno (calcinación)</td><td>R. D. WEBB COMPANY</td><td>WEBB 99</td><td></td></tr><tr><td>Reómetro (prueba de pegajosidad)</td><td>Thermo Scientific</td><td>Haake MARS&nbsp; III - Paquete</td><td></td>ORM</tr><tr><td>Sistema de plasma de oxígeno</td><td>FEMTO</td><td>CUTE</td><td></td></tr><tr><td>Ratón monoclonal antihumano hsCRP</td><td>Hytest Ltd., Finlandia</td><td>4C28</td><td>(clon # C5)</td></tr><tr><td>Ratón monoclonal anti-cTnI</td><td>Hytest Ltd., Finlandia</td><td>4T21</td><td>(clon # 19C7)</td></tr><tr><td>HRP conjugado cabra policlonal anti-hsCRP</td><td>Abcam plc., MA</td><td>ab19175</td><td></td></tr><tr><td>HRP ratón monoclonal conjugado anti-cTnI</td><td>Abcam plc., MA</td><td>ab24460</td><td>(clon # 16A11)</td></tr><tr><td>hsCRP</td><td>Abcam plc., MA</td><td>ab111647</td><td></td></tr><tr><td>cTnI</td><td>Fitzgerald, MA</td><td>30-AT43</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Amresco Inc</td><td>E404</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de extracción de sangre</td><td>BD vacutainer</td><td>367844</td><td>K2 EDTA 7,2 mg más tubos de recogida </td></tr><tr><td>SuperSignal ELISA femto</td><td>Invitrogen</td><td>37074</td><td></td></tr><tr><td>Lector de placas multietiqueta modular</td><td>Perkin Elmer</td><td>Envision 2104</td><td></td></tr><tr><td>Máquina operativa de disco</td><td>Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Corea</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo fotomultiplicador personalizado (PMT)</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>H1189-210</td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>AutoDesk</td><td>versión 2012</td><td>Software</td></tr><tr><td>de diseño SolidWorks Software CAD 3D&nbsp;</td><td>SOLIDWORKS Corp.</td><td>Versión 2013</td><td>Software de diseño 3D,Edgecam</td></tr> <tr><td></td><td>Vero software</td><td>versión 2009.01.06928</td><td>Software de generación de código</td></tr><tr><td>DeskCNC</td><td>Carken Co.</td><td>versión 2.0.2.18</td><td>Software de la fresadora CNC</td></tr></tbody></table>

totalmente automatizada de dispositivos de microfluidos para centrífuga ultrasensible detección de proteínas a partir de sangre entera

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

El ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) es un método prometedor para detectar pequeñas cantidades de proteínas en muestras biológicas. Los dispositivos que proporcionan una plataforma para reducir el volumen de muestra y el tiempo de ensayo, así como la automatización completa, son necesarios para su uso potencial en el diagnóstico en el punto de atención. Recientemente, hemos demostrado la detección ultrasensible de proteínas séricas, proteína C reactiva (PCR) y troponina I cardíaca (cTnI), utilizando un laboratorio en un disco compuesto por esteras nanofibrosas (NF) deTiO2. Mostró un amplio rango dinámico con sensibilidad de detección femtomolar (fM), a partir de un pequeño volumen de sangre total en 30 min. El dispositivo consta de varios componentes para la separación, medición, mezcla y lavado de sangre que están automatizados para mejorar la sensibilidad a partir de volúmenes de muestra bajos. Aquí, en el vídeo de demostración, mostramos los protocolos experimentales y los conocimientos para la fabricación de NFs, así como del disco, su integración y el funcionamiento en el siguiente orden: procesos de preparación de la estera de TiO2 NF; impresión por transferencia de la estera TiO2 NF en el disco; modificación de la superficie para las reacciones inmunitarias, el montaje y el funcionamiento del disco; Detección en disco y resultados representativos para inmunoensayo. El uso de este dispositivo permite el análisis multiplexado con un consumo mínimo de muestras y reactivos. Dadas las ventajas, el dispositivo debería encontrar uso en una amplia variedad de aplicaciones y resultar beneficioso para facilitar el análisis de proteínas de baja abundancia.

El uso de este protocolo, un dispositivo de microfluidos centrífuga totalmente automatizado para la detección de proteínas de la sangre total se preparó con una alta sensibilidad. Las esteras de TiO2 NF fueron preparados por los procesos de electrospinning y calcinación. Con el fin de fabricar el FNs de diámetro deseado, la morfología y espesor, electrospinning condiciones tales como velocidad de flujo, tensión, y el tiempo de hilado fueron optimizados. Cuando las condiciones ...

Este protocolo demuestra cómo lograr la sensibilidad de detección femtomolar de proteínas en 10 μL de sangre total en 30 min. Esto se puede lograr mediante el uso de esteras nanofibrosas electrohiladas integradas en un laboratorio en un disco, que ofrece una gran área de superficie, así como una mezcla y un lavado efectivos para mejorar la relación señal-ruido.

Totalmente automatizada de dispositivos de microfluidos para centrífuga Ultrasensible detección de proteínas a partir de sangre entera

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

El objetivo general de este procedimiento es mejorar la sensibilidad de detección de ELISA utilizando nanofibras naturales hiladas. Este video demuestra cómo lograr la sensibilidad de detección femtomolar de proteínas en 10 microlitros de muestras de sangre completa en 30 minutos. En una plataforma de laboratorio en un disco, la fuerza centrífuga se utiliza para transferir el líquido a través de las cámaras, y todo el proceso está completamente automatizado.La sensibilidad de detección podría mejorarse en gran medida mediante la integración de nanofibras. Sin embargo, el problema es que la nanofibra es muy frágil y difícil de manipular. En este vídeo, presentamos un proceso sencillo para unir frágiles esteras de nanofibras de dióxido de titanio en un disco de plástico.Para fabricar esteras de nanofibras de dióxido de titanio sobre sustrato de silicona mediante electrohilado, el sustrato de silicona primero se silaniza, se recubre con PDMS y se precura. A continuación, se transfiere una estera de nanofibras a este PDMS precurado y este producto se perfora para producir una pieza circular para su fijación. Cubra la cámara de reacción con una gota de PDMS como adhesivo y fije la pieza circular al fondo de la cámara.Luego, cure el PDMS en el horno. Finalmente, ensamble las capas de disco en un dispositivo completo para ELISA. Esta técnica de transferencia de nanofibras nos permite utilizar la alta superficie de las nanofibras para el bioanálisis.El dispositivo microfilítico centrífugo ofrece la integración y automatización completas de todo el proceso requerido en ELISA. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos existentes es que permite detectar concentraciones femtomolares de proteínas a partir de tan solo 10 microlitros de sangre total. Prepare las soluciones precursoras tal como se describe en el protocolo de ensayo adjunto.A continuación, cargue la solución en el electrohilador y fabrique las nanofibras mediante electrohilado, utilizando las condiciones óptimas. Cuando se preparen las esteras de nanofibras poliméricas, calcinarlas en un horno al vacío. Después de la calcinación, finalmente se preparan las esteras de nanofibras de dióxido de titanio.Prepare el diseño microfilítico mediante el uso de software de diseño 3D como SOLIDWORKS y transfiera el diseño a la fresadora CNC. Opere la fresadora CNC para fabricar el disco con canales y cámaras. El disco y la estera de nanofibras ya están listos para ser integrados.Prepare una cámara de vacío, sustrato de silicona y fluorosilano. Silanizar el sustrato de silicona con fluorosilano al vacío durante 30 minutos. Prepare el PDMS invitado preparando el prepolímero con un agente de curado en una proporción de 10 a uno, y centrifuga la capa sobre el sustrato de silicona silanizada a 650 RPM durante 60 segundos.Cura el PDMS recubierto de la oblea silanizada a 65 grados centígrados durante 10 minutos para que quede adhesivo. Ahora transfiera esas esteras de nanofibras a la silicona recubierta de PDMS aplicando la presión adecuada con un objeto plano como un portaobjetos de vidrio. Hornee la muestra a 80 grados centígrados durante una hora para curar completamente el adhesivo PDMS.Dispense unas gotas de etanol en las esteras de nanofibras unidas a la capa de PDMS y haga un agujero de seis milímetros de diámetro con un PunchIt. A continuación, retire las esteras de nanofibras perforadas unidas al PDMS del sustrato de silicona. A continuación, cubra la cámara de reacción de unión en el disco con unos 20 microlitros de mezcla de PDMS y coloque las nanofibras unidas al PDMS en las cámaras.A continuación, incuba el disco integrado en la estera de nanofibras a 80 grados centígrados durante una hora. Prepare una solución de 1% de volumen por volumen de GPDES en etanol. A continuación, trata las nanofibras del disco con plasma de oxígeno.Dispense 100 microlitros de solución GPDES en cada estera de nanofibras e incube a temperatura ambiente durante dos horas en un recipiente sellado. Después de la incubación, retire la solución de GPDES golpeando el disco en un limpiaparabrisas. Lavar con etanol, retirar y hornear a 80 grados centígrados durante una hora.Después de hornear, lavar con etanol y golpear para quitar. Repita este proceso y seque con un chorro de nitrógeno. Para la inmovilización de anticuerpos, dispense una solución diluida de anticuerpos capturados.Mantenga los discos en una cámara humidificada e incube a 37 grados durante cuatro horas. Lave la solución restante con tampón de lavado. Ahora, ensambla el disco con una cinta adhesiva de doble cara.Aplique una presión razonable para ensamblar las capas en un disco completo. Llene las cámaras de reacción de unión con tampón de bloqueo e incube a 37 grados centígrados durante una hora. Lavar dos veces con tampón de lavado y guardar el disco a 40 grados centígrados hasta su uso.Cargue los reactivos, los tampones de lavado y 10 microlitros de sangre entera en las cámaras de reactivos y muestras. Coloque el disco en una máquina de visualización personalizada para el inmunoensayo automatizado. El sistema de visualización contiene un rotor conectado a un ordenador para el funcionamiento automatizado del disco junto con una luz estroboscópica y una cámara CCD para la toma de imágenes.Gire el disco a 3.600 RPM durante 60 segundos para separar los glóbulos rojos. Mezclar el plasma con los anticuerpos de detección. Transfiera la mezcla a la cámara de reacción integrada con estera de nanofibras de dióxido de titanio.Después de la inmunorreacción, lave las nanofibras transfiriendo el tampón de lavado a la cámara de reacción. Luego, transfiera la solución de sustrato quimioluminiscente a la cámara de reacción de unión e incube en modo de mezcla durante un minuto. Finalmente, transfiera la solución de sustrato reaccionado a la cámara de detección.Cuando termine toda la reacción, transfiera el disco a un sistema de detección y lea la señal quimioluminiscente mediante el uso de un software personalizado. El funcionamiento del disco y el sistema de detección pueden integrarse en una sola plataforma. Al optimizar el voltaje y el fluorato, se obtuvieron esteras de nanofibras uniformes como se muestra en esta imagen SEM.Con el fin de optimizar el tiempo de curado del PDMS, se midió la fuerza de adhesión. Si era demasiado corto, la estera de nanofibras se incrustaba en PDMS o se despegaba si era demasiado larga. Después de la optimización, la estera de nanofibras se fijó de manera estable en el PDMS.En este gráfico se muestra el rango lineal para la detección de proteínas C reactivas desde dos plataformas. Utilizando el laboratorio de integridad de nanofibras en el disco, pudimos lograr una sensibilidad de detección altamente mejorada de la proteína C reactiva a partir de solo 10 microlitros de suero en 30 minutos. Las tecnologías disponibles en la actualidad, como el ELISA basado en placas de 96 pocillos, requieren un mayor volumen de muestra y un tiempo de detección más largo.En general, el ELISA basado en disco integrado en nanofibras mostró un amplio rango dinámico de seis órdenes de magnitud con un límite de detección de seis femtomoles de proteína C reactiva. Esta sensibilidad de detección, ayudada por la alta superficie proporcionada por la nanofibra integrada en el disco, superó a la del ELISA convencional, que estaba limitado a 2.000 femtomoles. Después de ver este video, esperamos que tenga una buena comprensión de cómo preparar un dispositivo microfilítico centrífugo, cómo integrar nanofibras fasales y cómo realizar la detección de proteínas usando ELISA.Esta técnica puede ser útil para detectar proteínas de bajo enlace en una cantidad muy pequeña de muestras biológicas.

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Bioingeniería

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Plataforma de microfluídico digital basada en electrohumección para el ensayo automatizado de inmunoabsorbentes ligados a enzimas

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Totalmente automatizada de dispositivos de microfluidos para centrífuga Ultrasensible detección de proteínas a partir de sangre entera (Video) | JoVE Journal

Totalmente automatizada de dispositivos de microfluidos para centrífuga Ultrasensible detección de proteínas a partir de sangre entera

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