Creación de Sub-50 Nm nanofluídico uniones en PDMS microfluidos de chips VIA proceso de autoensamblaje de partículas coloidales

Este protocolo demuestra una técnica de autoensamblaje novedosa y simple de nanopartículas de sílice coloidal para crear una unión nanofluídica entre dos microcanales en polidimetilsiloxano. La membrana de perlas con un tamaño de poro de aproximadamente 45 nanómetros, que actúa como una membrana selectiva de cationes, se puede utilizar para la concentración electrocinética de muestras de ADN y proteínas. Resumen: En el primer paso, el dispositivo PDMS con nanotrampas se funde a través de un proceso de doble moldeo.

Después de unir el dispositivo con plasma a un sustrato de vidrio, se inyectan perlas de sílice funcionalizadas en la superficie en los microcanales para formar la membrana coloidal de autoensamblaje. Por último, se aplica un voltaje a través de la membrana utilizando un medidor de fuente y un divisor de voltaje. El agotamiento de iones y el aumento de la concentración se observan utilizando un microscopio de epifluorescencia invertida, con una cámara CCD.

Preparación de las suspensiones de partículas coloidales de sílice: Comenzando con las perlas de sílice de 300 nanómetros; material de cuentas de vórtice durante 30 segundos; retirar una suspensión de 600 microlitros en un tubo Eppendorf y centrifugar durante un minuto a 2.600 g. Después de la centrifugación, retire con cuidado el sobrenadante. Vuelva a suspender las perlas con 400 microlitros de tampón de fosfato de sodio de un milimolar, para alcanzar una concentración de trabajo del 15%.

Vórtice para alcanzar una suspensión homogénea. Repita los mismos pasos para preparar perlas de sílice de 500 nanómetros. Para perlas de sílice carboxílica de 500 nanómetros, pese 100 miligramos en un tubo Falcon de 15 mililitros.

Luego transfiera 9,8 mililitros de cloruro de sodio de un molar para resuspender las perlas. Agite el tubo vigorosamente. Invierta el tubo varias veces para desplazar las cuentas impactadas en la parte inferior.

Para modificar la carga superficial de las perlas, preparamos dos polielectrolitos: PAH y PSS. El PSS al 0,9% se prepara disolviendo 180 miligramos de PSS con 200 mililitros, cloruro de sodio de un molar. El 0,4% de HAP se prepara mezclando 300 microlitros de la solución madre en 15 mililitros de cloruro de sodio de un molar.

Agite ambas soluciones para asegurarse de que se disuelvan por completo. Para depositar una capa de HAP cargada positivamente, agregue 200 microlitros de la solución de HAP a la suspensión de perlas. Agite durante un minuto e incube la suspensión en un rotador durante una hora a temperatura ambiente.

Para eliminar los HAP no unidos, centrifugar la suspensión a 1,801 g durante un minuto, para precipitar las perlas. Retire el sobrenadante. Pipetea de uno a dos mililitros de agua en el tubo para romper las perlas.

Agregue los ocho mililitros restantes de agua y luego el vórtice. Repita el procedimiento de lavado cuatro veces más. Después del quinto lavado y centrifugación, deseche el sobrenadante y restaure las perlas con 9,8 mililitros de cloruro de sodio de un molar.

Para depositar la capa de PSS cargada negativamente, agregue 200 microlitros de la solución de PSS a la suspensión del cordón. Agite durante un minuto e incube la suspensión en el rotador durante una hora a temperatura ambiente. Lave las perlas cinco veces con agua desionizada como se hizo para el recubrimiento de HAP.

Después del último lavado, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las perlas con 650 microlitros de tampón de fosfato de sodio de un milimolar con 0.05% Tween 20. Transfiera la suspensión de cuentas a un tubo eppendorf. Para la preparación de las perlas de sílice de amina de 500 nanómetros, repita el mismo procedimiento para depositar una sola capa de PSS cargada negativamente.

Fabricación del chip microfluídico PDMS: Para fabricar el maestro de silicio, primero aplique una capa de rotación de un fotorresistente de un micrómetro de espesor a 4.000 RPM en una oblea de silicio. Luego, use la litografía de proyección y el grabado de iones reactivos para crear nanocanales planos de 700 nanómetros de profundidad y dos micrómetros de ancho como nanotrampas para las perlas. Luego, aplique una capa giratoria a la segunda capa fotorresistente a 2.000 RPM y realice una alineación con las nanotrampas previamente modeladas.

Agregue los microcanales a través de litografía de contacto y grabado iónico de silicio con reacción profunda. Para crear la capa de liberación, silanate el maestro de silicio en un frasco de vacío con 50 microlitros de triclorosilano, durante la noche. Para fundir el molde PDMS, mezcle la base PDMS con agente de curado en una proporción de 10:1.

Vierta la mezcla sobre el maestro de silicona. Coloque el maestro con PDMS en un frasco de vacío para eliminar las burbujas de aire y hornee en el horno a 70 grados C para reticular el PDMS. Después de hornear durante dos horas, retire con cuidado la losa PDMS del maestro de silicona.

Trate la superficie con plasma para crear una unión permanente a una oblea de silicio en blanco. Coloque cinta adhesiva a lo largo del borde para marcar una línea de partición para el siguiente paso de fundición de PDMS. Para crear una capa de desmoldeo, silanate el molde PDMS en un frasco de vacío durante la noche.

Moldee PDMS encima del molde PDMS y transfiéralo a un frasco de vacío para desgasificarlo. Luego hornéalo en el horno. Despegue la losa de PDMS curada del molde de PDMS a lo largo de la línea de partición marcada con cinta adhesiva.

Corte los dispositivos con cuidado y haga agujeros con un punzón de biopsia de 1,5 milímetros en los depósitos. Después de limpiar la superficie con cinta adhesiva e IPA, el dispositivo PDMS se une con plasma en un portaobjetos de vidrio de microscopio de 25 milímetros por 75 milímetros. Inmediatamente después de la unión por plasma, inyecte 10 microlitros de la suspensión en las entradas cuatro y seis de los canales de suministro de perlas.

Después de llenar los canales de suministro de cordones, cubra todos los depósitos, excepto las salidas uno y nueve, de los canales de suministro de cordones. Seque el dispositivo al aire durante tres horas a temperatura ambiente y guárdelo a cuatro grados C antes de usarlo. Las micrografías del dispositivo muestran que las partículas coloidales se ensamblan dentro de los canales de suministro de perlas superior e inferior.

La imagen SEM muestra partículas coloidales de sílice de 300 nanómetros autoensambladas atrapadas con las matrices de nanotrampas, entre la muestra y el canal tampón. Llene las entradas tres y siete de los canales de tampón con 10 microlitros de tampón de fosfato de sodio de un milimolar. Llene la entrada cinco del canal de muestra con 10 microlitros de muestra de ADN de 10 nanomolares.

Aplique una suave presión negativa con una punta de pipeta invertida en todas las salidas para llenar los canales con las soluciones sin burbujas de aire. Agregue 10 microlitros de tampón de fosfato de sodio a los depósitos dos y ocho, y 10 microlitros de muestra de ADN al depósito 10, para estabilizar la presión durante cinco minutos. Experimento para la concentración electrocinética de ADN: Conecte el chip microfluídico con un divisor de voltaje conectado a un medidor de fuente.

Inserte los cables PT en los depósitos tres, siete, cinco y 10. Aplique voltaje a través de una unión nanofluídica. Primero aplique 30 voltios en los depósitos cinco y 10, y conecte a tierra en los depósitos tres y siete.

Disminuya el voltaje a 25 voltios en el depósito 10 después de aproximadamente 30 segundos. Resultados de la preconcentración electrocinética: El canal microfluídico está lleno de ADN, con una concentración inicial de 10 nanomolares. Las micrografías de lapso de tiempo muestran la formación de una región de agotamiento de iones, ya sea uniones coloidales nanofluídicas.

La región de agotamiento de iones se inició en 10 segundos. Se generó un enchufe de ADN concentrado cuando se aplicó el voltaje al canal de muestra, mientras que los canales de tampón se conectaron a tierra. Las líneas punteadas se han utilizado para resaltar las paredes del canal.

Se logra un factor de concentración de aproximadamente 1, 700 veces en 15 minutos utilizando una membrana coloidal de 300 nanómetros. La intensidad de fluorescencia promedio del ADN está aumentando en función del tiempo en un membrabe nanoporoso. Las líneas punteadas representan el nivel de señal para el ADN de 10 nanomolares, 17 micromolares, dos micromolares y 10 micromolares.

El tapón concentrado se genera en la membrana nanoporosa de las perlas de sílice de 300 nanómetros; las perlas de sílice de 500 nanómetros; las perlas de amina de sílice de 500 nanómetros, recubiertas con una sola capa de PSS; y las perlas de carboxilo de sílice de 500 nanómetros, recubiertas con dos capas de HAP y PSS. Conclusiones: Utilizando la membrana de sílice coloidal autoensamblada con un tamaño de poro estimado de 45 nanómetros, demostramos la polarización de la concentración de iones cerca de la unión nanofluídica y concentramos una muestra de ADN 1700 veces en 15 minutos. En comparación con los nanocanales basados en silicio, la principal ventaja de la membrana coloidal autoensamblada es la posibilidad de realizar la funcionalización de la superficie completamente fuera del dispositivo microfluídico sellado, en un vial separado.

Creemos que este enfoque abre la posibilidad de fabricar una plataforma micro nanofluídica rápidamente con tamaños de poro fácilmente ajustables, controlando el tamaño de la perla, la fuerza iónica o el valor de pH de la solución tampón para estudiar el transporte iónico y molecular en el rango de 10 a 100 nanómetros.