Name: Los métodos para aguda y subaguda murino de isquemia del miembro posterior (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Aprenda a inducir isquemia aguda y subaguda en el miembro posterior de ratones mediante constricciones ameroides en la arteria femoral. Este método permite controlar la severidad de la oclusión arterial para estudiar la angiogénesis y la enfermedad arterial periférica.

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Este estudio fue financiado por las subvenciones de los NIH R21HL118661, R56HL124444 y R01HL124444 a CDK, y por las subvenciones de los NIH R00HL103797 y R01HL125695 a JMM.

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el protocolo aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de Duke. Los ratones machos se utilizaron en este estudio, aunque se puede utilizar cualquier sexo, como se indica con el fin científico del estudio. 1. Depilación <ol><li> Antes de la inducción de la anestesia, establecer un área de preparación de pre-quirúrgico que consiste en una resistencia de calentamiento cubierto fijado en 37 ° C y un puerto de ojiva conectado a flujo continuo de isoflurano. </li><li> Coloque el ratón en la cámara de inducción de la anestesia. Ajuste el medidor de flujo de O 2 a 1 L / min e isoflurano al 1-3%. NOTA: La anestesia se induce típicamente en un 25 g de ratón con isoflurano al 2%. </li><li> Comprobar la respuesta de estímulo del ratón moviendo suavemente la cámara y la observación de la falta de un reflejo de enderezamiento. </li><li> Enjuague la cámara con O 2 para borrar el isoflurano antes de la apertura. Mueve rápidamente el ratón para el calentamiento panuncio y conectarlo con isoflurano a través de la ojiva. </li><li> Ajuste el isoflurano al 1,5%. Marque la respuesta de estímulo por el pedal del reflejo (pizca dedo del pie). </li><li> Aplicar lubricante oftálmica generosamente en ambos ojos para evitar que se seque durante la cirugía. </li><li> Afeitar el vello de las dos extremidades traseras mediante un pequeño condensador de ajuste eléctrico. Manteniendo la piel tirante mientras se afeita para evitar lacerar la piel. </li><li> Aplicar crema de depilación pre-calentado y dejar reposar durante 1 minuto. Limpie suavemente usando una gasa humedecida. </li><li> Para el procedimiento quirúrgico en un momento posterior, apague el isoflurano y mueva el ratón a una jaula de recuperación toalla forrado de papel vacío para asegurar el ratón no aspirar la ropa de cama de la jaula. Supervisar el animal hasta que es capaz de mantener decúbito esternal. De lo contrario, mueva el ratón a la mesa de operaciones. NOTA: El proceso de eliminación del vello puede irritar la piel y afectar a las mediciones de perfusión. Se recomienda esperar 1 - 2 días después de eliminar el pelo del animal antes de performing una gammagrafía de perfusión previa a la cirugía o la realización de la cirugía. </li></ol> 2. Preparación prequirúrgica <ol><li> Utilizar las siguientes herramientas durante este procedimiento; pequeñas tijeras quirúrgicas rectas, 2 pinzas de ángulo de punta fina, pequeñas pinzas, fórceps Graefe portaagujas 3, retractores, pequeñas tijeras de primavera, y bastoncillos de algodón de punta fina. </li><li> Esterilizar todas las herramientas utilizando un autoclave antes de la iniciación de la cirugía. Utilizar un esterilizador-grano caliente antes y entre cada procedimiento quirúrgico, para un máximo de 5 animales. Esterilizar los paquetes de herramientas quirúrgicas adicionales para intervenciones quirúrgicas en grupos de más de 5. </li><li> Preparar un campo quirúrgico estéril que consiste en una almohadilla de calefacción cubierta y un puerto de isoflurano. Realizar todo el trabajo bajo un microscopio de disección 10 estéreo. </li><li> Anestesiar y preparar el ratón como se describe en los puntos 1.1 a 1.5. </li><li> Compruebe que el ratón está completamente sedado y coloque en una posición de decúbito supino sobre la mesa de operaciones. Fije las dos piernas con cinta quirúrgica. &lt;/ Li&gt; <li> Si se utiliza una resistencia de calentamiento de temperatura controlada, conecte la sonda de temperatura y fijarlo a la base de la plataforma quirúrgica utilizando cinta quirúrgica para asegurarse de que no se desconecta accidentalmente durante el procedimiento. </li><li> Limpiar el sitio de la incisión utilizando 3 alternantes de povidona yodada y alcohol toallitas. Cubrir el animal con un paño quirúrgico estéril y cortar un agujero para exponer el sitio de la incisión. </li></ol> 3. La inducción de isquemia de extremidades <ol><li> Utilice un bisturí para realizar una incisión inicial a lo largo del centro del muslo medial, que va desde la rodilla hacia el abdomen, y alargar la incisión para aproximadamente 1 cm con unas tijeras finas (Figura 1A). </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54166/54166fig1.jpg" /> Figura 1. Sitio Quirúrgico y vasculares anatómicas Puntos de referencia para la cirugía de ratón del miembro posterior isquemia. (A) Vista externa della extremidad posterior de un ratón en la posición supina. La línea discontinua indica el lugar de la incisión para realizar correctamente los procedimientos de las extremidades posteriores de isquemia. (B) Vista de la vasculatura proximal del miembro posterior del ratón. El extremo proximal de la arteria femoral (FA) surge de debajo del ligamento inguinal (IL). El extremo distal de la FA está situada en su bifurcación en la arteria poplítea (PA) y la arteria safena (SA). Las principales arterias colaterales fuera de la FA son la arteria circunfleja femoral lateral (LCFA), la arteria femoral caudal proximal (PCFA), y la arteria epigástrica caudal superficial (SCEA). La vena femoral (VF) se extiende adyacente a la FA, y las ramas venosas se puede ver en paralelo a las principales ramas arteriales. Los asteriscos (*) indican los sitios proximal y distal para la colocación de constrictor ameroide o ligaduras, dependiendo de si se inducirán subaguda o isquemia aguda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54166/54166fig1large.jpg" target="_blank">Por favor cli</a>ck aquí para ver una versión más grande de esta figura. <ol start="2"><li> Con unas pinzas, abrir la incisión y exponer la membrana que cubre el tejido de grasa inguinal (IFT). </li><li> Usando forceps-cerradas, perfore a través de la membrana en la separación entre el IFT y el abdomen. liberar suavemente la presión en las pinzas para separar el IFT de los músculos abdominales, exponiendo el haz neurovascular debajo. Observar los extremos proximal y ramas caudales superficiales como importantes puntos de referencia (Figura 1B). </li><li> Insertar un retractor y tirar del tejido abdominal proximal para exponer el constrictor aneroide o ligadura proximal sitio, justo proximal a la arteria circunfleja femoral lateral (Figura 1B). La arteria circunfleja lateral se encuentra a unos 5 mm proximal a la proximal y las arterias caudales superficiales. <ol><li> Inserte dos retractores más en la parte distal de la incisión, uno medial y lateral, para tirar de la IFT distalmente lejos de lasitio quirúrgico para ampliar el campo quirúrgico. </li></ol></li><li> Use dos pinzas finas para retirar la membrana exterior que cubre el haz neurovascular. Introduzca suavemente la mitad de la punta de pinza fina entre la vena y la arteria, deslizando la punta fórceps debajo de la membrana que los une. Cerrar la pinza y suavemente rasgar la membrana. </li><li> Inserte la punta de una pinza cerrada entre la vena y la arteria y crear una brecha entre ellos por la liberación de la presión en las pinzas. Repetir esta técnica para crear un hueco entre la arteria y el nervio. </li><li> Para subaguda isquemia de las extremidades, colocar un constrictor aneroide en la arteria femoral proximal (Figura 2). <ol><li> Para instalar el constrictor aneroide proximal, deslice la punta de una pinza debajo de la arteria femoral para aislarlo del haz neurovascular. Use un segundo conjunto de pinzas angled- para agarrar el borde del constrictor y guiar en los términos de la arteria femoral. </li><li> Coloque la arteria femoral en los smucho en el constrictor. Repita para el constrictor distal, posicionándola inmediatamente proximal a la bifurcación de la arteria femoral a la arteria poplítea y la arteria safena (Figura 2). </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54166/54166fig2.jpg" /> Figura 2. Colocación de AMEROID constrictores y ligaduras. (A) Ejemplo de dos constrictores AMEROID colocados en la arteria femoral para inducir isquemia subaguda miembro posterior. El constrictor proximal se coloca justo proximal a la arteria circunfleja femoral lateral (LCFA). El constrictor distal se coloca justo proximal a la bifurcación de la poplítea (PA) y las arterias safena (SA). Constrictoras se instalan con la ranura hacia arriba para asegurar la arteria está bien ajustado dentro del constrictor. (B) Ejemplo de ligaduras de la arteria femoral para inducir isquemia de las extremidades posteriores aguda. ligaturES (flechas amarillas) se colocan de tal manera que flanquean la posición de los constrictores en el panel (B), y la arteria femoral se secciona entre cada conjunto de dos ligaduras (asteriscos). Bar, 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54166/54166fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="8"><li> Para isquemia de las extremidades aguda, ligar y seccionar la arteria femoral proximal. <ol><li> Para seccionar la arteria femoral, hilo 7 - O sutura debajo de la arteria proximal a la posición de la constrictor proximal (véase el paso 3.7) y se liga. Ate una segunda ligadura alrededor de 1 mm distal a la primera. </li><li> Use tijeras de primavera para seccionar la arteria entre las dos ligaduras. Para la transección arterial distal, repetir estos pasos, la colocación de dos ligaduras alrededor de 1 mm entre sí, justo proximal a la bifurcación de la arteria femoral a la arteria poplítea y la arteria safena pero asegurando que son distal a la caud superficialAl arteria epigástrica (ver Figura 1) </li></ol></li><li> Cerrar la incisión utilizando interrumpido 5 - suturas de vicryl S. </li></ol> 4. Imagen de perfusión <ol><li> Mover el ratón para una almohadilla térmica 37 ° C, ubicado bajo el generador de imágenes de perfusión por láser doppler (LDPI) y conectarse a través de un cono de nariz a la fuente de isoflurano. Si no hay un monitor de temperatura está disponible, permita 5 minutos para el ratón se caliente hasta 37 ° C. </li><li> Encienda el generador de imágenes e inicie el software de captura de imágenes. </li><li> Haga clic en el icono &quot;Nueva Imagen sencilla &#39;para abrir la ventana&quot; Configuración del escáner &quot;. Ajuste el &#39;tamaño de escaneado &quot;en&quot; Grande &quot;y la&quot; velocidad de escaneo &quot;a&quot; 4 ms / píxel. Ajuste el área de escaneado, cambiando los valores de x e y en el marco del &quot;área de escaneado (unidades) &#39;panel. </li><li> Haga clic en la pestaña &#39;vídeo y Distancia &quot;para ver las imágenes de vídeo, y organizar el ratón para encajar en el área de exploración indicado por un contorno rojo. Haga clic en &quot;Auto Distancia &#39;para calibrarla distancia desde el láser al sujeto. Haga clic en &quot;Siguiente&quot; para abrir la ventana &#39;&#39; Asunto detalles. </li><li> Introduzca la información del asunto y cualquier comentario relevante. Haga clic en el botón &#39;Siguiente&#39; para pasar a la ventana de exploración. </li><li> Haga clic en el botón &#39;Inicio de medida&#39; para abrir el &#39;Confirmar o Invalidar Scan Distancia&#39; de diálogo. Haga clic en &#39;OK&#39; para confirmar la distancia de exploración. Observar el proceso de escaneado comienza y una duración de 4 - 8 minutos, dependiendo del tamaño del área de escaneo. </li><li> Después de la exploración es completa, observe la ventana &quot;Guardar como&quot;. Nombre del archivo y guardarlo. </li><li> Cierre el isoflurano y mueva el ratón a una jaula de recuperación vacía y monitorear hasta que el animal es capaz de mantener decúbito esternal. Nunca coloque un ratón se recupera de la anestesia en una jaula con otros ratones. </li><li> Abra el software de análisis de imágenes. Haga clic en el icono &quot;Abrir&quot; y busque y abra el archivo de imagen para su análisis. En la ventana de archivos, observar el flujo,fotos, imágenes en color y del ratón. </li><li> Con motivo de la región de interés (ROI) en la imagen de flujo, haga clic en el icono &quot;Mostrar regiones de interés. A continuación, haga clic en el botón &#39;Añadir Polígono&#39; y arrastra el cursor alrededor de la extremidad no quirúrgico para extraer el retorno de la inversión. Haga clic para cerrar la forma. Seleccione &#39;Añadir Polígono&#39; de nuevo y dibujar un retorno de la inversión a juego alrededor del miembro quirúrgico. </li><li> Haga clic en el icono &#39;Estadísticas&#39; para abrir la &#39;Imagen ROI estadística Resultados (PU) &quot;ventana. Observe la diferencia porcentual en proceso de cambio en la columna &#39;Flux%&#39;. NOTA: La primera ROI dibujado servirá de referencia. NOTA: Antes de cada perfusión posterior sigue los pasos descritos en la Sección 1 para anestesiar el ratón y en los pasos 4.1 a 4.11 de la imagen del animal. </li></ol>

<ol><li>Criqui, M. H., Aboyans, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+peripheral+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of peripheral artery disease.</a> Circ. Res. 116, 1509-1526 (2015).</li>
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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

Quizás el paso más difícil en este procedimiento es la separación de la arteria femoral de la vena femoral. El diámetro más grande y paredes más delgadas de la vena femoral en comparación con los de la arteria aumentan su susceptibilidad a la perforación y al desgarro durante la manipulación quirúrgica. La probabilidad de que la interrupción de la vena puede reducirse manteniendo húmeda la herida usando un hisopo estéril humedecido con PBS. También es importante asegurarse de que todos los fórceps se afilan, alineados, ...

La enfermedad arterial periférica (PAD) es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad cardiovascular en los países desarrollados 1. PAD resultados de la obstrucción aterosclerótica de las arterias periféricas que conduce a la isquemia de las extremidades con dolor de esfuerzo o de reposo resultante y, ocasionalmente, las úlceras y gangrena que requieren amputación de miembros que no cicatrizan. Las terapias dirigidas PAD se dirigen principalmente hacia endovascular 2 o 3 revascularización quirúrgica, ya que en esencia no existen terapias médicas eficaces 4. Por desgracia, la revascularización es a menudo un beneficio limitado, ya que los injertos de derivación tienen altas tasas de fracaso (hasta un 50% en 5 años) 5 que son peores en algunas poblaciones (por ejemplo, fumadores, mujeres, injertos de vena safena) no 6,7. enfoques endovasculares, tales como angioplastia y colocación de stent, también se ven comprometidos por las altas tasas de reestenosis (en exceso de 50% dentro de 1 año), particularmente in femoropoplíteo enfermedad 8, aunque el uso de globos y stents liberadores de fármacos ha mejorado los resultados un tanto 9-11. Con el fin de desarrollar nuevos tratamientos para la PAD es esencial para desarrollar modelos animales que reproduzcan de forma fiable la enfermedad humana. Hasta la fecha, el modelo más común de la EAP es el modelo de extremidad posterior isquemia (HLI), que se realiza con mayor frecuencia en los ratones 12,13. En su manifestación más común, el modelo implica la ligadura quirúrgica de la arteria femoral proximal y distal y sus intermedios ramas laterales seguido por escisión de la embarcación, dando como resultado la oclusión del flujo sanguíneo y la inducción de la isquemia de las extremidades aguda. HLI se ha utilizado principalmente para estudiar las respuestas angiogénicas y arteriogénicos en el tejido muscular del miembro periférica y los efectos de varias terapias (por ejemplo, las drogas, la entrega de genes, células madre) en estas respuestas. Más recientemente, nuestro grupo ha utilizado este modelo para examinar el papel de las células del músculo esquelético in la respuesta a la isquemia de las extremidades y de los efectos de las diferencias genéticas en los resultados 14. El modelo de HLI ha facilitado nuestra actual comprensión de que las respuestas vasculares y musculares a la isquemia dependen de la genética (es decir, la cepa consanguínea) 15, de 16 años, y la presencia o ausencia de otras enfermedades o condiciones relacionadas con la aterosclerosis, como la diabetes mellitus 17 y hipercolesterolemia 18. Sin embargo, una debilidad importante del modelo tradicional HLI es que es un modelo de isquemia de las extremidades aguda 12,13, mientras que PAD humana provoca isquemia crónica como resultado del desarrollo gradual de las lesiones ateroscleróticas oclusivos en las arterias periféricas. En un intento de eludir esta debilidad, Tang y sus colegas desarrollaron inicialmente un modelo de rata de la oclusión de la arteria femoral gradual usando constrictores AMEROID 19, y el mismo Grupo que más tarde developed un modelo similar del ratón 20. Constrictor ameroide se describieron inicialmente en la década de 1950 en un modelo canino de isquemia miocárdica crónica 21,22. Estos dispositivos tienen un manguito de metal exterior que encierra una capa interior de un material higroscópico, por lo general caseína, y cuando se coloca alrededor de una arteria que inducen la oclusión del vaso gradual a medida que absorben la humedad de los tejidos circundantes. En su modificación del modelo, Yang et al. Coloca constrictores tanto en los extremos proximal y distal de la arteria femoral en sitios análogos a los sitios de la ligadura quirúrgica, y se ligó las ramas laterales de la arteria femoral, como en el modelo tradicional. En comparación con HLI aguda, aneroide la isquemia inducida por constrictor resultó en una menor expresión de genes inflamatorios y de estrés de cizalla-dependiente, la recuperación del flujo sanguíneo inferior 4 - 5 semanas después de la cirugía, y menos necrosis muscular 20. Basándose en estas observaciones, se consideró que la oclusión arterial gradual podría proporcionar un modelo de PAD más relevante para la enfermedad humana. En particular, en el informe original, efectos de la isquemia inducida por constrictor aneroide se examinaron sólo en ratones C57BL / 6 19, que son relativamente resistentes a la necrosis muscular inducida por isquemia 15. Recientemente hemos modificado el modelo de isquemia progresiva más allá y exploramos sus efectos en el más susceptible a la isquemia BALB / c cepa de ratón 23. En la primera manifestación de la modelo, colocamos constrictoras en ambos extremos proximal y distal de la arteria femoral, pero nos fuimos todos los ramas laterales intactas. En una segunda modificación, más suave, colocamos un solo constrictor sólo en la arteria femoral proximal y otra vez fuimos todos los secundarios manojos de la arteria intacta. En ambas modificaciones de este modelo, se encontró que los ratones BALB / c, pero no C57BL / 6 ratones, mostró necrosis muscular significativa a pesar de tener el flujo de sangre y densidad similares vascular. Al igual que en nuestro estudio anterior 14, estos resultados demuestran que el músculo del miembrolesión no está únicamente influenciado por el flujo de sangre, pero depende en parte en el fondo genético. Por otra parte, se encontró que el flujo sanguíneo hacia las extremidades cayó a su punto más bajo dentro de los 3 días, por lo que el modelo parece ser más una de &#39;subaguda&#39; en lugar de isquemia de las extremidades gradual. Con base en estos estudios previos, parece claro que un solo método para inducir isquemia del miembro posterior puede no ser adecuado en todos los casos. Debido a una variedad de condiciones (por ejemplo, las diferencias genéticas y la presencia o ausencia de condiciones comórbidas) influyen tanto en el vascular y las respuestas específicas del músculo esquelético, los investigadores puede verse en la necesidad de modificar la cronicidad y / o la severidad de la isquemia de las extremidades posteriores al mejor satisfacer sus propósitos. Por otra parte, las descripciones anteriores del modelo por lo general carecían de referencias anatómicas adecuadas para facilitar fiable reproducibilidad inter-investigador de la técnica. En este trabajo, los métodos para inducir isquemia de las extremidades posteriores, ya sea aguda o subaguda en el ratónse describen y se proporcionan puntos de referencia anatómicos precisos.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5/45 Pinzas</td><td>Herramientas de Ciencia Fina</td><td>11251-35</td><td>Dumoxel</td></tr><tr><td>Dumont Style 5 Mini Pinzas</td><td>Herramientas de Ciencia Fina</td><td>11200-14</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Bonn Extra Finas de Acero</td><td>inoxidable Herramientas de Ciencia Fina</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>7 - 0 Sutura de seda</td><td>Sharpoint</td><td>DA-2527N</td><td></td></tr><tr><td>5 - 0 Sutura de Vicryl Recubierta</td><td>Ethicon</td><td>J463G</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Graefe</td><td>Herramientas de Ciencia Fina</td><td>11053-10</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Vannas</td><td>Herramientas de Ciencia Fina</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Ungüento de lágrimas artificiales</td><td>Laboratorios</td><td>de Rugby 0536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>Cinta quirúrgica</td><td>3M</td><td>1530-0</td><td></td></tr><tr><td>Bastoncillos de algodón fino</td><td>Contec</td><td>SC-4</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>Physitemp</td><td>TCAT-2DF</td><td></td></tr><tr><td>Ameroid Constrictores</td><td>Instrumentos de Investigación SW</td><td>MMC-0.25 x 1.00-SS</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador</td><td></td><td></td><td></td>de perlas</tr><tr><td>calientes Almohadilla isotérmica Deltaphase</td><td>Braintree Scientific</td><td>39DP</td><td></td></tr><tr><td>Needle Driver</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Moor LDPI</td><td>Moor Instruments</td><td>moorLDI2</td><td></td></tr><tr><td>moorLDI Software de medición</td><td>Moor Instruments</td><td>v. 6.0</td><td></td></tr><tr><td>Crema Depilatoria</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

los métodos para aguda y subaguda murino de isquemia del miembro posterior

Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia

La enfermedad arterial periférica (PAD) es una causa importante de morbilidad y mortalidad cardiovascular en los países desarrollados, y modelos animales que se reproducen de forma fiable la enfermedad humana son necesarias para desarrollar nuevas terapias para esta enfermedad. El modelo de extremidad posterior del ratón isquemia ha sido ampliamente utilizado para este propósito, pero la práctica estándar de la inducción de isquemia del miembro aguda por la ligadura de la arteria femoral puede dar lugar a necrosis tisular sustancial, comprometer la capacidad de investigadores para estudiar las respuestas vasculares y el tejido muscular esquelético a isquemia . Un enfoque alternativo a la ligadura de la arteria femoral es la inducción de la oclusión de la arteria femoral gradual mediante el uso de constrictor ameroide. Cuando se coloca alrededor de la arteria femoral en la misma o diferentes ubicaciones como los sitios de ligación de la arteria femoral, estos dispositivos ocluyen la arteria por encima de 1 - 3 días, lo que resulta en más gradual, isquemia subaguda. Esto da como resultado la necrosis del tejido del músculo esquelético menos sustancial, which puede imitar más de cerca las respuestas observadas en la AP humano. Debido a las influencias genéticas fondo resultados tanto en los modelos de isquemia aguda y subaguda, la consideración de la cepa de ratón en estudio es importante en la elección del mejor modelo. Este artículo describe el procedimiento adecuado y la colocación anatómica de ligaduras o constrictoras AMEROID en la arteria femoral de ratón para inducir isquemia subaguda o aguda de las extremidades posteriores en el ratón.

La correcta identificación de los vasos de las extremidades posteriores del ratón es fundamental para asegurar la reproducibilidad de las técnicas para inducir tanto la isquemia subaguda y aguda de las extremidades posteriores, tal como se describe aquí. Además de la variación inherente en estudios con animales, otros factores pueden introducir variabilidad en láser de perfusión Doppler (LDPI), incluyendo el tipo de anestesia, la posición del animal (vs. supina boca abajo), y la...

La inducción quirúrgica de la isquemia de las extremidades posteriores en el ratón es útil para examinar la angiogénesis, sin embargo, esto se ve comprometido en ciertas cepas endogámicas de ratón que muestran una marcada necrosis tisular inducida por la isquemia. Se describen métodos para inducir isquemia subaguda de las extremidades utilizando constrictores ameroides, para eludir este problema mediante la inducción de una oclusión arterial gradual.

Los métodos para aguda y subaguda murino de isquemia del miembro posterior

Peripheral artery disease (PAD) is a leading cause of cardiovascular morbidity and mortality in developed countries, and animal models that reliably ...

El objetivo general de este protocolo es modelar la enfermedad arterial periférica humana mediante la colocación de suturas o constrictores ameroides en la arteria femoral del ratón para inducir isquemia aguda o subaguda de la extremidad inferior, respectivamente. La enfermedad arterial periférica es un problema clínico importante, y estas técnicas que utilizan modelos animales han sido desarrolladas para representar mejor la enfermedad humana. La ventaja principal de estas técnicas es que la gravedad y el momento de inicio de la isquemia en la extremidad pueden ser controlados por el investigador.El procedimiento será demostrado por Mike Padgett, un técnico de mi laboratorio. Uno o dos días antes del procedimiento, confirme que el ratón esté completamente sedado por la ausencia de respuesta al pellizco en los dedos del pie, y aplique pomada ocular. A continuación, use una cortadora eléctrica pequeña para afeitar el vello de ambas extremidades traseras.Una vez que todo el vello haya sido recortado, aplique una crema depilatoria previamente calentada. Después de un minuto, retire suavemente la crema con una compresa de gasa humedecida. A continuación, coloque al ratón en una jaula de recuperación limpia forrada con toalla de papel hasta que sea capaz de mantener una posición esternal recostada.El día de la cirugía, coloque el ratón completamente sedado bajo un microscopio estereoscópico de disección en posición supina y sujete ambas patas con cinta quirúrgica. Si se utiliza una alfombra calefactora con control de temperatura, conecte la sonda de temperatura y fíjela a la base de la plataforma quirúrgica con cinta quirúrgica. A continuación, utilice tres aplicaciones alternadas de povidona yodada y alcohol para limpiar el sitio quirúrgico, y cubra al animal con un campo quirúrgico estéril que tenga un orificio en el sitio de la incisión.Con un escalpelo, realice una incisión inicial a lo largo del centro del muslo medial desde la rodilla hacia el abdomen. Luego, use tijeras finas para alargar la incisión hasta aproximadamente un centímetro. Con pinzas, abra la incisión para exponer la membrana que cubre el tejido adiposo inguinal.Luego, utilice fórceps cerrados para atravesar la membrana, penetrando en el espacio entre el tejido adiposo y el abdomen. Libere suavemente la presión sobre los fórceps para separar el tejido adiposo de los músculos abdominales, exponiendo el haz neurovascular. Es fundamental que los vasos sanguíneos principales y sus ramas se identifiquen correctamente antes de la disección del haz neurovascular.Las variaciones en la ubicación de los constricciones o en los sitios de ligadura pueden alterar significativamente la gravedad de la isquemia y provocar una variabilidad considerable en los resultados. Inserte un retractor en la incisión y tire del tejido abdominal hacia la cabeza del animal para exponer el sitio proximal del constriccion ameroid, que se encuentra justo proximal a la arteria femoral circunfleja lateral. A continuación, inserte un retractor medial y otro lateral en la parte distal de la incisión para ampliar el campo quirúrgico, tirando del tejido graso inguinal hacia el pie y alejándolo del sitio quirúrgico.Las ramas proximales y superficiales caudales de la arteria femoral deben observarse fácilmente. La arteria femoral lateral circunfleja se encuentra aproximadamente a cinco milímetros proximal a las ramas caudales y puede estar oculta por la membrana. Ahora deslice suavemente la punta de una pinza por debajo de la membrana que une los vasos para insertar la mitad de la punta entre la vena y la arteria.A continuación, cierre la pinza y retire suavemente la membrana. Cuando se haya eliminado toda la membrana, inserte la punta de la pinza cerrada entre la vena y la arteria, y libere la presión sobre la pinza para crear un espacio entre los vasos. Para la isquemia aguda de extremidad, deslice la punta de la pinza por debajo de la arteria femoral para aislar el vaso del paquete neurovascular.Utilice un segundo juego de pinzas en ángulo para sujetar el borde del constrictor y guíe el constrictor por debajo de la arteria femoral. Luego, coloque la arteria dentro de la ranura del constrictor. A continuación, coloque el constrictor distal sobre la arteria femoral inmediatamente proximal al punto donde la arteria se bifurca en las arterias poplítea y safena, y coloque la arteria femoral dentro de la ranura del constrictor.Para la isquemia aguda de la extremidad, pase una sutura de 7-0 por debajo de la arteria en la misma posición que el constrictor proximal y ligue la arteria. Luego, coloque una segunda ligadura aproximadamente un milímetro distal a la primera y use tijeras de resorte para seccionar la arteria entre las dos ligaduras. Para la sección arterial distal, coloque las ligaduras aproximadamente un milímetro separadas, justo proximal al punto donde la arteria femoral se bifurca en las arterias poplítea y safena.Luego cierre la incisión con suturas de vicril 5-0 interrumpidas y traslade el ratón a una almohadilla térmica de 37 grados Celsius debajo de un imagenador láser de perfusión por Doppler. Encienda ahora el imagenador y abra el software de captura de imágenes. Haga clic en el icono Nueva imagen individual para abrir la ventana de configuración del escáner, y establezca el tamaño de escaneo en grande y la velocidad de escaneo en cuatro milisegundos por píxel.Cambie los valores de X e Y en el panel de unidades de área de escaneo a los valores adecuados, luego haga clic en la pestaña Video y Distancia, y coloque ambas extremidades traseras dentro del área de escaneo. Haga clic en Distancia automática, luego haga clic en Siguiente para abrir la ventana de detalles del sujeto e ingrese la información del sujeto. Haga clic en Siguiente para pasar a la ventana de escaneo.Luego, haga clic en el botón Iniciar medición para abrir el cuadro de diálogo Confirmar o anular la distancia de escaneo, y haga clic en Aceptar para comenzar el proceso de escaneo. Cuando el escaneo esté completo, traslade al animal a una jaula de recuperación vacía y realice el monitoreo hasta que se recupere completamente. Además de las variaciones inherentes a los estudios con animales, otros factores pueden introducir variabilidad en la imagen de perfusión por láser doppler, incluyendo la temperatura corporal y la posición del animal.El modelo de isquemia en miembro posterior subaguda depende de la calidad de los constriñedores ameroides, los cuales pueden variar ampliamente dentro de un mismo lote. La imagen de perfusión por láser doppler debe realizarse inmediatamente después del procedimiento, mientras el animal aún está anestesiado, para demostrar los efectos de la cirugía y establecer un nivel basal postoperatorio de perfusión. Se debe observar una pérdida completa de la perfusión en el miembro posterior tras la inducción de isquemia aguda del miembro, mientras que sólo se observa típicamente una disminución leve en la perfusión tras la colocación del constriñedor ameroides en el modelo subagudo.Estos procedimientos permiten explorar los efectos de distintos grados de isquemia sobre la remodelación vascular y la regeneración del músculo esquelético en el ratón como modelo de la enfermedad arterial periférica humana. Una vez dominados, estos procedimientos pueden completarse en aproximadamente 15 minutos si se realizan correctamente. Al intentar estas cirugías, es importante recordar monitorear continuamente la temperatura corporal y la adecuación de la anestesia en el animal.Al ajustar la colocación de las ligaduras o los constricciones, se puede modificar la gravedad de la lesión isquémica, lo cual puede ser una variable importante dependiendo del fondo genético del animal o de la presencia de factores de riesgo cardiovascular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir isquemia aguda y subaguda en la extremidad trasera del ratón, y de cómo definir la anatomía vascular para asegurar un resultado adecuado y la reproducibilidad del procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

El procedimiento quirúrgico para la inducción de isquemia miembro posterior unilateral se demuestra, con la confirmación de la isquemia por imágenes de perfusión Doppler láser.

Modelo murino de isquemia Miembro Posterior

Numerosas manipulaciones genéticas y / o inyecciones intramiocárdica de genes, proteínas, células, y / o los biomateriales se superponen a la dimensión del tiempo en los estudios de agudos de isquemia / reperfusión y la remodelación crónica en ratones. Este video ilustra los procedimientos de microcirugía de la isquemia / reperfusión, la ligadura permanente de la arteria coronaria, y los estudios de inyección intramiocárdica.

Ligadura de las arterias coronarias y la inyección intramiocárdica en un modelo murino de infarto

Se introduce un método quirúrgico para inducir experimental de isquemia / reperfusión (I / R) lesión para simular el infarto de miocardio (MI) en modelos de ratón que permite una mayor claridad en el posicionamiento de la ligadura en la arteria descendente anterior izquierda (LAD) para aumentar la reproducibilidad de experimentos en ratones MI.

Un modelo murino de isquemia-reperfusión miocárdica lesión a través de la ligadura de la arteria descendente anterior

A continuación se describe el procedimiento detallado de isquemia-reperfusión intestinal en ratones que produce lesiones reproducibles sin mortalidad para fomentar la estandarización de esta técnica a través del campo. Este modelo de lesión de isquemia-reperfusión intestinal puede ser utilizado para estudiar los mecanismos celulares y moleculares de la lesión y regeneración.

Modelo murino de isquemia-reperfusión intestinal Lesiones

Describimos un procedimiento quirúrgico utilizado para inducir isquemia periférica en conejos con hiperlipidemia y diabetes. Esta cirugía actúa como un modelo preclínico para afecciones experimentadas en la enfermedad arterial periférica en pacientes. La angiografía también se describe como un medio para medir la magnitud de la isquemia introducida y la recuperación de la perfusión.

Modelo preclínico de isquemia de extremidades traseras en conejos diabéticos

Aquí, se presenta un modelo experimental crítico de isquemia de la extremidad posterior seguido de una batería de pruebas funcionales, histológicas y moleculares para evaluar la eficacia de las terapias angiogénicas.

Evaluación de la angiogénesis terapéutica en un modelo murino de isquemia de las extremidades posteriores

Aquí se describe un procedimiento quirúrgico que muestra cómo lograr la ligadura permanente de la arteria coronaria descendente izquierda-anterior en ratones. Este modelo es de gran relevancia para investigar la fisiopatología del infarto de miocardio y los procesos biológicos concomitantes.

Modelo de infarto de miocardio murino usando ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda

Aquí, presentamos un protocolo que demuestra la técnica y los controles necesarios para las imágenes de perfusión de Laser Doppler para medir el flujo sanguíneo en el retroigrama del ratón.

Imágenes de perfusión doppler láser en el hindlimb del ratón

Este artículo demuestra un enfoque quirúrgico eficiente para establecer la isquemia aguda en ratones con una pequeña incisión. Este enfoque puede ser aplicado por la mayoría de los grupos de investigación sin ninguna actualización de laboratorio.

Un modelo quirúrgico modificado de isquemia de la extremidad posterior en ApoE-/- Ratones que usan una incisión en miniatura

El presente protocolo describe un modelo único y clínicamente relevante de enfermedad arterial periférica que combina la electrocoagulación de la arteria femoral y la vena con la administración de un inhibidor de la óxido nítrico sintasa para inducir gangrena de las extremidades posteriores en ratones FVB. La perfusión Intracardíaca DiI se utiliza para obtener imágenes tridimensionales de alta resolución de la vasculatura de la almohadilla del pie.

Imágenes tridimensionales de alta resolución de la vasculatura de la almohadilla del pie en un modelo de gangrena de extremidades posteriores murinas

En este trabajo, presentamos un protocolo para establecer un modelo de oclusión distal de la arteria cerebral media (dMCAO) mediante electrocoagulación transcraneal en ratones C57BL/6J y evaluamos el comportamiento neurológico y las características histopatológicas posteriores.

Inducción de ictus isquémico agudo en ratones mediante la técnica de oclusión de la arteria media distal

Aprenda a inducir isquemia aguda y subaguda en el miembro posterior de ratones mediante constricciones ameroides en la arteria femoral. Este método permite controlar la severidad de la oclusión arterial para estudiar la angiogénesis y la enfermedad arterial periférica.

Los métodos para aguda y subaguda murino de isquemia del miembro posterior

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