Los métodos para aguda y subaguda murino de isquemia del miembro posterior

El objetivo general de este protocolo es modelar la enfermedad arterial periférica humana mediante la colocación de suturas o constrictores ameroides en la arteria femoral del ratón para inducir isquemia aguda o subaguda de la extremidad inferior, respectivamente. La enfermedad arterial periférica es un problema clínico importante, y estas técnicas que utilizan modelos animales han sido desarrolladas para representar mejor la enfermedad humana. La ventaja principal de estas técnicas es que la gravedad y el momento de inicio de la isquemia en la extremidad pueden ser controlados por el investigador.

El procedimiento será demostrado por Mike Padgett, un técnico de mi laboratorio. Uno o dos días antes del procedimiento, confirme que el ratón esté completamente sedado por la ausencia de respuesta al pellizco en los dedos del pie, y aplique pomada ocular. A continuación, use una cortadora eléctrica pequeña para afeitar el vello de ambas extremidades traseras.

Una vez que todo el vello haya sido recortado, aplique una crema depilatoria previamente calentada. Después de un minuto, retire suavemente la crema con una compresa de gasa humedecida. A continuación, coloque al ratón en una jaula de recuperación limpia forrada con toalla de papel hasta que sea capaz de mantener una posición esternal recostada.

El día de la cirugía, coloque el ratón completamente sedado bajo un microscopio estereoscópico de disección en posición supina y sujete ambas patas con cinta quirúrgica. Si se utiliza una alfombra calefactora con control de temperatura, conecte la sonda de temperatura y fíjela a la base de la plataforma quirúrgica con cinta quirúrgica. A continuación, utilice tres aplicaciones alternadas de povidona yodada y alcohol para limpiar el sitio quirúrgico, y cubra al animal con un campo quirúrgico estéril que tenga un orificio en el sitio de la incisión.

Con un escalpelo, realice una incisión inicial a lo largo del centro del muslo medial desde la rodilla hacia el abdomen. Luego, use tijeras finas para alargar la incisión hasta aproximadamente un centímetro. Con pinzas, abra la incisión para exponer la membrana que cubre el tejido adiposo inguinal.

Luego, utilice fórceps cerrados para atravesar la membrana, penetrando en el espacio entre el tejido adiposo y el abdomen. Libere suavemente la presión sobre los fórceps para separar el tejido adiposo de los músculos abdominales, exponiendo el haz neurovascular. Es fundamental que los vasos sanguíneos principales y sus ramas se identifiquen correctamente antes de la disección del haz neurovascular.

Las variaciones en la ubicación de los constricciones o en los sitios de ligadura pueden alterar significativamente la gravedad de la isquemia y provocar una variabilidad considerable en los resultados. Inserte un retractor en la incisión y tire del tejido abdominal hacia la cabeza del animal para exponer el sitio proximal del constriccion ameroid, que se encuentra justo proximal a la arteria femoral circunfleja lateral. A continuación, inserte un retractor medial y otro lateral en la parte distal de la incisión para ampliar el campo quirúrgico, tirando del tejido graso inguinal hacia el pie y alejándolo del sitio quirúrgico.

Las ramas proximales y superficiales caudales de la arteria femoral deben observarse fácilmente. La arteria femoral lateral circunfleja se encuentra aproximadamente a cinco milímetros proximal a las ramas caudales y puede estar oculta por la membrana. Ahora deslice suavemente la punta de una pinza por debajo de la membrana que une los vasos para insertar la mitad de la punta entre la vena y la arteria.

A continuación, cierre la pinza y retire suavemente la membrana. Cuando se haya eliminado toda la membrana, inserte la punta de la pinza cerrada entre la vena y la arteria, y libere la presión sobre la pinza para crear un espacio entre los vasos. Para la isquemia aguda de extremidad, deslice la punta de la pinza por debajo de la arteria femoral para aislar el vaso del paquete neurovascular.

Utilice un segundo juego de pinzas en ángulo para sujetar el borde del constrictor y guíe el constrictor por debajo de la arteria femoral. Luego, coloque la arteria dentro de la ranura del constrictor. A continuación, coloque el constrictor distal sobre la arteria femoral inmediatamente proximal al punto donde la arteria se bifurca en las arterias poplítea y safena, y coloque la arteria femoral dentro de la ranura del constrictor.

Para la isquemia aguda de la extremidad, pase una sutura de 7-0 por debajo de la arteria en la misma posición que el constrictor proximal y ligue la arteria. Luego, coloque una segunda ligadura aproximadamente un milímetro distal a la primera y use tijeras de resorte para seccionar la arteria entre las dos ligaduras. Para la sección arterial distal, coloque las ligaduras aproximadamente un milímetro separadas, justo proximal al punto donde la arteria femoral se bifurca en las arterias poplítea y safena.

Luego cierre la incisión con suturas de vicril 5-0 interrumpidas y traslade el ratón a una almohadilla térmica de 37 grados Celsius debajo de un imagenador láser de perfusión por Doppler. Encienda ahora el imagenador y abra el software de captura de imágenes. Haga clic en el icono Nueva imagen individual para abrir la ventana de configuración del escáner, y establezca el tamaño de escaneo en grande y la velocidad de escaneo en cuatro milisegundos por píxel.

Cambie los valores de X e Y en el panel de unidades de área de escaneo a los valores adecuados, luego haga clic en la pestaña Video y Distancia, y coloque ambas extremidades traseras dentro del área de escaneo. Haga clic en Distancia automática, luego haga clic en Siguiente para abrir la ventana de detalles del sujeto e ingrese la información del sujeto. Haga clic en Siguiente para pasar a la ventana de escaneo.

Luego, haga clic en el botón Iniciar medición para abrir el cuadro de diálogo Confirmar o anular la distancia de escaneo, y haga clic en Aceptar para comenzar el proceso de escaneo. Cuando el escaneo esté completo, traslade al animal a una jaula de recuperación vacía y realice el monitoreo hasta que se recupere completamente. Además de las variaciones inherentes a los estudios con animales, otros factores pueden introducir variabilidad en la imagen de perfusión por láser doppler, incluyendo la temperatura corporal y la posición del animal.

El modelo de isquemia en miembro posterior subaguda depende de la calidad de los constriñedores ameroides, los cuales pueden variar ampliamente dentro de un mismo lote. La imagen de perfusión por láser doppler debe realizarse inmediatamente después del procedimiento, mientras el animal aún está anestesiado, para demostrar los efectos de la cirugía y establecer un nivel basal postoperatorio de perfusión. Se debe observar una pérdida completa de la perfusión en el miembro posterior tras la inducción de isquemia aguda del miembro, mientras que sólo se observa típicamente una disminución leve en la perfusión tras la colocación del constriñedor ameroides en el modelo subagudo.

Estos procedimientos permiten explorar los efectos de distintos grados de isquemia sobre la remodelación vascular y la regeneración del músculo esquelético en el ratón como modelo de la enfermedad arterial periférica humana. Una vez dominados, estos procedimientos pueden completarse en aproximadamente 15 minutos si se realizan correctamente. Al intentar estas cirugías, es importante recordar monitorear continuamente la temperatura corporal y la adecuación de la anestesia en el animal.

Al ajustar la colocación de las ligaduras o los constricciones, se puede modificar la gravedad de la lesión isquémica, lo cual puede ser una variable importante dependiendo del fondo genético del animal o de la presencia de factores de riesgo cardiovascular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir isquemia aguda y subaguda en la extremidad trasera del ratón, y de cómo definir la anatomía vascular para asegurar un resultado adecuado y la reproducibilidad del procedimiento.