Generación de un ratón humanizado hígado uso de células madre hepáticas humanas

El objetivo general de este procedimiento quirúrgico de trasplante de células madre es generar un nuevo modelo de ratón quimérico con función hepática humana, utilizando células progenitoras inmaduras hepáticas humanas que permitan la proliferación, maduración y diferenciación celular para adquirir metabolismo de fármacos. Este método proporciona una herramienta poderosa para crear un microentorno que apoye la progénesis de células madre hepáticas donantes humanas, permitiendo su expansión, diferenciación y reconstrucción del hígado lesionado del ratón receptor. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden utilizar células proliferadas y maduras, y que el hígado se repobla casi por completo.

Para comenzar, prepare una solución stock de toxina diftérica o DT de un miligramo por mililitro agregando un mililitro de solución fenolizada de cloruro de sodio al 0,85 % a un miligramo de DT. Realice una inyección intraperitoneal de DT sujetando un ratón scid albtrek en posición recostada dorsalmente y debajo de la curvatura de las rodillas, a la izquierda o derecha de la línea media, e inserte la aguja en un ángulo de 45 grados respecto al cuerpo. Utilizando una jeringa de insulina, inyecte 100 microlitros de una solución recién preparada de 0,3 microgramos por mililitro de DT por cada ratón de 20 gramos. A las 48 horas posteriores a la inyección de DT, coloque al ratón en un sujetador y caliente la cola en un baño de agua a 30 grados Celsius durante aproximadamente 10 minutos para dilatar los vasos sanguíneos.

Luego, a dos centímetros de la punta de la cola, use una hoja de bisturí afilada para hacer un corte de un milímetro de profundidad en la cola y use un tubo capilar para recolectar la sangre. Centrifugue el tubo microcapilar que contiene la sangre a 1500 ×g durante cinco minutos y recolecte el suero separando el sobrenadante del botón celular. Pipetee 50 microlitros de una dilución uno a veinte del suero sobre portaobjetos GOT ASTP3.

Luego, utilizando un analizador automático multifuncional de química seca según el protocolo del fabricante, mida la absorbancia del producto de reacción a 650 nanómetros. Mediante un clasificador celular, aísle células madre hepáticas humanas a partir de células hepáticas fetales primarias humanas utilizando los antígenos celulares CDCP1, CD90 y CD66 para obtener una subpoblación positiva para CDCP1, positiva para CD90 y negativa para CD66. Siembre las células en placas de cultivo con código de colágeno IV e incube a 37 grados Celsius.

Cuando las células alcancen una confluencia del 80 al 90 %, lávelas una vez con PBS. A continuación, agregue tripsina-EDTA al 0,05 % e incube a temperatura ambiente. Cuando las células parezcan estar flotando o moviéndose libremente bajo el microscopio, detenga la digestión enzimática agregando ocho mililitros de DMEM-F12 que contenga 10 % de suero bovino fetal.

Con una pipeta serológica de 10 mililitros, suspenda lentamente las células antes de transferirlas a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugue las células a 100 veces G y cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Utilizando 10 mililitros de DMEM/F12 con 10 % de SFB, resuspenda cuidadosamente el sedimento celular y use un instrumento de conteo celular para determinar el número de células.

Divida las células en alícuotas de uno por diez a la sexta células por 50 microlitros de PBS para cada ratón y almacénelas en hielo hasta el trasplante. Después de anestesiar un ratón según el protocolo descrito en el texto, verifique un reflejo pellizcando ligeramente la almohadilla del pie trasero. Luego, aplique pomada veterinaria en los ojos para prevenir la sequedad.

Con afeitadoras eléctricas, afeite el sitio quirúrgico y aplique etanol al 70% y povidona-yodo para desinfectar. Realice una incisión cutánea de un centímetro en el flanco izquierdo justo debajo del borde costal de las costillas. Luego, realice una incisión en la pared abdominal izquierda seguida de una incisión en el peritoneo.

A continuación, exponga cuidadosamente el bazo. Luego, inserte un microjeringa de 100 microlitros con una aguja de calibre 32 y media pulgada a un ángulo de cinco grados, a una profundidad de la mitad del grosor del bazo, e inyecte directamente, de un extremo a otro del órgano, una vez 10 a la sexta células madre hepáticas humanas en 50 microlitros de PBS en el órgano y retire la aguja. Para prevenir la fuga de las células tras la inyección, use un dedo para aplicar suavemente presión durante dos minutos.

Coloque el bazo nuevamente en el cuerpo del ratón y use un punto continuo normal para la musculatura y la piel con el fin de cerrar la cavidad. Transfiera inmediatamente al ratón de lado a una jaula precalentada a 37 grados Celsius. Evite el contacto entre el material de cama de la jaula y el sitio de la cirugía, y supervise al animal según el protocolo descrito en el texto.

A las cuatro a seis semanas posteriores al trasplante, tras sacrificar el ratón según el protocolo descrito, use tijeras quirúrgicas para abrir la cavidad abdominal cortando simultáneamente la piel y la fascia. Utilizando las tijeras como separador, disecar el tejido conectivo por encima del peritoneo a lo largo de la línea alba para abrir la cavidad peritoneal. Con pinzas, levante el esternón.

Luego punce el diafragma y corte por cada lado del esternón hasta el cinturón cervical. Seccione la vena cava en el lado torácico del hígado y tire del esófago a través del hígado en dirección anterior. Retire el diafragma y luego, utilizando este como asa, comience a extraer el hígado de la cavidad abdominal.

La vena cava inferior mantendrá el hígado en su lugar. Por lo tanto, corte la vena cava inferior teniendo cuidado de no liberar prematuramente la glándula suprarrenal derecha. Separe los lóbulos del hígado entre sí en las uniones e incruste los lóbulos en OCT según el protocolo del fabricante.

Congele la OCT que contiene el tejido hepático en las rejillas metálicas del criostato. Con el criostato, corte secciones de muestra de cinco micrómetros de grosor a menos 18 grados Celsius y colóquelas sobre portaobjetos a temperatura ambiente. Almacene el stock a menos 80 grados Celsius.

Finalmente, prepare los portaobjetos para la tinción con H&E según procedimientos previamente descritos y para ELISA según el protocolo descrito en el texto. Como se muestra en estas secciones teñidas con H&E, los ratones tratados con DT exhibieron una arquitectura hepática desorganizada y mostraron una corrección de la congestión con aumento de la actividad sérica de AST. A las seis semanas posteriores al trasplante, las células derivadas de células madre hepáticas humanas reconstituyeron la estructura hepática al reemplazar los hepatocitos residentes del ratón.

Macroscópicamente, a los cuatro días posteriores al trasplante, se detectaron pequeños grupos hepáticos humanos distribuidos de manera uniforme alrededor del hígado. A los 45 días, los grupos habían proliferado formando agrupaciones más grandes. Como se observa aquí, la presencia de hepatocitos humanos en hígados de ratón se confirmó por primera vez seis semanas después del trasplante mediante tinción con anticuerpos contra núcleos humanos y citokeratina 8/18.

Los hepatocitos humanos positivos para ALB y negativos para CK19 se asemejaban a hepatocitos funcionales, mientras que las células que mostraron tinción positiva conjunta para ALB humano y CK19 exhibieron una capacidad bi-potencial para diferenciarse en hepatocitos y colangiocitos. Se detectó la presencia de múltiples agrupaciones redondeadas alrededor de los lóbulos hepáticos, con núcleos humanos evidentes y expresión de CK8/18, lo que demuestra la capacidad de formación de colonias de las células madre hepáticas humanas en hígados humanizados. Finalmente, el nivel de repoblación alcanzó hasta un 90 % un mes después del trasplante, y se detectó la secreción de albúmina humana en los hígados de ratón repoblados.

Una vez dominada, la trasplantación quirúrgica de células puede realizarse en 10 minutos si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la lesión hepática debe restringirse al hígado lizer suple. Bajo fuga celular, debe evitarse la trasplantación de células.

Combinado con este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la transfección génica para la reprogramación directa in vitro con células humanas, con el fin de explorar la convergencia de las células humanas con nuestro modelo actual. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la hepatología exploraran el metabolismo de fármacos en humanos, la interacción entre fármacos, la toxicidad hepática y el virus de la hepatitis en un modelo de hígado humanizado. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y expandir la célula madre hepática, inducir lesión hepática y trasplantar una célula mediante el bazo para generar un modelo de ratón quimérico con función hepática humana.

No olvide que la toxina de la difteria puede ser controlada y que son importantes precauciones como evitar la necrosis del corazón y del hígado, las cuales siempre deben tomarse al realizar este procedimiento.