Cinética Medición y visualización en tiempo real de la reprogramación somática

El objetivo general de estos procedimientos es visualizar y rastrear la progresión de la reprogramación de células somáticas en células madre pluripotentes inducidas o iPSC. Este método se puede utilizar para responder a preguntas clave en el campo de las iPSC, como la forma en que la cinética de reprogramación y la eficiencia de la reprogramación se ven alteradas por los tejidos somáticos utilizados, las tecnologías de reprogramación aplicadas y las combinaciones de matrices y medios utilizadas con ellos. La principal ventaja de este método es que utiliza marcadores de superficie celular para observar las transiciones de las células somáticas en iPSC, de modo que se puede utilizar esta tecnología para poder monitorear en tiempo real los eventos de reprogramación.

En el séptimo día después de la transducción, lave los fibroblastos con dos mililitros de DPBS por pocillo y agregue 0,5 mililitros de 37 grados centígrados 05% EDTA a cada pocillo para una incubación de tres a cinco minutos a 37 grados centígrados. Cuando las células se hayan redondeado, detenga la reacción con dos mililitros de medio fibroblasto de 37 grados centígrados por pocillo y pipetee suavemente el medio a través del fondo de cada pocillo para desalojar las células. Transfiera los fibroblastos de cada pocillo a tubos cónicos individuales de 15 mililitros y recoja por centrifugación.

Vuelva a suspender los gránulos en dos mililitros de medio fibroblasto fresco a 37 grados centígrados y cuente las células de cada condición de cultivo. A continuación, siembre una vez 10 a la quinta celda en pocillos acondicionados independientes del alimentador prepreparados previamente en una placa de cultivo de tejidos de seis pocillos e incube las células transducidas en la incubadora de cultivo celular durante la noche. Al día siguiente, reemplace el medio en cada pocillo con el medio apropiado para la aplicación de la celda.

A continuación, coloque la placa en el generador de imágenes y configure el software para capturar imágenes fluorescentes y de contraste continuo de fase de pocillo completo para cada pocillo cada seis a ocho horas durante los próximos 14 días. Al final del experimento de reprogramación, lave los pocillos una vez con dos mililitros de medio DMEM/F12 a 37 grados centígrados. Deseche el lavado y marque las células con un mililitro por pocillo de los anticuerpos primarios apropiados en medio DMEM/F12 fresco durante 45 minutos a 37 grados centígrados en la incubadora.

Al final de la incubación, lave las células dos veces con medio DMEM/F12 a 37 grados centígrados. A continuación, deseche el lavado y etiquete las células con un mililitro de los anticuerpos secundarios apropiados en un medio DMEM/F12 de 37 grados centígrados durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, lave las células dos veces más con medio DMEM/F12.

A continuación, sustituya el lavado de cada pocillo por dos mililitros de medio DMEM/F12 fresco de 37 grados centígrados. Coloque la antena parabólica en el generador de imágenes y abra el software de generación de imágenes. Para configurar los escaneos en el software del sistema de imágenes, primero seleccione la posición de la bandeja que se utilizará y seleccione el tipo de plato que se escaneará.

A continuación, seleccione Whole Well Imaging, el patrón para escanear los pozos deseados y los canales fluorescentes apropiados para la identificación en tiempo real de los marcadores de superficie de interés. A continuación, etiquete el experimento que se va a escanear y establezca los puntos de tiempo y los intervalos para las muestras que se van a escanear cada día. Para analizar un conjunto de experimentos examinados, seleccione el experimento que le interese y seleccione Iniciar nuevo trabajo de análisis.

A continuación, seleccione la definición de procesamiento adecuada para el tipo de análisis de acuerdo con los canales utilizados para la obtención de imágenes, por ejemplo, Recuento de colonias de fase PSC. Asigne un nombre al trabajo de análisis. Y seleccione el rango de tiempo para el análisis y los pozos a analizar.

A continuación, inicie el trabajo de análisis. Para medir los puntos de tiempo de reprogramación deseados de pozos individuales, lave el pozo de interés una vez con dos mililitros de DPBS. A continuación, sustituya el lavado por un mililitro de solución precalentada de 37 grados centígrados con 05% de tripsina-EDTA.

Después de cinco minutos a 37 grados centígrados, enjuague la tripsina contra el fondo del pocillo para disociar las células en una suspensión de una sola célula y transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros. Con tres mililitros de DPBS, lave las células restantes del pocillo y sáquelas en el tubo de 15 mililitros. Agregue 10 mililitros adicionales de DPBS a las celdas y gírelas por centrifugación.

Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de medio DMEM/F12 para contar. A continuación, diluir la suspensión celular a una décima parte de la concentración de seis células por mililitro y alícuota de un mililitro de células por tubo para el número adecuado de muestras. A continuación, etiquete las células con los anticuerpos primarios de interés en un mililitro de medio DMEM/F12 durante 30 a 45 minutos a temperatura ambiente con mezcla.

Al final de la incubación, lave las células dos veces en medio DMEM/F12 a 37 grados centígrados. Vuelva a suspender los gránulos en un mililitro de DPBS y transfiera las muestras a tubos FACS individuales. Adquirir los perfiles de citometría de flujo de las placas reprogramadas.

A continuación, transfiera los archivos FCS a un ordenador e impórtelos en el software de análisis adecuado. Abra el primer archivo de control en un diagrama de dispersión hacia adelante por lado y establezca el eje Y en una escala logarítmica. A continuación, cree una puerta poligonal alrededor de la población viva.

A continuación, cree un área de dispersión lateral por gráfico de altura de dispersión con las celdas vivas y establezca una puerta rectangular para excluir los dobletes. A continuación, utilice estas puertas para analizar los archivos de muestras experimentales bajo los canales fluorescentes apropiados para identificar las poblaciones de interés en sus respectivos cuadrantes. La reprogramación de fibroblastos BJ con virus de reprogramación Sendai genera células SSEA4 + CD44 a una velocidad diferente a la reprogramación de fibroblastos DF1, lo que demuestra que se puede usar una comparación temprana del porcentaje de células SSEA4 + CD44 similares a células madre pluripotentes para rastrear la progresión de la reprogramación.

En un curso de tiempo de citometría de flujo, los fibroblastos CD24-CD44+ y CD44+ negativos para EpCAM forman poblaciones dobles negativas que luego se transforman en células similares a células madre pluripotentes CD24-CD44-y EpCAM positivas para CD44-, respectivamente, lo que describe aún más la progresión de la reprogramación. Las imágenes en tiempo real de los cultivos de reprogramación después de la resiembra demuestran una formación gradual de colonias correspondiente a un aumento logarítmico en su confluencia y demuestran la expresión final de marcadores pluripotentes positivos y fibroblastos negativos al finalizar la reprogramación. Además, el uso de un gen reportero permite medir la confluencia bajo contraste de fase con un aumento más gradual de la confluencia GFP observada en comparación con la confluencia total.

De hecho, en este experimento representativo, la confluencia de GFP en el día 19 fue menos de la mitad de la confluencia total correspondiente a la reprogramación completa. Una vez dominada, esta técnica podría usarse para dilucidar información sobre eventos de reprogramación y rastrear la cinética de la reprogramación de fibroblastos humanos. Esta técnica también podría usarse para observar diferentes tejidos de células somáticas iniciales, las tecnologías de reprogramación utilizadas y las combinaciones de matrices medias para dilucidar los eventos de reprogramación.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo utilizar el monitoreo en tiempo real y la expresión de marcadores de superficie celular, para poder rastrear la reprogramación de fibroblastos humanos en iPSC.