Name: Cinética Medición y visualización en tiempo real de la reprogramación somática (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprende a medir la cinética de reprogramación somática en tiempo real mediante citometría de flujo e imágenes. Este protocolo permite monitorear marcadores de células pluripotentes durante la generación de iPSCs.

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Los autores agradecen a Chad MacArthur útil para los debates.

<ol><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: past, present, and future.</a> Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).</li>
<li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481, 295-305 (2012).</li>
<li>Kamata, M., Liang, M., Liu, S., Nagaoka, Y., Chen, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+monitoring+of+hiPSC+generation+and+differentiation+using+differential+expression+of+endogenous+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Live cell monitoring of hiPSC generation and differentiation using differential expression of endogenous microRNAs.</a> PLoS One. 5, e11834(2010).</li>
<li>Vendrell, M., Zhai, D., Er, J. C., Chang, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+strategies+in+fluorescent+probe+development%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Combinatorial strategies in fluorescent probe development.</a> Chem Rev. 112, 4391-4420 (2012).</li>
<li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Quintanilla, R. H. Jr, Asprer, J. S., Vaz, C., Tanavde, V., Lakshmipathy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+is+a+negative+cell+surface+marker+for+pluripotent+stem+cell+identification+during+human+fibroblast+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CD44 is a negative cell surface marker for pluripotent stem cell identification during human fibroblast reprogramming.</a> PLoS One. 9, e85419(2014).</li>
<li>Papp, B., Plath, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+to+pluripotency%3A+stepwise+resetting+of+the+epigenetic+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Reprogramming to pluripotency: stepwise resetting of the epigenetic landscape.</a> Cell Res. 21, 486-501 (2011).</li>
<li>Nefzger, C. M., Alaei, S., Knaupp, A. S., Holmes, M. L., Polo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+marker+mediated+purification+of+iPS+cell+intermediates+from+a+reprogrammable+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell surface marker mediated purification of iPS cell intermediates from a reprogrammable mouse model.</a> J Vis Exp. , e51728(2014).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+fibroblast-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells+support+undifferentiated+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Immortalized fibroblast-like cells derived from human embryonic stem cells support undifferentiated cell growth.</a> Stem Cells. 22, 972-980 (2004).</li>
<li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+the+International+Stem+Cell+Initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative.</a> Nat Biotechnol. 25, 803-816 (2007).</li>
<li>Singh, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+live+alkaline+phosphatase+substrate+for+identification+of+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Novel live alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rev. 8, 1021-1029 (2012).</li>
<li>Naujok, O., Lenzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+re-evaluation+of+CD24-positivity+of+human+embryonic+stem+cells+differentiated+into+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">A critical re-evaluation of CD24-positivity of human embryonic stem cells differentiated into pancreatic progenitors.</a> Stem Cell Rev. 8, 779-791 (2012).</li>
<li>Ramirez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+report%3A+benchmarking+human+pluripotent+stem+cell+markers+during+differentiation+into+the+three+germ+layers+unveils+a+striking+heterogeneity%3A+all+markers+are+not+equal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Brief report: benchmarking human pluripotent stem cell markers during differentiation into the three germ layers unveils a striking heterogeneity: all markers are not equal.</a> Stem Cells. 29, 1469-1474 (2011).</li>
<li>Huang, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+adhesion+molecule+%28EpCAM%29+complex+proteins+promote+transcription+factor-mediated+pluripotency+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) complex proteins promote transcription factor-mediated pluripotency reprogramming.</a> J Biol Chem. 286, 33520-33532 (2011).</li>
<li>Kolle, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+embryonic+stem+cell+surface+markers+by+combined+membrane-polysome+translation+state+array+analysis+and+immunotranscriptional+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling.</a> Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).</li>
<li>Thyagarajan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+engineered+human+embryonic+stem+cell+lines+using+phiC31+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase.</a> Stem Cells. 26, 119-126 (2008).</li>
</ol>

Todos los autores [RHQ, JSTA, KS, y UL] son ​​empleados de Thermo Fisher Scientific, que produce algunos de los reactivos e instrumentos utilizados en este artículo.

Este estudio proporciona estrategias para el monitoreo y seguimiento del proceso de reprogramación utilizando citometría de flujo y análisis basado en imágenes en tiempo real. Los pasos críticos en el protocolo son iniciar la reprogramación, medir la progresión de la reprogramación basada en la expresión del marcador y monitorear la reprogramación en tiempo real. Se puede utilizar cualquier método de reprogramación de elección, pero aquí nos centramos en la reprogramación basada en Sendai de fibroblastos humanos. La vent...

Las células madre pluripotentes inducidas derivados de los pacientes (iPSCs) son herramientas prometedoras para la terapia celular y la detección de drogas. Proporcionan una fuente autóloga de las células para la terapia. Además, abarcan un amplio conjunto de antecedentes genéticos, lo que permite un detallado análisis in vitro de enfermedades genéticas más allá de lo que las actuales líneas de células madre embrionarias (ESC) permitiría. Los avances recientes han conducido al desarrollo de varios métodos para la generación de iPSCs, incluyendo reprogramación con el virus Sendai, los plásmidos episomales o mRNAs 1,2. En particular, los diferentes métodos de reprogramación se asocian con diferentes niveles de eficiencia y seguridad, y es probable que difieran en otros aspectos que influyen en su idoneidad para diversas aplicaciones. Con la disponibilidad de una variedad de tecnologías de reprogramación, se ha convertido en importante desarrollar métodos para evaluar el proceso de reprogramación. La mayoría de los métodos existentes se basan en la inspección cualitativa de la morfología o la tincióncon colorantes y anticuerpos específicos de células madre. Un método recientemente desarrollado hace uso de la prensa de fluorescencia lentiviral que son sensibles a los miRNAs-PSC específico o ARNm específicos de células diferenciadas 3. Tales métodos de control facilitan la selección y optimización de técnicas de reprogramación para diferentes situaciones. Por ejemplo, CDy1 se ha utilizado como una sonda fluorescente para los primeros iPSCs con el fin de seleccionar moduladores de reprogramación 4. La capacidad de observar y comparar diferentes experimentos de reprogramación también es crítica para lograr una mejor comprensión del proceso en sí. Por ejemplo, ahora se sabe que algunos tipos de células somáticas son más fáciles de reprogramar que otros 5, y que las células pasan por estados intermedios durante la reprogramación 6-8. Desafortunadamente, los mecanismos que subyacen el proceso de reprogramación todavía no están completamente entendidos y en consecuencia, las diferencias exactas entre los métodos de reprogramación también quedan por defined. Por lo tanto, los métodos de supervisión, evaluación, y comparando los eventos de reprogramación siguen siendo crítico para el campo de células madre. Los métodos descritos en este protocolo permiten el seguimiento y la evaluación del proceso de reprogramación e ilustran cómo estas técnicas se pueden utilizar para comparar diferentes conjuntos de reactivos de reprogramación. El primer enfoque implica la citometría de flujo se analiza usando combinaciones de anticuerpos contra (PSC) marcadores de células madre pluripotentes positivo y negativo. El segundo enfoque parejas en tiempo real de imágenes y la medición de la confluencia total (porcentaje de área de superficie cubierta por las células) y confluencia de señales de marcación (por ciento del área de superficie cubierta por las señales fluorescentes).

<table><tbody><tr><td>DMEM, glucosa alta, GlutaMAXSupplement, piruvato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, calificado para células madre embrionarias, origen estadounidense</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16141-061</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), rojo de fenol&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Ratón (ICR) Fibroblastos embrionarios inactivados</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A24903</td><td></td></tr><tr><td>Proteína de factor de unión (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S-006-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, suplemento GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>10828010</tr><tr><td>2-Mercaptoetanol (55 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Colgenasa, Tipo IV, polvo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Enzima TrypLE Select (1x), sin rojo fenol&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563-011</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sin calcio, sin magnesio&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex Sin LDEV, con calificación hESC, factor de crecimiento reducido Matriz de membrana basal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413302</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Medio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA 1-155) Proteína humana recombinante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0264</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina bovina fracción V (solución al 7,5%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10.000 U/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>InSolution Y-27632</td><td>EMD Millipore</td><td>688001</td><td></td></tr><tr><td>Kit de reprogramación CytoTune-iPS Sendai</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1378001</td><td></td></tr><tr><td>Kit de reprogramación CytoTune-iPS 2.0 Sendai</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16517</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Contador de células automatizado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Countess Portaobjetos de cámara de recuento de células</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>BJ ATCC Fibroblastos del prepucio humano, neonatal</td><td>ATCC</td><td>CRL-2522</td><td></td></tr><tr><td>DF1 Fibroblasto dérmico humano adulto</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>BG01V/hOG Células variantes hESC hOct4-GFP Células reporteras</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R7799-105</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte ZOOM</td><td>Essen BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4 Anticuerpo, Alexa Fluor 647 conjugado (MC813-70)</td><td>Anticuerpo Thermo Fisher Scientific</td><td>SSEA421</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4, conjugado Alexa Fluor 488 (eBioMC-813-70 (MC-813-70)Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>A14810</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4 Anticuerpo (MC813-70)</td><td>Anticuerpo Thermo Fisher Scientific</td><td>41-4000</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 (cl.A)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 41-1000</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clon IM7), PE-Cy5 conjugado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A27094</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Alexa Fluor 488 Conjugado Kit para Imágenes de Células Vivas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25528</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clon IM7)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RM-5700 (ya no disponible)</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-ratón de cabra, conjugado Alexa Fluor 488 Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; A-11029</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-rata de cabra, conjugado Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; A-11007</td><td></td></tr><tr><td>Tinción viva de fosfatasa alcalina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14353</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Kit de conjugado para imágenes de células vivas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25618</td><td></td></tr><tr><td>CD24 Ratón Anti-mAb (clon SN3), conjugado FITC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MHCD2401</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo de microglobulina beta-2, conjugado FITC (B2M-01)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A15737</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM / CD326 Anticuerpo, FITC conjugado (VU-1D9)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A15755</td><td></td></tr><tr><td>CD73 / NT5E Anticuerpo (7G2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41-0200</td><td></td></tr><tr><td>VECTOR Kit de sustrato de fosfatasa alcalina roja (AP)</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-5100</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer.Z1 microscopio&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>491912-0003-000</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software de análisis de datos</td><td>FLOJO, LLC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Attune Citómetro de enfoque acústico, láser azul/rojo Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>Use Attune NXT&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>S3e\ Clasificador de células (488/561 nm)</td><td>BIO-RAD</td><td>1451006</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 12 x 75 mm Tubo con tapón de filtro de células</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml, de alta claridad, tapón de rosca con sello de cúpula</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Falcon T-75 Matraz</td><td>Corning</td><td>353136</td> Falcon T-175 Corning 353112 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plato de 6 pocillos Falcon</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Heracell CO2 Incubadora rodante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51013669</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microfuga antiadherentes, sin RNasa, 1,5 ml</td><td></td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>HulaMixer Mezclador</td><td></td> de muestras <td>15920D</td><td></td></tr></tbody></table>

cinética medición y visualización en tiempo real de la reprogramación somática

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

La reprogramación somática ha permitido la conversión de células adultas en células madre pluripotentes inducidas (iPSC) de diversos orígenes genéticos y fenotipos de enfermedades. Los avances recientes han identificado métodos más eficientes y seguros para la introducción de factores de reprogramación. Sin embargo, hay pocas herramientas para monitorear y rastrear la progresión de la reprogramación. Los métodos actuales para monitorizar la reprogramación se basan en la inspección cualitativa de la morfología o la tinción con colorantes y anticuerpos específicos de células madre. Las herramientas para diseccionar la progresión de la generación de iPSC pueden ayudar a comprender mejor el proceso en diferentes condiciones a partir de diversas fuentes celulares. 
Este estudio presenta enfoques clave para la medición cinética de la progresión de la reprogramación utilizando citometría de flujo, así como el monitoreo en tiempo real a través de imágenes. Para medir la cinética de la reprogramación, se realizó un análisis de flujo en puntos de tiempo discretos utilizando anticuerpos contra marcadores de células madre pluripotentes positivas y negativas. La combinación de la visualización en tiempo real y el análisis de flujo permite el estudio cuantitativo de la reprogramación en diferentes etapas y proporciona una comparación más precisa de diferentes sistemas y métodos. Se utilizó un análisis basado en imágenes en tiempo real para el monitoreo continuo de los fibroblastos a medida que se reprograman en un sistema de medio libre de alimentadores. La cinética de formación de colonias se midió en función de la confluencia en los canales de contraste de fase o fluorescencia después de la tinción con colorante de fosfatasa alcalina viva o anticuerpos contra SSEA4 o TRA-1-60. Los resultados indicaron que la medición de la confluencia proporciona métricas semicuantitativas para monitorear la progresión de la reprogramación.

Monitoreo Cinética reprogramación mediante citometría de flujo CD44 es un marcador de fibroblastos mientras SSEA4 es un marcador PSC 6,10. Como se esperaba de este patrón de expresión, citometría de flujo de los fibroblastos BJ muestra un SSEA4 - CD44 + población que facilita la creación de puertas de cuadrante en combinación con la muestra sin teñir. Durante la reprogramación de fibro...

El protocolo presentado en este estudio se describen métodos para la monitorización en tiempo real de la progresión de la reprogramación a través de la medición cinética de marcadores de células madre pluripotentes positivas y negativas utilizando citometría de flujo análisis. El protocolo también incluye la evaluación basada en la obtención de imágenes de la morfología y la expresión del indicador o marcador durante la generación de IPSC.

Cinética Medición y visualización en tiempo real de la reprogramación somática

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

El objetivo general de estos procedimientos es visualizar y rastrear la progresión de la reprogramación de células somáticas en células madre pluripotentes inducidas o iPSC. Este método puede utilizarse para responder preguntas clave en el campo de las iPSC, como la forma en que la cinética de reprogramación y las eficiencias de reprogramación se ven alteradas por los tejidos somáticos utilizados, las tecnologías de reprogramación aplicadas y las combinaciones de matriz y medio empleadas. La principal ventaja de este método es que utiliza marcadores de superficie celular para observar las transiciones de células somáticas hacia iPSC, de modo que se puede utilizar esta tecnología para monitorear en tiempo real los eventos de reprogramación.El día siete posterior a la transducción, lave los fibroblastos con dos mililitros de DPBS por pocillo y añada 0,5 mililitros de EDTA al 05% a 37 grados centígrados a cada pocillo para una incubación de tres a cinco minutos a 37 grados centígrados. Cuando las células se hayan redondeado, detenga la reacción con dos mililitros de medio para fibroblastos a 37 grados centígrados por pocillo y pipetee suavemente el medio a través del fondo de cada poc

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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Configuración de múltiples funciones para el estudio de control de motores Humano Usando estimulación magnética transcraneal, electromiografía, Captura de movimiento, y Realidad Virtual

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Aprende a medir la cinética de reprogramación somática en tiempo real mediante citometría de flujo e imágenes. Este protocolo permite monitorear marcadores de células pluripotentes durante la generación de iPSCs.

Cinética Medición y visualización en tiempo real de la reprogramación somática

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