Name: La detección de las proteínas de unión a ARN por In Vitro ARN desplegable de adipocitos Cultura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Aprende a detectar proteínas de unión a ARN mediante el protocolo de ARN pull-down in vitro utilizando lisados de adipocitos marrones. Este método optimizado facilita el estudio de interacciones específicas entre ARN y RBPs.

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Este trabajo fue financiado por Singapur NRF comunión (NRF-2011NRF-NRFF001-025), así como CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014).

NOTA: El ARN de interés en el contexto de este estudio es un fragmento de AR 3&#39;UTR. 1. Preparación de ARN marcado con biotina <ol><li> Para obtener el ARN, amplificar T7-AR-oligo por PCR, seguido por la transcripción in vitro utilizando un kit comercial y siguiendo las instrucciones del fabricante 11. NOTA: Los cebadores para PCR se enumeran en la Tabla 4: T7-AR-F y T7-AR-R. </li><li> Para el control de la unión no específica, amplificar una secuencia parcial del ADN de luciferasa de luciérnaga (FL) mediante PCR a partir psiCHECK-2 plásmido, seguido por la transcripción in vitro. NOTA: Los cebadores para PCR se enumeran en la Tabla 4: hluc (+) - T7-sonda-F y hluc (+) - sonda-R Tabla 4 Secuencias de molde y los cebadores para la amplificación por PCR... </li><li> Para un 50 l de reacción de PCR, mezclar 50 ng de ADN (oligo o plásmido), 4 dNTPs l (2,5 mM de cada dNTP individuales), 5 l de 10x tampón de reacción, 1 l 2,5 U / &amp; #181; l de ADN polimerasa, 2 l 10 mM de cebador directo, 2 l 10 mM cebador inverso, y agua libre de nucleasa. <ol><li> Ejecutar la amplificación por PCR en un termociclador usando el siguiente programa. Paso 1: un ciclo de 95 ° C durante 2 min; Paso 2: 35 ciclos de 95 ° C durante 30 segundos, 55 ° C durante 30 segundos y 72 ° C durante 30 segundos (AR) o 60 segundos (FL); Paso 3: un ciclo de 72 ° C durante 10 min. </li></ol></li><li> Sintetizar ARN con biotina utilizando un kit de transcripción in vitro siguiendo las instrucciones del fabricante 11. En este experimento, utilizar productos de PCR como plantillas para la síntesis de ARN. Para una reacción de 20 l transcripción in vitro, mezclar 200 ng de ADN amplificado por PCR, 2 l de cada NTP individual, 1 l 10 mM de biotina-CTP, tampón de reacción de 2 l de 10x, y 2 l de ARN polimerasa de T7. Incubar la mezcla a 37 ° C durante 4 h. </li><li> Después de la transcripción in vitro, mezcla de reacción tratamiento con 1 l 2 U de DNasa / l a 37 &amp; #176; C durante 15 minutos para degradar la plantilla de ADN. Por último, se diluye la ARN biotinilado a un volumen total de 60 l para la purificación posterior. </li><li> Se purifica ARN con biotina para eliminar las sales y los nucleótidos no incorporados mediante el uso de columnas de purificación siguiendo las instrucciones del fabricante 12. Medir la concentración de ARN y se almacena a -80 ° C durante pull-down ensayos posteriores. </li><li> Para asegurar la estructura secundaria apropiada para el ARN de interés por la interacción de ARN-proteína, de calor 50 l de ARN biotinilado (50 pM) a 90 ° C durante 2 min, enfriar en hielo durante 2 min, a continuación, suministrar con 50 l de 2x tampón de la estructura del ARN (Tabla 3), y permitir el plegamiento del ARN a TA durante 30 min 13,14. </li></ol> 2. Preparación de perlas de ARN conjugado NOTA: Utilice un soporte magnético para la separación de las perlas magnéticas y sobrenadante. <ol><li> Volver a suspender las perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina en el vial original mediante una breve vortexing siguiendo las instrucciones del fabricante. Transferir 150 l perlas se volvieron a suspender a un tubo de 1,5 ml. Se coloca el tubo en el imán durante 1 min. sobrenadante de descarte. Mantenga sedimento de perlas. NOTA: En los ensayos de pull-down de ARN, cuando una alícuota de perlas se volvieron a suspender a partir vial original, utilizar 50 perlas l para un ensayo seguido por el Western Blot, y 200 bolas l para un ensayo seguido de la EM. </li><li> Lavar perlas una vez por la re-suspensión de sedimento de perlas con 1 ml de recomendada por el fabricante 1x W &amp; B tampón (Tabla 3) (unión y lavado), seguido de girar el tubo durante 5 minutos a temperatura ambiente en un rotador. sobrenadante de descarte. Mantenga sedimento de perlas. </li><li> Para inactivar la RNasa sobre perlas, perlas de lavar dos veces, cada vez por la re-suspensión de sedimento de perlas con 400 l de tampón A. El tampón A es una solución alcalina que contiene NaOH 0,1 M y 0,05 M NaCl (Tabla 3). Girar el tubo durante 2 min a temperatura ambiente en un rotador. sobrenadante de descarte. Mantenga sedimento de perlas. </li> &lt;li&gt; Para eliminar NaOH a partir de perlas, perlas de lavar dos veces, cada vez por la re-suspensión de sedimento de perlas con 400 l de tampón B (Tabla 3), seguido por la rotación del tubo durante 2 minutos a temperatura ambiente en un rotador. sobrenadante de descarte. Mantenga sedimento de perlas. </li><li> Volver a suspender sedimento de perlas con 300 l 2 x W &amp; B tampón, perlas dividida en partes iguales y transferir en tres tubos de 1,5 ml (100 granos l por tubo). Suministrar los tubos que contienen de talones con 100 l de RNasa libre de agua, 100 l con biotina ARN FL y 100 l biotina AR 3&#39;UTR ARN, respectivamente. </li><li> Incubar cada mezcla de microesferas durante 1 hr a temperatura ambiente con rotación. Colocar los tubos en el imán durante 1 min. Desechar todo el sobrenadante. Mantener los gránulos de talón. </li><li> Lavar perlas dos veces, cada vez por la re-suspensión de cada sedimento de perlas con 400 l 1x W &amp; B tampón, seguido de tubos giratorio durante 5 min a temperatura ambiente en un rotador. </li><li> Colocar los tubos en el imán durante 1 min. Desechar todo el sobrenadante. Resuspender cada grano pellet con 50 l de tampón de aislamiento nuclear (Tabla 3). </li></ol> 3. Aislamiento de preadipocitos y adipogénesis inducción <ol><li> Como se ha descrito en publicaciones anteriores 5, diseccionar preadipocitos de la almohadilla de grasa marrón interescapular (C57BL6 ratones de tipo salvaje, 3 semanas de edad). </li><li> Crecer y diferenciarse in vitro los preadipocitos 5. Las células están listas para la aplicación aguas abajo 4-5 días después de la iniciación de la diferenciación. </li></ol> 4. Preparación de lisado celular de los adipocitos primarios NOTA: Asegúrese de que todos los procedimientos de preparación de lisado celular se realizan en el hielo, y todos los tampones se enfrió en hielo. Pre-térmica del homogeneizadores de vidrio Dounce en hielo. <ol><li> Crecer y diferenciarse preadipocitos en 15 cm platos 5 (ver sección 3.2). Cada plato proporciona células adecuadas para el ensayo desplegable uno ARN. En el día 4 o 5 días de diferenciación, medio de cultivo celular de descarte, y ce lavarLLS una vez con PBS 1x. </li><li> Para cosechar las células, añadir 10 a 15 ml de 1x PBS a las células, raspar para recoger las células en un tubo de 50 ml, y las células de pellets por centrifugación a 200 xg durante 5 min a TA. Desechar el sobrenadante mediante el uso de 1 ml pipeta. </li><li> Resuspender pellet de células en 2 ml de tampón hipotónico (Tabla 3), e incubar las células en hielo durante 15 min. La transferencia de células a un homogeneizador de vidrio Dounce de 15 ml, y las células de cizalla mecánicamente en hielo con 20 golpes. </li><li> Pellets núcleos de las células por centrifugación a 3.300 xg durante 15 min a 4 ° C. Mantenga pellets núcleos en hielo para su uso posterior (ver sección 4.6). Transferir el sobrenadante a tubos de 1,5 ml, añadir 3M KCl al sobrenadante para obtener una concentración final de 150 mM, y centrifugado a 20.000 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Después de la centrifugación, retirar con cuidado lipidlayeron la parte superior mediante el uso de una pipeta de 1 ml, y recoger el sobrenadante como el lisado celular citoplasmática. </li><li> Resuspender pellet núcleos (ver sección 4.4) en 1 ml de tampón de aislamiento nuclear. Tnúcleos RANSFERENCIA a un homogeneizador de vidrio Dounce de 15 ml usando una pipeta de 1 ml, y los núcleos de cizalla mecánica sobre hielo con 100 golpes. Sedimentar los restos nucleares por centrifugación a 20.000 xg durante 15 min a 4 ° C, y recoger el sobrenadante como el lisado celular nuclear. </li><li> O bien combinar los lisados ​​celulares nucleares y citoplasmáticos, o utilizar cada fracción por separado, para su aplicación desplegable aguas abajo. En este experimento de demostración, estas dos fracciones de lisado de células se combinaron a una relación en volumen de 1: 1. </li><li> Añadir inhibidor de RNasa a este lisado celular no fraccionada para obtener una concentración final de 0,5 U / l. Destinará 100 l de lisado celular como control de entrada para el Western Blot 15. </li></ol> 5. encuadernación y elución de RBP <ol><li> lisado de células de Split en tres alícuotas iguales (lisado de células de 1 ml en un tubo de 1,5 ml), e incubar con blanco, FL RNA-conjugado y perlas de AR 3&#39;UTR ARN-conjugados (véase la sección 2.8), respectivamente, durante 3 horas a 4 ° docon la rotación. </li><li> Colocar los tubos en el imán durante 1 min. Recoger el sobrenadante usando una pipeta de 1 ml, seguido de aislamiento de ARN a partir del sobrenadante para confirmar RNA integralidad. Aislar el ARN mediante el uso de una solución de tiocianato de guanidinio-fenol ácido siguiendo las instrucciones del fabricante (Tabla 2). Evaluar la integridad de ARN mediante el análisis de 28S y 18S subunidades de ARN ribosómico. Mantener los gránulos de bolas en hielo. </li><li> Lavar las perlas magnéticas seis veces, cada vez por resuspensión cada sedimento de perlas con 1 ml de tampón de aislamiento nuclear que contiene 40 U de RNasa inhibidor y 0,25% de Igepal, seguido de tubos giratorio para 2 min a temperatura ambiente en un rotador. Utilice un soporte magnético para la separación de las perlas magnéticas y sobrenadante. Desechar todo el sobrenadante. Mantener los gránulos de bolas en hielo. </li><li> Utilice los pasos siguientes para eluir los complejos de ARN-proteína de los granos para el Western Blot. En primer lugar, volver a suspender cada sedimento de perlas en 75 l de tampón de aislamiento nuclear; a continuación, se añaden 25 l de 4x western blot carga buffer (que contiene SDS) para obtener un volumen total de 100 l. Finalmente, hervir perlas en esta solución 100 l a 95 ° C durante 5 min. NOTA: Utilice los siguientes pasos para eluir los complejos de ARN-proteína de los granos para la EM. Paso 1: resuspender cada sedimento de perlas en 100 l de tampón de elución (Tabla 3); PASO 2: incubar muestras de perlas durante 2-3 horas a temperatura ambiente con rotación; PASO 3: centrífuga y recoger el sobrenadante que contiene proteína; PASO 4: concentrar soluciones de proteínas de 20-30 l antes de su presentación para la EM. </li><li> Centrifugar cada 100 l de muestra de perlas a 12.000 xg durante 30 segundos a 4 ° C, y recoger el líquido sobrenadante. Alícuota de sobrenadante de 15 l para el análisis de western blot (ver sección 6.1 y 6.2). Sonda de la membrana resultante con el anticuerpo monoclonal Hur ratón diluido (dilución 1: 1000), durante la noche. </li></ol> 6. Transferencia Western para la verificación de las prácticas comerciales restrictivas <ol><li> Las prácticas comerciales restrictivas separadas por SDS-PAGE utilizando técnicas estándar. </li><li> realizar nospopa secante utilizando técnicas estándar mediante el sondeo de las prácticas comerciales restrictivas asociados con el ARN de interés. NOTA: En este experimento de demostración, se utilizó el anticuerpo monoclonal de ratón Hur para la inmunodetección de la proteína Hur. </li><li> Incubar la membrana resultante con el anticuerpo Hur diluido (dilución 1: 1000) en 5% w / v de leche en polvo sin grasa, 1x TBS, 0,1% Tween - 20 al 4 ° C con agitación suave, durante la noche. Lavar la membrana tres veces con 1x TBST. Incubar la membrana con el anticuerpo secundario (de cabra anti-IgG de ratón-HRP) a temperatura ambiente durante 1 hr. membrana Wash. Desarrollar y señal de grabación. </li></ol>

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

lncRNAs y las prácticas comerciales restrictivas tienen un papel vital en la salud y la enfermedad, sin embargo los mecanismos moleculares de estas moléculas son poco conocidos. Identificación de proteínas que interactúan con moléculas lncRNA es un paso clave para dilucidar los mecanismos de regulación. El enriquecimiento de las prácticas comerciales restrictivas por el sistema de ensayo desplegable ARN se basa en la captura en solución de interactuar complejo de manera que las proteínas de un lisado de células se puede...

A correction to the author list was made to: <a href="http://www.jove.com/video/54207/detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte">Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture</a>.
The author list has been updated from:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
*These authors contributed equally
to:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
3Division of Bioengineering, School of Chemical &#38; Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
*These authors contributed equally

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Prácticas comerciales restrictivas son proteínas que se unen al ARN de doble o de cadena sencilla en las células y participan en la formación de complejos de ARN-proteína. Las prácticas comerciales restrictivas pueden unir una variedad de especies de ARN, incluyendo ARN no codificantes de ARNm y largos (lncRNAs), y ejercer su influencia a nivel post-transcripcional. Ambas prácticas comerciales restrictivas y lncRNAs están surgiendo como nuevos reguladores en el desarrollo adiposo y funcionan 1,2,3. Para entender el mecanismo de RBP- y regulación lncRNA mediada de vías celulares, a menudo es necesario para detectar la interacción entre una molécula de ARN específico y una o varias prácticas comerciales restrictivas, y, a veces, para identificar el espectro completo de proteínas asociados de un ARN transcripción. Sin embargo, el experimento puede ser difícil debido al alto contenido de lípidos en los adipocitos. El protocolo desplegable RNA descrito aquí se puede emplear para recuperar los compañeros de la proteína de un ARN específico de los lisados ​​de adipocitos de cultivos primarios 4,5. Justificación de este protoCol se resume de la siguiente manera. Un cebo de ARN es transcrito in vitro a partir de un molde de ADN, marcado con biotina y conjugado a perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina 4. El cebo de ARN se incuba con lisados ​​celulares para permitir la formación de complejos de ARN-proteína, que se extraen posteriormente hacia abajo en un soporte magnético. Más específicamente, el protocolo desplegable RNA describe a continuación utilizar un fragmento de ARN de AR 3&#39;UTR como el cebo para recuperar proteína Hur, un RBP expresado universalmente unido a 3&#39;UTR de ARNm de 6,7, de theadipocytelysate de cultivo primario. Para probar la especificidad de unión de este ensayo, un RNAas no relevantes así como perlas de estreptavidina en blanco se incluyen como control. Este protocolo es compatible con el Western Blot o espectrometría de masas (MS) para confirmar la captura de un RBP específica o para identificar el repertorio completo de las prácticas comerciales restrictivas capturados 8, respectivamente. Hay disponibles varias técnicas para estudiar la interacción proteína-ARNs. Para revelar los ARN unidos por un determinado RBP, RIP (ARN inmunoprecipitación) y CLIP (reticulación UV e inmunoprecipitación) se puede aplicar. Por el contrario, para identificar proteínas asociados de un determinado ARN, ARN desplegable, Chirp (cromatina aislamiento mediante la purificación del ARN), gráfico (análisis de hibridación de captura de dianas de ARN) y el PAR (purificación de ARN antisentido) se puede aplicar. En comparación con los posteriores, la técnica desplegable ARN requiere menos esfuerzo de configurar. Puede ser empleado para capturar proteínas in vitro e in vivo. El enfoque in vivo de ARN desplegable, que es técnicamente más difícil que su homólogo in vitro, preserva las interacciones ARN-proteína por reticulación en las células, capta los ARN aptamer etiquetado de interés a partir de células, y, posteriormente, detecta las prácticas comerciales restrictivas consolidados. ARN desplegable se puede utilizar para enriquecer las prácticas comerciales restrictivas bajas abundantes, y para aislar e identificar los complejos de proteínas y ARN que tienen diversos roles funcionales en el control de la regulación celular 9,10 </sarriba&gt;.

<table><tbody><tr><td>Principales materiales utilizados en este estudio.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript kit</td><td>&nbsp; Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotina-14-CTP&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucAway columnas de centrifugación&nbsp;</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Estreptavidina&nbsp;</td>Anticuerpo monoclonal de ratón <td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HuR (3A2) (sc-5261)&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón IgG-HRP (sc-2005)&nbsp;</td>Agua de grado de biología molecular Hypure de Santa <td>Cruz Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(sin nucleasas)&nbsp;</td>Tampón de fosfato <td>HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>solución salina (1&veces; PBS)</td><td>&nbsp; Inhibidor</td> de la ARNasa HyClone<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Inhibidor</td> de la proteasa Bioline<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pfu Turbo ADN polimerasa&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIsure</td><td>&nbsp; Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Equipo principal utilizado en este estudio.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Sorvall Legend Micro 21R&nbsp;</td><td>Centrífuga Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1R&nbsp;</td><td>Termociclador Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad T100&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000&nbsp;</td><td>Rotor Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BOECO Multi Bio RS-24&nbsp;</td><td>BOECO,Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparato de electroforesis y transferencia de gel de proteínas&nbsp;</td><td>Imán Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2&nbsp;</td><td>Tecnologías de la Vida</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la detección de las proteínas de unión a arn por<em&gt; in vitro</em&gt; arn desplegable de adipocitos cultura

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

proteínas de unión a ARN (prácticas comerciales restrictivas) están emergiendo como una capa de regulación en el desarrollo y la función del tejido adiposo. Prácticas comerciales restrictivas juegan un papel clave en la regulación de la expresión génica a nivel posttranscriptional al afectar la eficiencia de la estabilidad y de la traducción de ARNm diana. técnica desplegable RNA ha sido ampliamente utilizado para estudiar la interacción de ARN-proteína, que es necesaria para dilucidar el mecanismo de la función de las prácticas comerciales restrictivas &quot;, así como largos ARN no codificante&quot; (lncRNAs) subyacente. Sin embargo, la alta abundancia de lípidos en los adipocitos plantea un desafío técnico en la realización de este experimento. Aquí un protocolo desplegable ARN detallada está optimizado para el cultivo de adipocitos primaria. Un fragmento de ARN a partir de (AR) 3 &#39;no traducida del receptor de andrógenos (3&#39;UTR) que contiene un elementwas adenilato-uridylate ricos utilizados como un ejemplo para demostrar cómo recuperar su socio RBP, proteínas Hur, de lystate adipocito. El método descrito aquí se puede aplicar para detectar las interacciones entrePrácticas comerciales restrictivas y ARN no codificantes, así como entre las prácticas comerciales restrictivas y ARN de codificación.

En este experimento de demostración, un fragmento de ARN AR se utilizó como cebo para capturar su proteína de unión Hur. Tanto un ARN cebo FL que no es relevante para la proteína Hur, y una alícuota de perlas de estreptavidina en blanco no conjugados sirvieron como controles negativos. interacciones ARN-proteína puede ocurrir ya sea en el núcleo o citoplasma, y ​​este protocolo desplegable se puede aplicar a total o fraccionado lisados ​​celulares (citoplásmicos o nuclear). Análisis de p...

Un protocolo desplegable ARN se optimiza aquí para la detección de interacciones entre proteínas de unión a ARN (prácticas comerciales restrictivas) y no codificante, así como los ARN de codificación. Un fragmento de ARN de receptor de andrógenos (AR) se utilizó como un ejemplo para demostrar cómo recuperar su RBP de lystate de adipocitos marrones primarios.

La detección de las proteínas de unión a ARN por<em&gt; In Vitro</em&gt; ARN desplegable de adipocitos Cultura

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

El objetivo general de este experimento es recuperar proteínas que se unen al ARN de un transcrito de ARN a partir de tejido adiposo pardo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en este campo, como, ¿cuáles son los mecanismos reguladores del ARN codificante de larga vida y de las proteínas asociadas al ARN? La principal ventaja de esta estrategia es que es fácil de realizar.El ARN utilizado para demostrar este procedimiento es un fragmento de la Región No Traducida del Extremo 3-Prime del Receptor de Antígeno, en adelante denominada AR 3-Prime UTR. Comience amplificando el oligonucleótido T7 AR y la secuencia parcial del ADN de luciferasa de luciérnaga a partir del plásmido psiCHECK-2. Los cebadores y parámetros utilizados se detallan en el documento adjunto.Después de la amplificación, utilice los productos de PCR como plantillas para sintetizar ARN biotinilados utilizando un kit de transcripción in vitro, siguiendo las instrucciones del fabricante. Luego, incube la mezcla a 37 grados Celsius durante cuatro horas. Después de la transcripción in vitro, agregue un microlitro de DNasa a la reacción e incube durante 15 minutos a 37 grados Celsius para degradar el ADN plantilla.Luego, aforar hasta un volumen final de 60 microlitros con agua. Aplicar los ARN biotinilados en columnas de purificación para eliminar la sal y los nucleótidos no incorporados. A continuación, tras medir la concentración de ARN, almacenar el ARNasa a menos 80 grados Celsius para ensayos de precipitación posteriores.El día del ensayo, descongele el ARN biotinilado congelado sobre hielo. Luego, para asegurar que el ARN de interés tenga la estructura secundaria adecuada, caliente 50 microlitros de este a 90 grados Celsius durante dos minutos. Enfríe en hielo durante dos minutos.A continuación, agregue 50 microlitros de tampón 2X para estructura de ARN y deje que el ARN se pliegue a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, re suspenda las perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina en su vial original agitándolas brevemente en vórtex. Luego, transfiera 150 microlitros de las perlas re suspendidas a un tubo de 1,5 mililitros.Coloque el tubo en un soporte magnético durante un minuto para separar las perlas magnéticas del sobrenadante. Utilice una pipeta para retirar y desechar el sobrenadante. Mantenga el pellet de perlas.Lave las perlas una vez resuspendiendo el pellet de perlas en un mililitro del tampón de unión y lavado 1X recomendado por el fabricante, y luego coloque el tubo en un rotador durante cinco minutos a temperatura ambiente. Lave con tampón A y tampón B dos veces. Tras la incubación, deseche el sobrenadante y conserve el pellet de perlas.A continuación, resuspenda el precipitado de perlas en 300 microlitros de tampón de lavado y unión 2X. Divida las perlas equitativamente en tres tubos de 1,5 mililitros con 100 microlitros de perlas por tubo. Añada 100 microlitros de agua libre de RNasas, 100 microlitros de ARN de luciferasa de luciérnaga biotinilado y 100 microlitros de ARN del UTR 3' del AR biotinilado.Incube cada mezcla de perlas durante una hora a temperatura ambiente con rotación. Luego, coloque los tubos en el imán durante un minuto. Retire y deseche el sobrenadante.Mantenga los pellet de perlas. A continuación, lave las perlas dos veces, resuspendiendo cada vez los pellet de perlas con 400 microlitros de tampón de lavado y unión 1X, y luego colóquelas en el rotador durante cinco minutos a temperatura ambiente. Coloque los tubos en un imán durante un minuto.Luego, retire y deseche todo el sobrenadante. Reuspenda cada precipitado de perlas en 50 microlitros de tampón de aislamiento nuclear. Como preparación para la siguiente parte del protocolo, asegúrese de que todos los tampones, así como los homogenizadores de vidrio Dounce, se enfríen en hielo.La preparación del lisado celular debe realizarse sobre hielo. Para cada ensayo de retención de ARN que se vaya a realizar, prepare un plato de 15 centímetros con preadipocitos diferenciados procedentes de ratones C57 Black Six de tres semanas de edad, de tipo silvestre. Cuatro o cinco días después, para recolectar las células, agregue de 10 a 15 mililitros de PBF y luego use un raspador celular para separar las células del plato.Trasfiera las muestras a un tubo de 50 mililitros y luego forme el pellet por centrifugación a 200 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, use una pipeta de un mililitro para aspirar y descartar el sobrenadante. A continuación, resuspenda el pellet celular en dos mililitros de tampón hipotónico e incube las células en hielo durante quince minutos.Transfiera las células a un homogenizador de vidrio Dounce de 15 mililitros y rompa mecánicamente las células en hielo con 20 movimientos. Pelote los núcleos celulares mediante centrifugación a 3300 ×g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius. Después de la centrifugación, transfiera el sobrenadante a tubos de 1,5 mililitros y mantenga el precipitado en hielo para su uso posterior.Al sobrenadante, añada cloruro de potasio 3 molar para obtener una concentración final de 150 milimolar. Centrifugue a 20.000 ×g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius. Tras la centrifugación, habrá una capa lipídica en la parte superior.Utilice una pipeta de un mililitro para eliminarlo cuidadosamente. A continuación, recoja el sobrenadante del lisado celular citoplasmático. Después, usando una pipeta de un mililitro, resuspenda el sedimento de núcleos en un mililitro de tampón de aislamiento nuclear y transfiera a un homogenizador de vidrio Dounce de 15 mililitros.Fragmentar mecánicamente los núcleos en hielo con 100 movimientos. Pelar los restos nucleares mediante centrifugación a 20.000 ×g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius. Recoger el sobrenadante como el lisado celular nuclear.Estos pueden combinarse con el lisado citoplasmático recolectado anteriormente o mantenerse separados para aplicaciones posteriores. Aquí, las muestras se combinan en una proporción uno a uno. Añada inhibidor de RNasa al lisado celular no fraccionado para obtener una concentración final de 0.5 unidades por microlitro.Luego, separe 100 microlitros del lisado celular en hielo como control de entrada para la transferencia Western. Divida el lisado celular en tres alícuotas iguales con un mililitro de lisado celular en cada tubo de 1,5 mililitros e incube con AR de luciferasa de luciérnaga sin marca y perlas conjugadas con la región UTR 3' del AR, respectivamente, durante tres horas a cuatro grados Celsius con rotación. Después de la incubación, coloque los tubos en el imán durante un minuto.Utilice una pipeta de un mililitro para recoger el sobrenadante, luego aísle el ARN y evalúe la integridad del ARN según se describe en el documento adjunto. Mantenga los pellet de perlas en hielo. Lave las perlas magnéticas seis veces.Cada vez, resuspenda los pellet de perlas en un mililitro de tampón de aislamiento nuclear que contenga 40 unidades de inhibidor de RNasa y 0,25 por ciento de igepal. Incube los tubos en rotación durante dos minutos a temperatura ambiente. Coloque los tubos en un soporte magnético para separar las perlas magnéticas del sobrenadante.Después de un minuto, aspire y deseche el sobrenadante, luego coloque los pellet de perlas sobre hielo. Para eluir los complejos de ARN y proteína de las perlas para inmunotransferencia, primero, resuspenda cada pellet de perlas en 75 microlitros de tampón de aislamiento nuclear. A continuación, agregue 25 microlitros de tampón de carga 4X para inmunotransferencia.que contenga SDS, para obtener un volumen total de 100 microlitros. Finalmente, hervir las perlas en esta solución de 100 microlitros a 95 grados Celsius durante cinco minutos. Realizar un inmunotransferencia (western blot) para verificar la RBP según se describe en el documento adjunto.En este experimento, se utilizó un fragmento de ARN del receptor de antígeno como cebo para capturar su proteína ligante, HuR. Tanto un cebo de ARN de luciferasa de luciérnaga no relacionado con la proteína HuR como una alícuota de perlas de estreptavidina en blanco sin conjugación sirvieron como controles negativos. Las interacciones ARN-proteína pueden ocurrir en el núcleo o en el citoplasma, y este protocolo de precipitación puede aplicarse a lisados celulares totales o fraccionados, nucleares o citoplasmáticos.El análisis mediante inmunotransferencia mostró la proteína HuR en el lisado celular sin fraccionar, o muestra de entrada, utilizando el anticuerpo monoclonal. La fracción de elución de ARN del receptor de antígeno también dio un resultado positivo, lo que indica la presencia de la proteína HuR en el lisado de adipocitos utilizando perlas conjugadas con ARN del receptor de antígeno para el ensayo de precipitación de ARN. Tanto la fracción de elución de ARN de luciferasa de luciérnaga como la muestra de perlas en blanco dieron resultados negativos, lo que indica que las interacciones no específicas no fueron detectables mediante este enfoque.En conjunto, estos resultados sugieren que la interacción entre el fragmento de ARN del receptor de antígeno y la proteína HuR fue específica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo recuperar proteínas que se unen al ARN a partir de un transcrito de ARN del tejido adiposo pardo. Una vez dominado, este procedimiento puede realizarse en 24 horas, si se lleva a cabo correctamente.

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Investigación

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Biología

Un paso a paso el protocolo para aislar e identificar los complejos de ARN asociados a través de RIP-Chip.

Método para el aislamiento e identificación de mRNAs, microRNAs y componentes proteicos de ribonucleoprotein complejos de extractos celulares usando RIP-Chip

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