La detección de las proteínas de unión a ARN por In Vitro ARN desplegable de adipocitos Cultura

El objetivo general de este experimento es recuperar proteínas de unión al ARN de una transcripción de ARN del tejido adiposo marrón. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en este campo, como cuáles son los mecanismos reguladores del ARN codificante de larga duración y las proteínas de ARN asociadas. La principal ventaja de esta táctica es que es fácil de realizar.

El ARN utilizado para demostrar este procedimiento es un fragmento de la región no traducida del receptor de antígeno 3-Prime, en lo sucesivo denominada AR 3-Prime UTR. Comience amplificando el oligonucleótido T7 AR y la secuencia parcial del ADN de luciferasa de luciérnaga del plásmido psiCHECK-2. Los cebadores y parámetros utilizados se detallan en el documento adjunto.

Después de la amplificación, utilice los productos de PCR como plantillas para sintetizar ARN biotinilados utilizando un kit de transcripción in vitro, siguiendo las instrucciones del fabricante. Luego, incuba la mezcla a 37 grados centígrados durante cuatro horas. Después de la transcripción in vitro, agregue un microlitro de Dnase a la reacción e incube a 37 grados Celsius durante 15 minutos para degradar el ADN moltal.

Luego, lleve el volumen total a 60 microlitros con agua. Aplique los ARN biotinilados a las columnas de purificación para eliminar la sal y los nucleótidos no incorporados. Luego, después de medir la concentración de ARN, almacene la RNasa a menos 80 grados Celsius para ensayos posteriores de extracción posterior.

El día del ensayo, descongele el ARN biotinilado congelado en hielo. Luego, para asegurarse de que el ARN de interés tenga la estructura secundaria adecuada, caliente 50 microlitros a 90 grados centígrados durante dos minutos. Enfríe sobre hielo durante dos minutos.

A continuación, agregue 50 microlitros de tampón de estructura de ARN 2X y deje que el ARN se pliegue a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, vuelva a suspender las perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina en su vial original mediante un vórtice breve. A continuación, transfiera 150 microlitros de las perlas resuspendidas a un tubo de 1,5 mililitros.

Coloque el tubo en un soporte magnético durante un minuto para separar las perlas magnéticas y el sobrenadante. Utilice una pipeta para extraer y desechar el sobrenadante. Guarde la bolita de cuentas.

Lave las perlas una vez volviendo a suspender el pellet de perlas en un mililitro del tampón de encuadernación y lavado 1X recomendado por el fabricante, y luego coloque el tubo en un rotador durante cinco minutos a temperatura ambiente. Lavar con tampón A y tampón B dos veces. Después de la incubación, deseche el sobrenadante y guarde la bolita de perlas.

A continuación, vuelva a suspender el pellet de perla en 300 microlitros de tampón de lavado y unión 2X. Divida las cuentas en partes iguales en tres tubos de 1,5 mililitros con 100 microlitros de cuentas por tubo. Añadir 100 microlitros de agua libre de RNasa, 100 microlitros de ARN luciferasa de luciferasa biotinilado y 100 microlitros de ARN AR 3-Prime UTR biotinilado.

Incube cada mezcla de cuentas durante una hora a temperatura ambiente con rotación. Luego, coloque los tubos en el imán durante un minuto. Retire y deseche el sobrenadante.

Guarde las bolitas de cuentas. A continuación, lave las cuentas dos veces, cada vez resuspendiendo los gránulos de cuentas con 400 microlitros de tampón de lavado y encuadernación 1X, y luego colóquelos en el rotador durante cinco minutos a temperatura ambiente. Coloque los tubos en un imán durante un minuto.

Luego, retire y deseche todo el sobrenadante. Vuelva a suspender cada gránulo de perlas en 50 microlitros de tampón de aislamiento nuclear. En preparación para la siguiente parte del protocolo, asegúrese de que todos los tampones, así como los homogeneizadores de vidrio de rebote, se enfríen con hielo.

La preparación del lisado celular debe realizarse en hielo. Para cada ensayo de extracción de ARN que se vaya a realizar, prepare un plato de 15 centímetros de preadipocitos diferenciados de ratones C57 Black Six de tipo salvaje C57 de tres semanas de edad. Cuatro o cinco días después, para recolectar las células, agregue de 10 a 15 mililitros de PBF y luego use un raspador de células para eliminar las células del plato.

Transfiéralos a un tubo de 50 mililitros y luego péguelos por centrifugación a 200 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después del centrifugado, utilice una pipeta de un mililitro para aspirar y desechar el sobrenadante. A continuación, vuelva a suspender el pellet celular en dos mililitros de tampón hipotónico e incube las células en hielo durante quince minutos.

Transfiera las células a un homogeneizador de vidrio de 15 mililitros y corte las células mecánicamente sobre hielo con 20 golpes. Granular los núcleos celulares por centrifugación a 3300 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Después del centrifugado, transfiera el sobrenadante a tubos de 1,5 mililitros y mantenga la bolita en hielo para su uso posterior.

Al sobrenadante, agregue cloruro de potasio 3-molar para obtener una concentración final de 150 milimolares. Girar a 20.000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, habrá una capa lipídica en la parte superior.

Utilice una pipeta de un mililitro para retirarlo con cuidado. A continuación, recoja el sobrenadante de lisado celular citoplásmico. A continuación, con una pipeta de un mililitro, vuelva a suspender el pellet de núcleos en un mililitro de tampón de aislamiento nuclear y transfiéralo a un homogeneizador de vidrio de 15 mililitros.

Cizallar los núcleos mecánicamente sobre hielo con 100 golpes. Granular los restos nucleares por centrifugación a 20.000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Recoge el sobrenadante como el lisado celular nuclear.

Estos pueden combinarse con el lisado citoplasmático recolectado anteriormente o mantenerse separados para aplicaciones posteriores. Aquí, las muestras se combinan en una proporción de uno a uno. Añadir inhibidor de RNasa al lisado celular no fraccionado para obtener una concentración final de 0,5 unidades por microlitro.

A continuación, reserve 100 microlitros de la célula lisada en hielo como control de entrada para el Western blot. Divida el lisado celular en tres alícuotas iguales con un mililitro de lisado celular en cada tubo de 1,5 mililitros e incube con perlas conjugadas de ARN luciferasa luciferasa de luciérnaga en blanco y perlas conjugadas AR 3-Prime UTR, respectivamente, durante tres horas a cuatro grados Celsius con rotación. Después de la incubación, coloque los tubos en el imán durante un minuto.

Utilice una pipeta de un mililitro para recoger el sobrenadante, luego aísle el ARN y evalúe la integridad del ARN como se describe en el documento adjunto. Mantenga los gránulos de cuentas en hielo. Lave las cuentas magnéticas seis veces.

Cada vez, vuelva a suspender los gránulos de perlas en un mililitro de tampón de aislamiento nuclear que contenga 40 unidades de inhibidor de ARNasa y 0,25 por ciento de igepal. Gire los tubos durante dos minutos a temperatura ambiente. Coloque los tubos en un soporte magnético para separar las perlas magnéticas y el sobrenadante.

Después de un minuto, aspire y deseche el sobrenadante, luego coloque los gránulos de cuentas en hielo. Para eluir los complejos de proteínas de ARN de las perlas para la transferencia occidental, primero, vuelva a suspender cada gránulo de perlas en 75 microlitros de tampón de aislamiento nuclear. A continuación, añada 25 microlitros de tampón de carga Western blot 4X.

que contiene SDS, para obtener un volumen total de 100 microlitros. Finalmente, hierva las perlas en esta solución de 100 microlitros a 95 grados centígrados durante cinco minutos. Realice la transferencia occidental para la verificación de RBP como se describe en el documento adjunto.

En este experimento, se utilizó un fragmento de ARN del receptor de antígeno como cebo para capturar su proteína de unión, HuR. Tanto un cebo de ARN de luciferasa luciérnaga no relacionado con la proteína HuR como una alícuota de perlas de estreptavidina en blanco no conjugadas sirvieron como controles negativos. Las interacciones de proteínas de ARN pueden ocurrir en el núcleo o en el citoplasma, y este protocolo de reducción se puede aplicar a lisados de células nucleares o citoplasmáticas totales o fraccionadas.

El análisis por Western blot mostró la proteína HuR en el lisado celular no fraccionado, o entrada, utilizando el anticuerpo monoclonal. La fracción de elusión del ARN del receptor de antígeno también dio un resultado positivo, lo que indica la presencia de la proteína HuR en el lisado de adipocitos utilizando las perlas conjugadas de ARN del receptor de antígeno para el ensayo de extracción de ARN. Tanto la fracción de elución de ARN de luciferasa luciferasa como la muestra de perlas en blanco dieron resultados negativos, lo que indica que las interacciones inespecíficas no fueron detectables con este enfoque.

Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la interacción entre el fragmento de ARN del receptor de antígeno y la proteína HuR fue específica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo recuperar proteínas de unión al ARN de una transcripción de ARN del tejido adiposo marrón. Una vez dominado, esto se puede hacer en 24 horas, si se realiza correctamente.