Name: Caracterización funcional de macrófagos reguladores que inhiben la inmunidad reactiva al injerto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprende a caracterizar macrófagos reguladores infiltrantes en corazones aloinjertados mediante citometría de flujo. Esta técnica permite estudiar su función inmunosupresora y mejorar la supervivencia del injerto.

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Reconocemos las contribuciones técnicas de los Centros de Investigación de Citometría de Flujo, Microcirugía y Bio-repositorio / Patología de la Excelencia en Investigación en el Monte Sinaí. Este trabajo fue apoyado por la Acción COST BM1305: Acción para Enfocar y Acelerar las Terapias Tolerogénicas Celulares (A FACTT), los fondos de desarrollo del Mount Sinai Recanati / Miller Transplantation Institute, Ministerio de Ciencia e Innovación SAF2013-48834-R y SAF2016-80031-R Jo

<html> En este estudio, los ratones se alojan de acuerdo con las directrices del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos y las recomendaciones de la Guía de Servicios de Salud Pública para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Todas las técnicas experimentales que involucran el uso de animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Utilización de Animales (IACUC) de la Escuela de Medicina de Mount Sinai. 1. Preparación de los medios <ol><li> Preparar medio RPMI 1640 completo con FBS al 10% y penicilina-estreptomicina al 1% (10.000 U / ml) usando L-glutamina 2 mM, piruvato sódico 1 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, HEPES 5 mM y 0,05 mM 2 Mercaptoetanol. </li></ol> 2. Aislamiento del aloinjerto y suspensión de una sola célula NOTA: La técnica de trasplante y anastomosis de la arteria pulmonar y la vena cava inferior fue descrita inicialmente por Corry y colaboradores y puede ser visualizada en Liu &amp; KangS = &quot;xref&quot;&gt; 10 , 11 ( Figura 1A ). <ol><li> Anestesiar un ratón trasplantado con 4-5% de isoflurano en una cámara de inducción. Sacrifícalo por dislocación cervical. </li><li> Haga una incisión abdominal de línea media con tijeras estándar y retire el contenido abdominal para localizar la aorta. NOTA: El corazón trasplantado estará en el lado derecho de la aorta abdominal receptora ( Figura 1B ). </li><li> Extraiga el injerto suavemente con pinzas finas de dientes afilados y colóquelo inmediatamente en medio RPMI helado. NOTA: El uso de una tijeras de cirugía para separar el injerto de la aorta puede dañar el injerto y hacer que algunos tejidos sigan adheridos al receptor. </li><li> Después de que todos los injertos han sido recolectados, muévalos en una campana de cultivo estéril para el procesamiento de tejidos. Colocar el injerto en una placa de Petri y cortar el tejido en trozos pequeños (1 mm) usando tijeras microcirúrgicas estériles y romas. </li><li> Con dientes afilados forcEps, transferir las piezas a un tubo de 50 ml con 5 ml de colagenasa A (0,1 mg / ml de colagenasa en 1x PBS estéril). Incubar durante 1 h en un baño a 37 ° C. </li><li> Añadir 5 ml de medio RPMI para neutralizar la colagenasa y transferir la muestra a través de un filtro de 100 μm con la ayuda del émbolo de una jeringa de 1 ml. </li><li> Hacer girar la muestra a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender el gránulo en 1 mL de tampón de lisis ACK. Mezclar bien e incubar durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Añadir 1 ml de medio RPMI para neutralizar el tampón de lisis y centrifugar la muestra a 400 xg durante 5 m a 4 ° C. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 200 μL de medio RPMI y transferirlo a un tubo redondo de polipropileno de 5 ml. NOTA: Los tubos de polipropileno soportan menos adherencia. Además, mantener las células a baja temperatura, tales como 4ºC, reduce la adherencia. </li></ol> 3. Aislamiento de los macrófagos infiltrados por injerto utilizando la clasificación de células activada por fluorescenciaEn g <ol><li> Bloquear la unión específica no deseada sobre las células mieloides mediante el uso de mAb bloqueador del receptor Fc (CD16 / 32 de ratón anti-ratón). Añadir 1-2 μL por muestra, 15 min antes de la tinción superficial. </li><li> La tinción con anticuerpo anti-ratón CD11b Percp / Cy5.5 (concentración final de 0,6 μg / μL en medio RPMI), APC / eFluor780 anti-CD45 de ratón (0,6 μg / μl), APC Ly6C anti-ratón (2 μg / μl) Y Ly6G Pe / Cy7 anti-ratón (2 μg / μl). Cubrir los tubos con papel de aluminio para proteger los anticuerpos fluorescentes de la luz e incubar los tubos en el refrigerador a 4 ° C durante 45 min. NOTA: Para las compensaciones de una sola mancha, prepare un tubo de control negativo (sin manchas) y tubos con células etiquetadas individualmente con cada uno de los fluorocromos. Para ayudar a establecer la puerta, los controles de isotipo se pueden utilizar especialmente para Ly6C (IgG2a) y Ly6G (IgG2b). </li><li> Lavar las células dos veces con medio RPMI y centrifugar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Cuente las células usando azul de tripán y un hemocytometeR y diluir en 1 ml de medio RPMI por 1 x 10 6 células. Antes de ordenar, transfiera las muestras a través de una tapa de tubo de filtro de 5 ml, 70 μm. Añadir DAPI (1 μg / ml) como un marcador de viabilidad celular y proceder a la clasificación. </li><li> Debido a que los macrófagos son células sensibles y frágiles, establezca las condiciones de clasificación a 20 psi y utilice un tamaño de boquilla de 100 μm para aislar los macrófagos usando un modo de pureza de 4 vías. </li><li> Preparar los tubos de recogida con 1 ml de medio RPMI en un tubo de polipropileno de 5 ml. </li><li> Utilizando el software de clasificación, abra el nuevo experimento y seleccione el experimento en blanco con un panel en blanco para definir la configuración. </li><li> Establezca una gráfica de puntos que muestre la dispersión frontal (FSC) versus ( vs ) (SSC) y la puerta en todos los leucocitos, excluyendo escombros y agregados con la menor dispersión hacia adelante y hacia el lado. Desde esta puerta principal, cree un nuevo gráfico de puntos que muestre SSC vs. DAPI y gate en celdas DAPI. <ol><li> En esta población recién cerrada, crear anunciosDe la parcela que muestra CD11b frente a CD45 y puerta sobre los macrófagos y neutrófilos doblemente positivos (CD11b + CD45 + ). </li><li> A partir de aquí, crear una trama de puntos final que muestra Ly6C vs Ly6G y puerta de las poblaciones deseables: Ly6C hi Ly6G - , Ly6C lo Ly6G - , y Ly6C int Ly6G + ( Figura 2 ]. </li></ol></li><li> Después de la clasificación, comprobar la pureza y la viabilidad celular (&gt; 90%) y girar los tubos de recogida a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Contar las células usando azul de tripán y un hemocitómetro y resuspenderlas a la concentración deseada ( por ejemplo, 1 x 10 6 macrófagos / ml) en medio RPMI completo. </li><li> Placa de 50 x 10 3 macrófagos por pocillo en una placa de fondo redondo de 96 pocillos con un volumen final de 100 μl de medio RPMI completo. Dejar las células inalteradas durante al menos 24 h a 37 ° C y 5% de CO 2 . </li></ol> 4. AislamientoN de Células T que Usan Clasificación de Células activadas por Fluorescencia NOTA: C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / Jn es una cepa de ratón knock-in dirigida a X que marca las células que expresan el gen Foxp3 (forkhead box P3) con proteína fluorescente roja monomérica (mRFP). <ol><li> Anestesiar y sacrificar ratones C57BL / 6 y C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / J (H-2b) como se describió previamente en el paso 2.1. Aislar el bazo y los ganglios linfáticos (LN: inguinal, lumbar, axilar, braquial y cervical) y colocarlos rápidamente en medio RPMI helado. </li><li> Con el fin de aislar el LN, colocar el ratón en una posición supina, hacer una incisión de la línea media de la parte inferior a la parte superior, cortando con cuidado el peritoneo y separar suavemente la piel aparte. Una vez que se recogen todas las LN inguinales, lumbares, axilares, braquiales y cervicales ( Figura 1C , coloreadas en rojo), se corta el peritoneo y se aísla el bazo en el lado superior izquierdo del intestino. </li><li> Desagregar el bazo y LN utilizando un filtro de 100 μm colocadoEncima de un tubo de 50 ml. Utilizando el émbolo de una jeringa de 1 ml, presione suavemente el tejido. Enjuague el filtro con el medio RPMI tantas veces como sea necesario hasta que esté limpio. NOTA: El LN y el bazo de cada ratón se pueden agrupar juntos en el mismo tubo. </li><li> Girar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender el sedimento en 2 ml de tampón de lisis ACK. Mezclar bien e incubar durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Añadir 2 ml de medio RPMI para neutralizar el tampón de lisis. Girar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 200 μl de medio RPMI y transferirlo a un tubo redondo de 5 ml de poliestireno. </li><li> Mancha para APC CD4 anti-ratón (0,6 μg / μl) y / o CDC PeCy7 anti-ratón (2 μg / μl). Cubrir los tubos con papel de aluminio para proteger los anticuerpos fluorescentes de la luz, e incubar los tubos en el refrigerador a 4 ° C durante 45 min. NOTA: Para compensaciones de una sola mancha, prepare un tubo de control negativo (sin manchas) yTubos con células marcadas individualmente con cada uno de los fluorocromos. </li><li> Lavar las células dos veces con medio RPMI y centrifugar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Cuente las células usando azul de tripán y un hemocitómetro. NOTA: El colorante CFSE se proporciona en forma de polvo de éster de succinimidil de diacetato de carboxifluoresceína normalmente en 50 μg. Añadir 18 μL de DMSO a un vial de CFSE para una solución madre final de 5 mM y almacenar a -20 ° C durante varios meses. </li><li> Para el etiquetado CFSE, resuspender CD8 células teñidas a una concentración de hasta 10 6 células por ml en PBS a una concentración final de trabajo de 5 μ M CFSE de la solución madre. Incubarlos en un baño a 20 ° C durante 5 min como se ha descrito anteriormente 6 . NOTA: (PASO CRÍTICO) Para las células a una concentración baja (≤ 10 6 por ml), es esencial que las células se etiqueten en presencia de proteína añadida para amortiguar los efectos tóxicos de CFSE. Por lo tanto, el PBS puede contener 5% de FBS. Tenga en cuenta que si meDium, los aminoácidos libres pueden disminuir la eficiencia de etiquetado compitiendo por CFSE. </li><li> Neutralizar la CFSE con 2 ml de medio RPMI. Girar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Añadir 1 ml de medio RPMI por 1 x 106 células T CD8. </li><li> Antes de clasificar, transfiera la muestra a través de un filtro de células de 70 μm en un tapón de tubo de 5 ml. Añadir 50 μl de 1x DAPI (1 μg / ml) como marcador de viabilidad celular y proceder a la clasificación. NOTA: 1x significa relación 1: 1 del reactivo con respecto a los demás constituyentes. </li><li> Ajustar las condiciones de clasificación a 20 psi y 100 μ m tamaño de la boquilla para aislar doble positivo CD8 + CFSE + T células ( Figura 3A ]. </li><li> Prepare los tubos de recogida con 1 ml de medio RPMI en un tubo de polipropileno de 5 ml y proceda a ordenar. </li><li> Utilizando el software de clasificación, abra el nuevo experimento y seleccione el experimento en blanco con un panel en blanco para definir la configuración. </li><li> Para el aislamiento de células T CD4 + , configure un diagrama de puntos queJuega el FSC vs SSC y la puerta de los linfocitos, excluyendo los residuos, así como grandes células granulares, como las células dendríticas. <ol><li> Desde esta puerta principal, cree un nuevo gráfico de puntos que muestre SSC vs. DAPI y gate en celdas DAPI. </li><li> En esta población recién cerrada, crear un gráfico de puntos que muestra SSC vs CD4 para aislar todas las células CD4 + ( Figura 3B ]. Alternativamente, se puede usar un mAb anti-CD3 para asegurar el aislamiento de poblaciones de células T puras. NOTA: Una pequeña fracción de todas las células T CD4 + (5-10%) debe ser Foxp3 + mRFP + . </li></ol></li><li> Después de la clasificación, comprobar la pureza y la viabilidad celular (&gt; 90%) y girar los tubos de recogida a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Cuente las células usando azul de tripán y un hemocitómetro. Resuspender utilizando 1 ml de medio RPMI completo por 2 x 10 6 células T. </li><li> Establecer el ensayo de supresión mediante el cultivo de células T con macrófagos previamente ordenados. Placa 10 x 10 4 CD4 + T y 10 x 10 ^ { 4 } CD8 ^ { +} CFSE + en el mismo pocillo en un volumen final de 100 mu l de medio RPMI completo. Incubar a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 96 h. NOTA: Se usaron macrófagos y células T en una proporción de 1: 4. </li><li> Estimular la división de células T lavando las perlas magnéticas CD3 / CD28 activadoras de células T en 2 ml de PBS antes de usarlas para eliminar el tampón que contiene azida. Añadir 5 μl de perlas de CD3 / CD28 activador de células T de ratón por pocillo. NOTA: Las perlas magnéticas son de tamaño similar a las células presentadoras de antígeno y están acopladas a mAb anti-CD3 y anti-CD28, ofreciendo un método sencillo para la activación y expansión de células T. </li></ol>

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<li>Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primarily+vascularized+allografts+of+hearts+in+mice.+The+role+of+H-2D%2C+H-2K%2C+and+non-H-2+antigens+in+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection.</a> Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).</li>
<li>Liu, F., Kang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+heart+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Heterotopic heart transplantation in mice.</a> J Vis Exp. (6), e238(2007).</li>
<li>Ochando, J., Conde, P., Bronte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-Derived+Suppressor+Cells+in+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Transplant+Rep%22%5BJournal%5D)">Monocyte-Derived Suppressor Cells in Transplantation.</a> Curr Transplant Rep. 2 (2), 176-183 (2015).</li>
<li>Gallina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumors+induce+a+subset+of+inflammatory+monocytes+with+immunosuppressive+activity+on+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells.</a> J Clin Invest. 116 (10), 2777-2790 (2006).</li>
<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gr-1%2BCD115%2B+immature+myeloid+suppressor+cells+mediate+the+development+of+tumor-induced+T+regulatory+cells+and+T-cell+anergy+in+tumor-bearing+host%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Gr-1+CD115+ immature myeloid suppressor cells mediate the development of tumor-induced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host.</a> Cancer Res. 66 (2), 1123-1131 (2006).</li>
<li>Luan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytic+myeloid-derived+suppressor+cells+accumulate+in+renal+transplant+patients+and+mediate+CD4%28%2B%29+Foxp3%28%2B%29+Treg+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Monocytic myeloid-derived suppressor cells accumulate in renal transplant patients and mediate CD4(+) Foxp3(+) Treg expansion.</a> Am J Transplant. 13 (12), 3123-3131 (2013).</li>
<li>Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M. E., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+immune+cell+proliferation+and+cytotoxic+potential+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking immune cell proliferation and cytotoxic potential using flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 699, 119-164 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe los métodos que utilizamos para inmunocaracterizar los subgrupos de células mieloides infiltrantes al injerto en un modelo murino experimental de trasplante cardíaco, que también es aplicable a otros tejidos en diferentes modelos experimentales murinos. Clasificación de células de baja presión a 20 psi fue el método preferido para aislar un buen rendimiento de los subconjuntos de células puras. Mantener la pureza de cada subconjunto mieloide es crítico para establecer resultados concluyentes de l...

Este protocolo describe técnicas in vitro para estudiar la función de los tejidos infiltrados macrófagos aislados de aloinjertos cardíacos, de acuerdo a su capacidad para modular las respuestas de células T. Ampliamente descritos en la literatura, los colorantes de seguimiento de células fluorescentes en combinación con citometría de flujo, son potentes herramientas para estudiar la función supresora de tipos específicos de células in vitro e in vivo. Nuestro protocolo sigue el método del éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) para monitorear la proliferación de linfocitos in vitro . Cuando una célula marcada con CFSE se divide, su progenie adquiere la mitad del número de moléculas marcadas con carboxifluoresceína [ 6] . La disminución correspondiente en la fluorescencia celular por citometría de flujo puede usarse para evaluar la división celular, monitoreando la capacidad de los macrófagos supresores para modular las respuestas inmunes de las células T. Dado que CFSE es un colorante basado en fluoresceína, es compatible con una brGama de otros fluorocromos, haciéndolo aplicable a la citometría de flujo multicolor. La elección apropiada de fluorocromos para el fenotipado es también importante para evitar la superposición espectral excesiva y la incapacidad para reconocer células positivas para anticuerpos, particularmente con colorantes proteínicos visibles tales como CFSE 7 . Existen muchas ventajas de usar tintes fluorescentes sobre técnicas alternativas que miden la proliferación celular, tal como el ensayo de incorporación de timidina, que usa timidina radiomarcada (TdR) 8 . Este ensayo utiliza timidina tritiada (3H-TdR) que se incorpora en nuevas cadenas de ADN cromosómico durante la división celular mitótica. Un problema de seguridad asociado con este ensayo es el uso de radioisótopos, puesto que se utiliza un contador beta de centelleo para medir la radiactividad en el ADN recuperado de las células con el fin de determinar el grado de división celular. Metodológicamente, el culo de timidina tritiadaAy no es lo suficientemente flexible como para adaptarse a importantes limitaciones de laboratorio clínico, como un bajo número de células y un análisis tardío después de la tinción. Por el contrario, coloración CFSE se ha demostrado para prevenir la proliferación celular y para interferir con los marcadores de activación crítica, como CD69, HLA-DR y CD25 [ 9] . Por lo tanto, la comprensión de las ventajas y limitaciones de cada metodología, en particular en estudios multicolores en los que se utilizan tintes múltiples para rastrear diferentes tipos de células, es fundamental para obtener resultados precisos y reproducibles.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Life Technologies</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>10% FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>1,000x 2-mercaptoetanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>100x Pluma/Estreptococo</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>100x L-glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>100x No Aminoácidos esenciales</td><td>Corning</td><td>25025039</td><td></td></tr><tr><td>1 M tampón HEPES&nbsp;</td><td>Corning</td><td>25060CL</td><td></td></tr><tr><td>100 mM Piruvato de sodio</td><td>ThermoScientific</td><td>SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptavidina</td><td>ThermoScientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>colágeno A</td><td>Roche</td><td>70381322</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (sin calcio& magnesio)</td><td>Corning</td><td>21031CV</td><td></td></tr><tr><td>70 y micro; m Filtro de células</td><td>Fisher</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>tampón de lisis ACK</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>32670-5mg-F</td><td></td></tr><tr><td>CFSE-FITC</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Ratón Activador de células T CD3/CD28</td><td>Life Technologies</td><td>11452D</td><td></td></tr><tr><td>96 pozo&nbsp; Placa inferior en U</td><td>Corning</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos anti-Ly6C-APC</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>eBioscience</td><td>175932-80</td><td></td></tr><tr><td>anti-Ly6G-Pe/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>127617</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD11b-Percp/Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45011282</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45-APC/Cy7</td><td>eBioscience</td><td>47045182</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4-APC</td><td>eBioscience</td><td>17004181</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8-P/ Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25008181</td><td></td></tr><tr><td>LSRII Citómetro de flujo</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva Software</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J&nbsp;</td><td>El Laboratorio Jackson</td><td>008374</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6</td><td>El Laboratorio Jackson</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Balb/c</td><td>El Laboratorio Jackson</td><td>000651</td><td></td></tr></tbody></table>

caracterización funcional de macrófagos reguladores que inhiben la inmunidad reactiva al injerto

Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

La acumulación de macrófagos en los órganos trasplantados se ha reconocido desde hace tiempo como una característica del rechazo del aloinjerto 1 . Los monocitos inmunogénicos se infiltran en el aloinjerto precoz después del trasplante, montan una respuesta reactiva al injerto contra el órgano trasplantado e inician el rechazo del órgano 2 . Datos recientes sugieren que los macrófagos supresores facilitar el éxito a largo plazo transplante [ 3] y son necesarios para la inducción de la tolerancia al trasplante [ 4] . Esto sugiere un concepto multidimensional de la ontogenia, activación y función de los macrófagos, lo que exige una nueva hoja de ruta para el aislamiento y el análisis de la función de los macrófagos [ 5] . Debido a la plasticidad de los macrófagos, es necesario proporcionar una metodología para aislar y caracterizar los macrófagos, dependiendo del entorno tisular, y definir sus funciones de acuerdo con diferentes escenarios. Aquí, describimosSer un protocolo para la caracterización inmune de macrófagos infiltrados por injerto y los métodos que utilizamos para evaluar funcionalmente su capacidad para inhibir la proliferación de T CD8 + y para promover la expansión de Treg CD4 + Foxp3 + in vitro .

Los resultados representativos muestran la estrategia de bloqueo descrita en el protocolo anterior. Los resultados también muestran el análisis de la actividad de proliferación de células T después del co-cultivo con macrófagos infiltrados por injerto. La capacidad de supresión in vitro de subconjuntos de macrófagos se analizó en la Figura 4 . Los resultados indican que los Ly6C lo Ly6G - macrófagos obtenidos de receptores tolerados son sup...

Los macrófagos son células plásticas del sistema hematopoyético que tienen un papel crucial en la inmunidad protectora y la homeostasis. En este informe se describen las técnicas in vitro optimizadas para caracterizar fenotípicamente y funcionalmente los macrófagos reguladores infiltrantes del injerto que se acumulan en el órgano trasplantado bajo condiciones tolerógenas.

Caracterización funcional de macrófagos reguladores que inhiben la inmunidad reactiva al injerto

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the ...

El objetivo general de este procedimiento in vitro es caracterizar fenotípica y funcionalmente las poblaciones de macrófagos aisladas de corazones aloinjertados en un modelo de trasplante masivo. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en la inmunidad que encontramos sobre cómo mejorar el éxito en la supervivencia y la tolerancia del alógrafo. La principal ventaja de esta técnica es que permite estudiar cómo un subconjunto de micrófagos aislados de alógrafo cardíaco infiltrado en un tejido específico modula la respuesta de los tejidos del huésped.Después de generar una suspensión unicelular a partir del aloinjerto, bloquee cualquier unión inespecífica a las células mieloides con uno o dos microlitros de anticuerpo monoclonal que bloquea el receptor FC durante 15 minutos. Al final de la incubación, tiñir las células con los anticuerpos de superficie de células mieloides conjugados con fluorescencia adecuados durante 45 minutos a cuatro grados centígrados protegidos de la luz. A continuación, lavar las células dos veces en medio RPMI por centrifugación.Y vuelva a suspender la bolita en azul tripán para contar. A continuación, diluya las células a una concentración única de 10 a la sexta célula por mililitro en medio fresco. Y filtre las células a través de un colador de 70 micras en un tubo de fondo redondo de cinco mililitros.Justo antes de clasificar, tiña las células con DAPI como marcador de viabilidad y ajusta el citómetro de flujo a los parámetros de clasificación de macrófagos adecuados. Coloque tubos cónicos de cinco mililitros que contengan un mililitro de medio RPMI para recoger las células clasificadas y cargue el tubo de muestra en el citómetro. En el software del citómetro de flujo, seleccione un experimento en blanco con un panel en blanco y configure un diagrama de puntos de dispersión frontal frente a lateral.Puerta en los leucocitos, excluyendo los restos celulares y los grupos con la menor dispersión hacia adelante y hacia los lados. A partir de esta puerta principal, cree un nuevo diagrama de puntos que muestre la dispersión lateral frente a DAPI y la puerta en las celdas negativas de DAPI. En esta población recién controlada, cree un diagrama de puntos que muestre CD11b frente a CD45, y controle los macrófagos y neutrófilos CD11b CD45 doblemente positivos.A continuación, cree un diagrama de puntos final que muestre Ly6C frente a Ly6G para permitir la compuerta de la población deseable y ordenar las celdas. Al final de la clasificación, confirme la pureza y viabilidad de las muestras. Recoja las celdas clasificadas por centrifugación y vuelva a suspender el pellet para contar en medio RPMI fresco.Diluir las poblaciones de macrófagos a la concentración apropiada para sembrar cinco veces 10 a la cuarta macrófaga por cada 100 microlitros de medio completo por pocillo, en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. A continuación, coloque las células en una incubadora de cultivo celular durante al menos 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de CO2. Para aislar la T, coloque el ratón knock-in en posición supina.Primero haga una incisión en la línea media de la piel, cortando cuidadosamente el peritoneo y separando suavemente la piel. Recoja los ganglios linfáticos periféricos y el bazo, y coloque los tejidos en un filtro de 100 micrómetros encima de un tubo cónico de 50 mililitros. Con el émbolo de una jeringa de 1 mililitro, presione suavemente los tejidos linfoides a través del filtro y enjuague el filtro con medio RPMI fresco hasta que la malla esté limpia.Recoja la suspensión unicelular por centrifugación y vuelva a suministrar el pellet en dos mililitros de tampón de lisis ACK. Después de cinco minutos a cuatro grados centígrados, neutralice el tampón de lisis con dos mililitros de medio RPMI fresco y centrifuga las células. Vuelva a suspender el gránulo en 200 microlitros de medio fresco y transfiera las células a un tubo de fondo redondo de cinco mililitros para colar con los anticuerpos apropiados para la tinción de la superficie de las células T.Después de 45 minutos a cuatro grados centígrados protegidos de la luz, lavar las células dos veces en medio RPMI fresco y contar las células por exclusión de azul de tripán. A continuación, diluya las células teñidas con CD8 a una concentración de una por 10 a la sexta célula por mililitro en CFSE durante cinco minutos en un baño de agua a 20 grados centígrados. Al final de la incubación, neutralice el CFSE con dos mililitros de medio RPMI y recoja las células por centrifugación.Vuelva a suspender las células a una vez de 10 a la sexta célula T teñida con CD8 por mililitro de concentración de medio RPMI, y filtre todas las muestras de células a través de un filtro de células de 70 micrómetros en tubos de fondo redondo de cinco mililitros. A continuación, etiquete las células con DAPI y prepare el citómetro de flujo para la clasificación como se acaba de demostrar. Para el aislamiento de linfocitos T CD4 positivos, configure un diagrama de puntos de dispersión frontal frente a lateral para la activación de los linfocitos, excluyendo los desechos y las células mieloides granulares grandes.A partir de esta puerta principal, cree un diagrama de puntos que muestre la dispersión lateral frente a DAPI y cierre en las celdas negativas de DAPI. En esta población recién cerrada, cree un diagrama de puntos que muestre la dispersión lateral frente a CD4 y un diagrama de puntos que muestre CD8 frente a CFSE. A continuación, clasifique las poblaciones de células T controladas.Al final de la clasificación, confirme la pureza y viabilidad de las muestras, y recoja las células por centrifugación para su recuento. Diluir las células a dos veces 10 a la sexta célula T por mililitro de concentración de RPMI, y 100 microlitros de células T en medio RPMI completo a cada pocillo de macrófagos para un cocultivo de 96 horas a 37 grados Celsius y 5% de CO2. Finalmente, agregue cinco microlitros de perlas magnéticas CD3 CD28 activador de células T de lavado PBS a cada pocillo para activar y expandir las células T.Los macráfagos de Ly6Clo Ly6G obtenidos de receptores tolerados ejercen un efecto supresor sobre las células T CD8 positivas, con una modesta actividad supresora también observada en las células Ly6C positivas para Ly6CG intermedias. Sin embargo, solo las células Ly6Clo Ly6G promueven la expansión in vitro de CD4 positivo y Foxp3 positivo TReg. En conjunto, estos datos respaldan la conclusión de que los macrófagos negativos para CD11B Ly6Clo positivos para CD11B poseen muchas de las propiedades asociadas con las células supresoras derivadas de monocitos, incluida su capacidad para inhibir la proliferación de células T CD8 y promover la expansión de TReg positivos para Foxp3 CD4.Al intentar este procedimiento, es importante mantener la pureza para establecer datos concluyentes sobre la capacidad supresora de cada subconjunto de macrófagos. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como el uso de puertas de enriquecimiento comerciales, para aislar diferentes poblaciones de leucocitos de interés. La clasificación de macrófagos es la parte más larga de este procedimiento, pero cuando se ha dominado, esta parte de la técnica puede completarse en ocho horas si se realiza correctamente.Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología exploraran la capacidad supresora de los macrófagos infiltrantes en el modelo de simulación de trasplante de órganos sólidos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo caracterizar diferentes poblaciones de macrófagos en un alógrafo de corazón de ratón seleccionado.

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Los macrófagos juegan un papel central en la homeostasis y la patología en muchos tejidos. El protocolo presentado aquí se describen métodos para agotar los...

El agotamiento y la reconstitución de los macrófagos en ratones

Describimos aquí un protocolo sencillo para aislar macrófagos peritoneales murinos. A este procedimiento le sigue la extracción de ARN para llevar a cabo el análisis de la expresión génica tras la estimulación de los receptores tipo Toll.

Aislamiento de macrófagos peritoneales murinos para llevar a cabo análisis de expresión génica Al Toll-like Receptores Estimulación

Describimos un protocolo para el injerto de interposición aórtica en ratones. El objetivo del protocolo es proporcionar un modelo con el que estudiar los procesos patológicos y las estrategias terapéuticas relevantes para las reacciones aloinmunes en las arterias y los cambios arteriales resultantes que contribuyen al fracaso del trasplante de órganos.

Modelo de ratón de rechazo vascular inducida por aloinmune y Arteriosclerosis Trasplante

Aquí, describimos un protocolo para analizar el fenotipo de células T reguladoras (Treg) aisladas de ratones infectados por el virus de la coriomeningitis linfocítica crónica e ingenua. Además, proporcionamos un proceso para evaluar la actividad supresora de las células Treg.

El análisis fenotípico y funcional de las células reguladoras T activadas Aislado de la coriomeningitis linfocítica crónica por el virus ratones infectados

Aquí, presentamos un protocolo para inducir tolerancia en el trasplante y evaluar in vitro e in vivo la capacidad supresora de subconjuntos distintos de la célula del receptor y el estado inmune del receptor hacia el donante o los antígenos exógenos.

In Vitro e In Vivo la evaluación de la actividad supresora T, B y las células mieloides y las respuestas humorales de los receptores de trasplante

Medicamentos a base de anticuerpos han revolucionado el tratamiento de enfermedades inflamatorias. Además de tener efectos directos sobre objetivos específicos, anticuerpos pueden activar macrófagos a ser antiinflamatorias. Este protocolo describe cómo antiinflamatorio macrófago activación puede ser evaluado in vitro, utilizando los macrófagos de la médula ósea de ratón y en vivo, con los macrófagos peritoneales.

Evaluación de los efectos de drogas basados en anticuerpos en médula ósea murina y activación de los macrófagos peritoneales

Derivados de monocitos DC (MoDC) puede detectar pequeñas cantidades de moléculas asociadas de peligro y por lo tanto son fácilmente preparada. Proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento de MoDC de sangre y los tumores y su activación con complejos inmunes mientras destacando medidas claves que deben considerarse para evitar su activación prematura.

Protocolo de aislamiento de células dendríticas derivadas de monocitos de ratón y su activación posterior In Vitro con complejos inmunes Tumor

El protocolo muestra el uso de la examinación histopatológica e inmunohistoquímica al perfil el macrófago de beta del receptor de folato y su relación con el total de la célula inmune infiltran en las biopsias de arteria temporal en la arteritis de células gigantes.

Un estudio de Immunohistopathologic a perfil el folato del Receptor Beta macrófago y microambiente inmunológico Vascular en Arteritis de células gigantes

Aquí se presenta un protocolo para cuantificar y producir imágenes dinámicas de la regulación mediada por células madre mesenquimales (MSC) de la fagocitosis de macrófagos (MΦ) de partículas de levadura no opsonizada (zymosan) que se conjugan con una molécula fluorescente sensible al pH.

Regulación de células madre mesenquimales de la fagocitosis de macrófagos; Cuantificación e imágenes

Los monocitos y macrófagos son células inmunitarias muy plásticas y reprogramables cruciales para la salud y la enfermedad. Perciben y responden a una amplia gama de estímulos mediante la adopción de programas de diferenciación y fenotipos específicos. Hemos estandarizado un modelo in vitro para estudiar la polarización y reprogramación de los macrófagos, proporcionando una herramienta valiosa para la investigación.

Modelo de reprogramación de macrófagos derivados de monocitos humanos para ensayos in vitro

Aprende a caracterizar macrófagos reguladores infiltrantes en corazones aloinjertados mediante citometría de flujo. Esta técnica permite estudiar su función inmunosupresora y mejorar la supervivencia del injerto.

Caracterización funcional de macrófagos reguladores que inhiben la inmunidad reactiva al injerto

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