Aislamiento de Perivasculares Multipotentes poblaciones de células precursoras de Cardíaca Tejido humano

El objetivo general de este procedimiento es aislar dos poblaciones discretas de células precursoras perivasculares multipotentes del tejido cardíaco humano. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regeneración cardíaca, como la contribución que hacen a este proceso subconjuntos de la población de células perivasculares. Las principales ventajas de esta técnica son que da lugar a poblaciones de células progenitoras de menor heterogeneidad y a una mejor viabilidad de una selección de las principales técnicas de exadhesión.

Esta técnica puede tener implicaciones en el tratamiento de la cardiopatía isquémica porque se ha demostrado que los subtipos de células madre perivasculares tienen potencial cardiomiogénico. Aunque este método puede proporcionar información sobre el papel de las células perivasculares en la regeneración cardíaca, también se puede aplicar a la investigación de otros aspectos de la enfermedad cardíaca, como la fibrosis miocárdica. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido al uso de células viables como resultado de la frescura de los tejidos.

Para comenzar este procedimiento, después de extraer el pericardio, los vasos principales y las aurículas, coloque la muestra en un medio de lavado en una placa de Petri. A continuación, corte el miocardio ventricular en trozos pequeños de aproximadamente un milímetro cúbico y procéselos inmediatamente para obtener el mayor rendimiento celular. Luego, prepare una solución de digestión fresca y caliéntela a 37 grados centígrados en un baño de agua.

Después de eso, filtre los trozos de tejido suspendido a través de un colador de 100 micras y lávelos dos veces con PBS. Transfiera los trozos de papel a un recipiente estéril de 30 mililitros con una tapa herméticamente sellada. Agregue la solución de digestión y coloque el recipiente dentro de una bolsa de plástico sellada en un baño de agua agitado a 37 grados centígrados ajustado a 120 RPM.

Después de 15 minutos, invierta el recipiente tres veces. Luego, vuelva a colocarlo en el baño de agua durante 15 minutos más. A continuación, retire y apague las colagenasas con cinco mililitros de DMEM suplementado con un 20% de FBS.

Posteriormente, triture el tejido digerido pipeteando suavemente de 10 a 20 veces con una pipeta serológica de 10 mililitros para descomponer los grumos de tejido. A continuación, filtre la suspensión secuencialmente a través de filtros de celdas de 100 micras, 70 micras y, finalmente, 40 micras para obtener una suspensión de una sola célula. A continuación, centrifugar la suspensión celular a 200 x g durante cuatro minutos.

Decantar cuidadosamente el sobrenadante y volver a suspender el pellet en un mililitro de tampón de lisado de glóbulos rojos durante dos minutos a temperatura ambiente antes de diluirlo con cuatro mililitros de medio de lavado. Repita el paso de centrifugación y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de medio de lavado. Diluya 10 microlitros de suspensión celular con 90 microlitros de medio de lavado para hacer una dilución de uno a 10 de suspensión celular.

Mezcle 10 microlitros de la suspensión celular diluida con 10 microlitros de tinción de azul de tripán y coloque 10 microlitros de la mezcla en un hemocitómetro estándar para el recuento de células. En este procedimiento, se añaden 50 microlitros de suero de ratón a la suspensión celular y se incuba a cuatro grados centígrados durante 20 minutos para bloquear la unión de anticuerpos inespecíficos. A continuación, centrifugar la suspensión celular a 200 x g durante cuatro minutos.

Retire el sobrenadante y vuelva a suspenderlo en el medio de lavado. A continuación, alícuota 50 microlitros de la suspensión celular en cada uno de los dos tubos de citometría de flujo de fondo redondo de poliestireno para los controles de isotipo y sin teñir y colocar el volumen restante en un tercer tubo para la tinción multicolor. Agregue cinco anticuerpos a la suspensión de una sola célula para la tinción multicolor.

Pipetear suavemente para mezclar los anticuerpos con las células e incubar todos los tubos a cuatro grados centígrados durante 20 minutos en la oscuridad. Prepare las perlas de control de compensación añadiendo una gota de perlas positivas a 100 microlitros de medio de lavado en cinco tubos de citometría de flujo. Agregue los anticuerpos individualmente a cada uno de los cinco tubos.

Luego, incuba todos los tubos a cuatro grados centígrados durante 20 minutos en la oscuridad. Mientras tanto, prepare tubos de recolección de células, cada uno con 500 microlitros de medio de cultivo EGM-2, y colóquelos a cuatro grados centígrados. Después de la incubación de anticuerpos, agregue cinco mililitros de medio de lavado para lavar las células y las perlas con el fin de eliminar los anticuerpos no unidos.

Centrifugar todos los tubos a 200 x g durante cuatro minutos. Repita los pasos de lavado y centrifugación y decante cuidadosamente el sobrenadante. A continuación, vuelva a suspender las células en el medio de lavado a una concentración de una vez 10 a la sexta célula por cada 250 microlitros.

Después, vuelva a suspender las perlas en 100 microlitros de medio de lavado. Transfiera las suspensiones de celdas y cuentas al clasificador de celdas en hielo en la oscuridad. Agregue una gota de perlas negativas a los tubos de control de compensación de perlas positivas y utilícelas para establecer la compensación de fluorescencia.

A continuación, ejecute las células de control sin teñir para establecer la fluorescencia de fondo y establecer los voltajes. A continuación, ejecute los isotipos de control para establecer los umbrales de fluorescencia de fondo relacionados con la unión inespecífica. Pase la muestra teñida con varios colores y recoja las poblaciones de pericitos y células adventicias en los tubos de recolección.

En este procedimiento, agregue 100 microlitros de solución estéril de gelatina al 0,2% por centímetro cuadrado de área de crecimiento y agite manualmente para cubrir la totalidad de los pocillos. Después de eso, incube las placas a cuatro grados Celsisu durante 10 minutos. Luego, retira la solución de gelatina por completo.

Mantenga las células recolectadas en hielo mientras prepara las placas de cultivo. A continuación, centrifugar las células recién recolectadas a 200 x g durante cuatro minutos y resuspender suavemente el pellet de células en una cantidad adecuada de EGM-2. Luego, siembra las células en las placas recubiertas de gelatina.

En esta figura, las células vivas se comprimieron para excluir primero las células CD45 positivas, seguidas de las células CD56 positivas. A continuación, se extrajeron células endoteliales CD144 positivas de la fracción CD56 negativa. De esta población final, se seleccionaron y posteriormente se recolectaron pericitos CD146 positivos, CD34 negativos y células adventiciales CD146 negativas y CD34 positivas.

Ambos cultivos de pericitos miocárdicos purificados con FACS y células adventicias exhiben una morfología de células fusiformes a estrelladas. Una vez dominada, esta técnica tomará aproximadamente cinco horas, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las muestras más frescas proporcionarán el mejor rendimiento de células viables.

Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la miocardioplastia celular, para responder a preguntas adicionales, como la idoneidad de estas células en el tratamiento de la cardiopatía isquémica.