Aislamiento de Perivasculares Multipotentes poblaciones de células precursoras de Cardíaca Tejido humano

El objetivo general de este procedimiento es aislar dos poblaciones discretas de células precursoras perivasculares multipotentes a partir de tejido cardíaco humano. Este método podría ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regeneración cardíaca, como la contribución que hacen a este proceso subpoblaciones de la población de células perivasculares. Las principales ventajas de esta técnica son que produce poblaciones de células progenitoras con menor heterogeneidad y mayor viabilidad, en comparación con una selección de las principales técnicas de adhesión previas.

Esta técnica podría tener implicaciones en la terapia de la enfermedad cardíaca isquémica porque se ha demostrado que ciertos subtipos de células madre perivasculares poseen potencial cardiomiogénico. Aunque este método puede proporcionar información sobre el papel de las células perivasculares en la regeneración cardíaca, también puede aplicarse a la investigación de otros aspectos de la enfermedad cardíaca, como la fibrosis miocárdica. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido al uso de células viables como resultado de la frescura del tejido.

Para comenzar este procedimiento, después de retirar el pericardio, los vasos principales y las aurículas, coloque la muestra en medio de lavado en una placa de Petri. A continuación, corte el miocardio ventricular en pequeños fragmentos de aproximadamente un milímetro cúbico y procéselos inmediatamente para obtener el mayor rendimiento celular posible. Luego, prepare una solución de digestión fresca y caliéntela a 37 grados Celsius en un baño de agua.

A continuación, filtre los fragmentos de tejido suspendidos a través de un tamiz de 100 micrones y lávelos dos veces con PBS. Transfiera los fragmentos de tejido a un recipiente estéril de 30 mililitros con tapa hermética. Añada la solución de digestión y coloque el recipiente dentro de una bolsa de plástico sellada en un baño de agua agitado a 37 grados Celsius ajustado a 120 RPM.

Después de 15 minutos, invierta el recipiente tres veces. Luego, colóquelo nuevamente en el baño de agua durante 15 minutos adicionales. Posteriormente, retirelo y enfríe los colagenasas con cinco mililitros de DMEM suplementado con 20 %FBS.

Posteriormente, triture el tejido digerido pipeteando suavemente de 10 a 20 veces con una pipeta serológica de 10 mililitros para deshacer cualquier grumo de tejido. A continuación, filtre la suspensión secuencialmente a través de filtros celulares de 100 micrones, 70 micrones y, finalmente, de 40 micrones para obtener una suspensión de células individuales. Después de esto, centrifugue la suspensión celular a 200 x g durante cuatro minutos.

Vierta cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda el precipitado en un mililitro de tampón lisante de glóbulos rojos durante dos minutos a temperatura ambiente, antes de diluirlo con cuatro mililitros de medio de lavado. Repita el paso de centrifugación y resuspenda el precipitado en un mililitro de medio de lavado. Diluya 10 microlitros de suspensión celular con 90 microlitros de medio de lavado para obtener una dilución 1:10 de la suspensión celular.

Mezcle 10 microlitros de la suspensión celular diluida con 10 microlitros de tinción azul de tripano y coloque 10 microlitros de la mezcla sobre un hemocitómetro estándar para el recuento celular. En este procedimiento, agregue 50 microlitros de suero de ratón a la suspensión celular e incube a cuatro grados Celsius durante 20 minutos para bloquear la unión inespecífica de anticuerpos. A continuación, centrifugue la suspensión celular a 200 ×g durante cuatro minutos.

Elimine el sobrenadante y resuspenda en medio de lavado. A continuación, alícuota 50 microlitros de la suspensión celular en cada uno de los dos tubos de citometría de flujo de fondo redondo de poliestireno para los controles de isotipo y sin teñir, y coloque el volumen restante en un tercer tubo para tinción multicolor. Añada cinco anticuerpos a la suspensión individual de células para la tinción multicolor.

Pipetee suavemente para mezclar los anticuerpos con las células e incube todos los tubos a cuatro grados Celsius durante 20 minutos en la oscuridad. Prepare las perlas de control de compensación añadiendo una gota de perlas positivas a 100 microlitros de medio de lavado en cinco tubos de citometría de flujo. Añada los anticuerpos individualmente a cada uno de los cinco tubos.

A continuación, incubar todos los tubos a cuatro grados Celsius durante 20 minutos en la oscuridad. Mientras tanto, preparar tubos para recolección de células, cada uno con 500 microlitros de medio de cultivo EGM-2, y colocarlos a cuatro grados Celsius. Tras la incubación con el anticuerpo, añadir cinco mililitros de medio de lavado para lavar las células y las perlas con el fin de eliminar cualquier anticuerpo no unido.

Centrifugar todos los tubos a 200 x g durante cuatro minutos. Repetir los pasos de lavado y centrifugación y desechar cuidadosamente el sobrenadante. Luego, resuspender las células en medio de lavado a una concentración de uno por 10 a la 6ª células por 250 microlitros.

Posteriormente, re suspenda las perlas en 100 microlitros de medio de lavado. Transfiera las suspensiones de células y perlas al ordenador de células sobre hielo y en la oscuridad. Añada una gota de perlas negativas a los tubos de control de compensación de perlas positivas y utilice estos para ajustar la compensación de fluorescencia.

Luego, analice las células de control sin teñir para establecer la fluorescencia de fondo y ajustar los voltajes. Posteriormente, analice los isotipos de control para establecer los umbrales de fluorescencia de fondo relacionados con la unión inespecífica. Analice la muestra teñida con múltiples colores y recoja las poblaciones de células perivasculares y adventicias en los tubos de recolección.

En este procedimiento, agregue 100 microlitros de solución estéril de gelatina al 0,2 % por centímetro cuadrado de área de crecimiento y agite manualmente para recubrir completamente los pocillos. A continuación, incube las placas a cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Luego, elimine por completo la solución de gelatina.

Mantenga las células recolectadas en hielo mientras prepara las placas de cultivo. A continuación, centrifugue las células recién recolectadas a 200 x g durante cuatro minutos y resuspenda suavemente el botón celular en una cantidad adecuada de EGM-2. Posteriormente, siembre las células en las placas recubiertas con gelatina.

En esta figura, las células vivas se seleccionaron primero para excluir las células positivas para CD45, seguidas por las células positivas para CD56. Luego, las células endoteliales positivas para CD144 se eliminaron de la fracción negativa para CD56. De esta población final, se seleccionaron y posteriormente recolectaron pericitos positivos para CD146 y negativos para CD34, así como células adventiciales negativas para CD146 y positivas para CD34.

Ambos cultivos de pericitos miocárdicos y células adventicias purificados mediante FACS exhiben una morfología celular fusiforme a estrellada. Una vez dominada, esta técnica tomará aproximadamente cinco horas, si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las muestras más frescas proporcionarán el mejor rendimiento de células viables.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la cardiomioplastia celular, para responder preguntas adicionales, como la idoneidad de estas células en el tratamiento de la enfermedad cardíaca isquémica.