Método rápido y simplificado para el aislamiento alto rendimiento de procesamiento de miRNA desde muy puras lipoproteína de alta densidad

El objetivo general de este método es desarrollar un enfoque simplificado para aislar rápidamente lipoproteínas de alta densidad purificadas del plasma sanguíneo humano para el análisis de micro ARN. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en hepatología y cardiología, como la comprensión de los mecanismos moleculares y las funciones protectoras de las lipoproteínas de alta densidad. Algunas de las principales ventajas de esta técnica es que el micro ARN HDL purificado viene preaislado a partir de un menor volumen de muestras en un corto período de tiempo.

En este protocolo, el plasma se obtiene a partir de muestras de sangre venosa periférica en ayunas mediante múltiples pasos de centrifugación, como se describe en el texto del protocolo. Transfiera el plasma a un tubo nuevo. Y mida la densidad del plasma usando un densitómetro a temperatura ambiente, según las instrucciones del fabricante.

Para eliminar los exosomas circulantes que representan una fuente de contaminación por micro ARN, agregue 252 microlitros de solución de precipitación de exosomas a un mililitro de plasma. E incubar durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, centrifuga la mezcla durante 30 minutos para extraer los exosomas.

Transfiera un mililitro del sobrenadante resultante a un tubo de ultracentrífuga de paredes gruesas de policarbonato para su posterior procesamiento, como se muestra en el siguiente segmento de video. El aislamiento de lipoproteínas de alta densidad, o HDL, se logra mediante un protocolo de ultracentrifugación en gradiente de densidad de tres pasos, que implica un aislamiento secuencial de lipoproteínas de muy baja densidad, o VLDL, lipoproteínas de baja densidad, o LDL, y HDL. Las tres soluciones de densidad diferente, A, B y C, deben prepararse frescas, siguiendo el procedimiento descrito en el texto del protocolo.

En un tubo ultracentrífugo de pared gruesa de policarbonato de 6,5 mililitros, mezcle un mililitro de plasma y 200 microlitros de Fat Red 7B sin nucleasas. Luego, coloque con cuidado cinco mililitros de solución A encima de la mezcla. Si es necesario, agregue Fat Red 7B adicional encima de la solución A para equilibrar el peso de cada tubo.

Cargue los tubos en un rotor preenfriado. Coloque el rotor en una centrífuga de piso y centrifugue durante dos horas. Al final de la ejecución, dos capas deben ser visibles.

Retire 1,5 mililitros de la capa superior, que representa la fracción VLDL. Y guárdalo a cuatro grados centígrados. Utilice una pipeta para transferir cuatro mililitros desde el fondo del tubo a un nuevo tubo de 50 mililitros.

Contiene la fracción LDL y HDL. El siguiente paso es el aislamiento de las LDL. Mezcle dos mililitros de solución B y 100 microlitros de Fat Red 7B sin nucleasa en el tubo que contiene la fracción LDL y HDL.

Ponga hielo durante cinco a diez minutos. Transfiera 6,5 mililitros de la muestra mezclada a un tubo ultracentrífugo de pared gruesa de policarbonato. Cargue el tubo en un rotor preenfriado y centrifugue durante tres horas.

Cuando se complete la centrifugación, retire 1,5 mililitros de la capa superior, que representa la fracción LDL y manténgala a cuatro grados centígrados. Transfiera cuatro mililitros desde el fondo del tubo, que contiene la fracción de HDL, a un tubo estéril de 50 mililitros. El tercer paso es el aislamiento de HDL.

Mezcle dos mililitros de solución C, 100 microlitros de Fat Red 7B sin nucleasa y 15 microlitros de mercaptoetanol beta al 98% en el tubo, que contiene la fracción HDL. Comprueba la densidad de la mezcla. Cargue el tubo en un rotor preenfriado y centrifugue durante tres horas.

Después de eso, retire dos mililitros de la capa superior, que representa la fracción HDL, y manténgala a cuatro grados centígrados. El exceso de sal debe eliminarse de las fracciones lipoproteicas para evitar interferencias con la electroforesis posterior en gel de agarosa y la PCR. En este video, se demostrará la desalinización y la concentración solo para la fracción HDL.

Agregue 13 mililitros de PBS frío a la fracción de HDL y transfiéralo a un dispositivo de filtro centrífugo con el corte de peso molecular de 10K. Centrifugar en un rotor de cubo oscilante, a 4000 veces g y cuatro grados Celsius, durante 30 minutos. Desalar la fracción de HDL, por segunda vez, utilizando 13 mililitros de PBS frío, y centrifugar como antes.

Después de la centrifugación, retire la lipoproteína que contiene solutos y manténgala a cuatro grados centígrados. Para evaluar la calidad y pureza de las lipoproteínas aisladas, se realizó electroforesis en gel de agarosa con patrones de lipoproteínas humanas, incluidos como referencia de tamaño. Los resultados representativos de un aislamiento, sin beta mercaptoetanol, mostraron que la fracción HDL está desprovista de cualquier contaminación de VLDL y exhibe una movilidad alfa típica.

Sin embargo, la fracción HDL también muestra rastros de movilidad beta debido a la contaminación con lipoproteínas. La adición de beta mercaptoetanol a la solución C, durante el último paso de centrifugación, elimina eficazmente todas las lipoproteínas contaminantes de la fracción HDL. Para demostrar la viabilidad de cuantificar los micro ARN, transportados en el HDL humano, purificados con este método, se amplificaron dos micro ARN diferentes mediante PCR cuantitativa en tiempo real.

En estos gráficos de amplificación, las líneas horizontales representan el umbral de detección. Los datos representativos de PCR en tiempo real de HDL aislado, obtenidos de seis muestras, mostraron la detección consistente de ambos micro ARN. Por último, los análisis de la curva de fusión muestran claramente un único pico distinto para ambos micro ARN, lo que es coherente con la amplificación específica en la PCR anterior.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en nueve horas, junto con los procedimientos de desalinización, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante trabajar de cuatro a ocho grados centígrados, en todo momento. Y para ajustar la densidad de cada fracción de lipoproteína antes de la ultracentrifugación.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la microscopía electrónica, para responder preguntas adicionales, como la pureza del HDL. Tras su desarrollo, esta técnica permitirá a los investigadores, en el campo del síndrome metabólico, explorar los micro ARN asociados a HDL como biomarcadores, en humanos con sospecha de enfermedad del hígado graso. También se puede utilizar para comprender mejor la función del HDL y los mecanismos moleculares por los que altera la biología celular.