Método rápido y simplificado para el aislamiento alto rendimiento de procesamiento de miRNA desde muy puras lipoproteína de alta densidad

El objetivo general de este método es desarrollar un enfoque simplificado para aislar rápidamente lipoproteínas de alta densidad purificadas del plasma sanguíneo humano para el análisis de microARN. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en hepatología y cardiología, como comprender los mecanismos moleculares y las funciones protectoras de las lipoproteínas de alta densidad. Algunas ventajas principales de esta técnica son que los microARN de HDL purificados se obtienen previamente aislados a partir de volúmenes menores de muestras en un corto período de tiempo.

En este protocolo, el plasma se obtiene a partir de muestras de sangre venosa periférica en ayunas mediante varios pasos de centrifugación, como se describe en el texto del protocolo. Transfiera el plasma a un nuevo tubo y mida la densidad del plasma utilizando un densitómetro a temperatura ambiente, según las instrucciones del fabricante.

Para eliminar los exosomas circulantes que representan una fuente de contaminación de microARN, agregue 252 microlitros de solución de precipitación de exosomas a un mililitro de plasma. Incube durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Luego, centrifugue la mezcla durante 30 minutos para sedimentar los exosomas.

Transfiera un mililitro del sobrenadante resultante a un tubo de ultracentrífuga de paredes gruesas de policarbonato para un procesamiento posterior, como se demuestra en el siguiente segmento de video. El aislamiento de lipoproteínas de alta densidad, o HDL, se lleva a cabo mediante un protocolo de ultracentrifugación en gradiente de densidad en tres pasos, que implica el aislamiento secuencial de lipoproteínas de muy baja densidad, o VLDL, lipoproteínas de baja densidad, o LDL, y HDL. Las tres soluciones de diferente densidad, A, B y C, deben prepararse frescas, siguiendo el procedimiento descrito en el texto del protocolo.

En un tubo de ultracentrífuga de policarbonato de 6,5 mililitros con paredes gruesas, mezcle un mililitro de plasma y 200 microlitros de Fat Red 7B libre de nucleasas. Luego, agregue cuidadosamente cinco mililitros de la solución A sobre la mezcla. Si es necesario, añada Fat Red 7B adicional sobre la solución A para equilibrar el peso de cada tubo.

Coloque los tubos en un rotor previamente enfriado. Coloque el rotor en una centrífuga de piso y centrifugue durante dos horas. Al finalizar la corrida, deben ser visibles dos capas.

Retire 1.5 mililitros de la capa superior, que representa la fracción de VLDL. Y guárdela a cuatro grados Celsius. Utilice una pipeta para transferir cuatro mililitros desde el fondo del tubo a un nuevo tubo de 50 mililitros.

Esto contiene la fracción LDL y HDL. El siguiente paso es el aislamiento de LDL. Mezcle dos mililitros de solución B y 100 microlitros de Fat Red 7B libre de nucleasa en el tubo que contiene la fracción LDL y HDL.

Coloque en hielo durante cinco a diez minutos. Transfiera 6,5 mililitros de la muestra mezclada a un tubo de ultracentrífuga de paredes gruesas de policarbonato. Coloque el tubo en un rotor previamente enfriado y centrifugue durante tres horas.

Una vez finalizada la centrifugación, retire 1,5 mililitros de la capa superior, que representa la fracción de LDL, y manténgalos a cuatro grados Celsius. Transfiera cuatro mililitros desde el fondo del tubo, que contienen la fracción de HDL, a un tubo estéril de 50 mililitros. El tercer paso es el aislamiento de HDL.

Mezcle dos mililitros de la solución C, 100 microlitros de Fat Red 7B libre de nucleasas y 15 microlitros de beta-mercaptoetanol al 98 % en el tubo que contiene la fracción de HDL. Verifique la densidad de la mezcla. Coloque el tubo en un rotor previamente enfriado y centrifugue durante tres horas.

A continuación, retire dos mililitros de la capa superior, que representa la fracción de HDL, y manténgalos a cuatro grados Celsius. Es necesario eliminar el exceso de sal de las fracciones de lipoproteínas para evitar interferencias con la electroforesis en gel de agarosa y la PCR posteriores. En este video, se demostrará la eliminación de sales y la concentración únicamente para la fracción de HDL.

Agregue 13 mililitros de PBS frío a la fracción de HDL y transfiérala a un dispositivo de filtro centrífugo con un límite de peso molecular de 10K. Centrifugue en un rotor de cesta oscilante, a 4000 veces g y cuatro grados Celsius, durante 30 minutos. Desaline la fracción de HDL por segunda vez, utilizando 13 mililitros de PBS frío y centrifugando como antes.

Después de la centrifugación, retire los solutos que contienen lipoproteínas y manténgalos a cuatro grados Celsius. Para evaluar la calidad y pureza de las lipoproteínas aisladas, se realizó electroforesis en gel de agarosa con estándares de lipoproteínas humanas, incluidos como referencia de tamaño. Los resultados representativos de un aislamiento, sin beta-mercaptoetanol, mostraron que la fracción de HDL carece de cualquier contaminación de VLDL y presenta movilidad alfa típica.

Sin embargo, la fracción de HDL también muestra trazas de movilidad beta debido a la contaminación con lipoproteínas. La adición de beta-mercaptoetanol a la solución C, durante el último paso de centrifugación, elimina eficazmente todas las lipoproteínas contaminantes de la fracción de HDL. Para demostrar la viabilidad de cuantificar microARNs transportados en HDL humano y purificados con este método, se amplificaron dos microARNs diferentes mediante PCR cuantitativa en tiempo real.

En estos gráficos de amplificación, las líneas horizontales representan el umbral de detección. Datos representativos de PCR en tiempo real a partir de HDL aislada, obtenidos de seis muestras, mostraron la detección constante de ambos microARN. Por último, los análisis de curvas de fusión muestran claramente un pico único y distinto para ambos microARN, lo que es consistente con una amplificación específica en la PCR anterior.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en nueve horas, junto con los procedimientos de desalinización, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante trabajar a una temperatura de cuatro a ocho grados centígrados en todo momento. Y ajustar la densidad de cada fracción de lipoproteína antes de la ultracentrifugación.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la microscopía electrónica, con el fin de responder preguntas adicionales, como la pureza de las HDL. Después de su desarrollo, esta técnica permitirá a los investigadores en el campo del síndrome metabólico explorar las microARN asociadas a las HDL como biomarcadores en humanos con sospecha de enfermedad hepática grasa. Asimismo, podría utilizarse para comprender mejor la función de las HDL y los mecanismos moleculares mediante los cuales alteran la biología celular.