Name: Método rápido y simplificado para el aislamiento alto rendimiento de procesamiento de miRNA desde muy puras lipoproteína de alta densidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Aprende un método simplificado para aislar lipoproteínas de alta densidad purificadas de plasma humano. Esta técnica permite analizar microARN de HDL con volúmenes reducidos de muestra en poco tiempo.

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1. Recolección de Muestras de Sangre <ol><li> Recoger el ayuno muestras de sangre venosa periférica en tubos de 10 ml de plástico que contienen ácido anticoagulante etilendiaminotetraacético (EDTA) (que tiene varias ventajas sobre otros anticoagulantes) por punción venosa estándar de una vena prominente en la fosa antecubital. </li><li> Centrifugar las muestras de sangre a 1.600 xg durante 20 min a 4 ° C en una centrífuga de mesa para obtener plasma libre de células rojas de la sangre y pequeñas cantidades de ARN. </li><li> Secuencialmente centrifugar el sobrenadante a 3.000 g (4 ° C) en un cubo de rotor de balanceo por 10 min para eliminar WBC y plaquetas y luego adicional 15 min para eliminar los desechos de células restante, respectivamente. </li><li> Medir la densidad del plasma utilizando un densitómetro a TA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. NOTA: El ajuste de la densidad (d = 1,023 g / ml) con solución salina al 0,9% puede ser necesaria después de la eliminación de los exosomas pero antes de la ultracentrifugación en gradiente de densidad. </li></ol&gt; 2. Eliminación de exosoma de Plasma <ol><li> Retire los exosomas circulantes que tienen una densidad similar a la HDL y representan una fuente cuantitativamente significativo de miARN 3. <ol><li> Para ello, agregue 252 l solución de precipitación exosome a 1 ml de plasma seguido de incubación durante 30 min a 4 ° C. Para sedimentar los exosomas, centrifugar la mezcla durante 30 minutos a 1500 g a 4 ° C. </li><li> Para aislar HDL, la transferencia de 1 ml del sobrenadante resultante a un tubo de ultracentrífuga de policarbonato de paredes gruesas para su procesamiento posterior con la ultracentrifugación en gradiente de densidad (véase más adelante). </li></ol></li></ol> 3. La ultracentrifugación en gradiente de densidad (Figura 1). <ol><li> Para separar HDL utilizar un proceso de 3 pasos empleando una ultracentrífuga suelo con un rotor de ángulo fijo que opera a 448.811 x G y 8 ° C, respectivamente. </li><li> Preparar tres soluciones diferentes de densidad secuencialmente y fresco para cada aislamiento. <ol><li> Preparar la solución A (aislamiento de VLDL, d = 1,006 g / ml) mediante la disolución de 11,4 g de NaCl (NaCl: 0,195 mol), 0,1 g EDTA2Na y 1 ml de NaOH 1 N en 1.000 ml de agua destilada-autoclave. A continuación, añadir un adicional de 3 ml de agua destilada en autoclave. </li><li> Preparar la solución B (aislamiento de LDL, d = 1,182 g / ml) mediante la adición de 25,2 g de NaBr a 100 ml de solución A (NaCl 0,195 mol, NaBr 2,44 mol). </li><li> Preparar la solución de C (aislamiento de HDL, d = 1,470 g / ml) mediante la mezcla de 78,8 g de NaBr con 100 ml de solución A (NaCl 0,195 mol, NaBr 7,7 mol). Confirmar la densidad adecuada a temperatura ambiente usando un densitómetro. Mantenga todas las soluciones a 4 ° C hasta su uso posterior. </li></ol></li></ol> 4. Aislamiento de VLDL <ol><li> Mezclar 1 ml de plasma (densidad media = 1.023 g / ml) y nucleasa libre 200 l de Fat Red 7B en un tubo de ultracentrífuga de pared gruesa 6,5 ​​ml de policarbonato. </li><li> A continuación, la capa cuidadosamente 5 ml de la solución A en la parte superior de la mezcla. Si es necesario, añadir grasa adicional Red 7B en la parte superior de la solución A to equilibrar el peso de cada tubo. Centrifugar durante 2 horas (aceleración - 5), (deceleración - 7). NOTA: Durante la centrifugación, las lipoproteínas se acumulan como una banda en sus regiones de densidad de equilibrio. </li><li> Al final de la carrera observar 2 capas. Retirar 1,5 ml de la fracción VLDL que representa la capa superior y se almacena a 4 ° C. </li><li> Finalmente, utilizando una pipeta de transferencia 4 ml de la parte inferior del tubo que contiene el LDL, HDL, la albúmina y la fracción de ácido graso a un nuevo tubo de policarbonato para el aislamiento de LDL. </li></ol> 5. Aislamiento de LDL <ol><li> Mezclar 2 ml de la solución B y 100 l de nucleasa libre de grasa Red 7B en el tubo que contiene la fracción LDL y HDL (sección 4), respectivamente. </li><li> Centrifugar a cabo durante 3 horas (aceleración 9, deceleración 7). A partir de entonces, retirar 1,5 ml de la fracción LDL que representa la capa superior y mantener a 4 ° C o almacenar a -80 ° C. Finalmente, la transferencia de 4 ml de la parte inferior del tubo que contiene la HDLfracción a un nuevo tubo de policarbonato. </li></ol> 6. Aislamiento de HDL <ol><li> Mezclar 2 ml de la solución C, 100 nucleasa l libre Fat Red 7B y 15 l de 98% β-mercaptoetanol en el tubo que contiene la fracción HDL, respectivamente. </li><li> Centrifugar durante 3 horas (aceleración 9, deceleración 7). A partir de entonces retire 2 ml de la fracción HDL representan la capa superior y, o bien mantener a 4 ° C o almacenar a -80 ° C. </li></ol> 7. La desalación y concentración de la lipoproteína de fracciones <ol><li> Para evitar la interferencia con la electroforesis en gel de agarosa posterior y PCR, eliminar el exceso de sal añadida durante la ultracentrifugación en gradiente de densidad usando dispositivos de filtro centrífugos con el corte de peso molecular apropiado (tubo 3K para VLDL y el tubo de 10K para LDL / HDL) como se describe por las instrucciones del fabricante. <ol><li> En pocas palabras, después de la adición de 2,5 ml de PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 8 mM, KH2PO4 2 mM; pH 7,4) frío centrifuge toda la fracción VLDL recogió-durante ultracentrifugación en gradiente de densidad a 4 ° C durante 60 min usando un rotor de cubeta oscilante. </li><li> Desalar la fracción LDL dos veces con 10 ml de PBS enfriado en hielo durante 30 minutos cada uno. A continuación, utilizar 13 ml de PBS helado dos veces para la desalación de la fracción HDL. El volumen de PBS más alto es necesario para mejorar la movilidad con electroforesis en gel de agarosa. Después de la centrifugación, eliminar los solutos que contienen lipoproteínas y mantenerse a 4 ° C o se almacena a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 8. gel de agarosa La electroforesis <ol><li> Perfrom electroforesis en gel de agarosa empleando el kit de lipoproteínas con modificaciones menores de las instrucciones del fabricante de la siguiente manera. NOTA: Este paso es sólo para evaluar la calidad y la pureza de las muestras concentradas de lipoproteínas. <ol><li> En pocas palabras, obtener 6 l de la fracción de lipoproteínas de desalado con ultracentrifugación en gradiente de densidad y cargar en un gel de lipoproteína pre-cast. Utilice LipoP humanarotein normas de VLDL, LDL y HDL como referencia de tamaño. Llevar a cabo la electroforesis a temperatura ambiente a 100 V durante 60 minutos usando tampón Rep Prep. </li><li> Secar el gel durante 10 min y luego manchar durante 10 min a RT con Fat Red 7B. Destain el gel en una mezcla de metanol-agua 75:25 (v / v) y se seca de nuevo por 5 min. </li></ol></li></ol> 9. RNA Extracción y Purificación <ol><li> Perfrom aislamiento de los genes miARN HDL humano purificado utilizando el kit de suero / plasma de aislamiento y purificación de miRNA. <ol><li> En pocas palabras, añadir 1 ml de reactivo de lisis de ARN de 200 l de HDL purificada, se mezcla con un vórtice y luego se incubaron durante 5 min a RT para asegurar la disociación completa de los complejos de nucleoproteína y la inactivación de las RNasas. </li><li> Entonces pico de 3,5 l de Caenorhabditis Elegans sintética microARN (miR-cel-39, 1,6 x 10 8 copias / l) en la mezcla. A continuación, llevar a cabo la extracción de ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol></li><li> realizar Purificatien extraída de los genes miARN con columnas de centrifugación eluir según las instrucciones del fabricante. Medir la concentración de miARN de HDL purificada con un spectrophorometer. NOTA: La elución de miRNA de las columnas de centrifugación empleó 16 l de agua libre de RNasa. </li></ol> 10. transcripción inversa (RT-PCR) <ol><li> Aislar 100 ng de los genes miARN de HDL enriquecida con los genes miARN sintético (cel-miR-39) y a transcripción inversa en un volumen de reacción de 20 l que emplea el kit de transcripción inversa y de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Realizar controles apropiados sin plantilla miRNA (NTC) y sin mezcla de enzima transcriptasa inversa (NRT). </li></ol> 11.-PCR en tiempo real (QRT-PCR) <ol><li> Perfrom PCR en tiempo real en un volumen total de 20 l con 2 l de una dilución 1: 2 del ADNc, 10 l de la mezcla PCR, 2 l cebador universal, 2 l de cebadores miARN y 4 l de agua libre de RNasa. </li><li> Ejecutar los reactien en placas de 96 pocillos a 95 ° C durante 15 min, seguido de 45 ciclos de 94 ° C durante 15 segundos y 55 ° C durante 30 s y una fase de extensión a 70 ° C durante 30 s.ec perfrom todas las reacciones por triplicado . </li><li> A continuación, calcuate cantidades relativas de los genes miARN utilizando el método 2 -ΔΔ Ct después de la normalización para la limpieza de genes sintética según las instrucciones del fabricante. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Identificación de nuevos biomarcadores de la sangre será ayudar en el diagnóstico clínico y el pronóstico de diversas enfermedades. Los microARN han sabe que poseen todas las cualidades de biomarcadores y se ha demostrado en diversos estudios 14-17. En este estudio hemos demostrado método fácil rápido y sencillo para aislar los genes miARN de HDL plasma. Densidad convencional gradiente método de ultra-centrifugación de aislamiento de VLDL, LDL y HDL depende de muestreo preciso de plasma, una preparación preci...

Los microRNAs son especies endógenas de ARN diminutas no codificantes que están altamente conservadas y se consideran actores clave en la regulación de diversos procesos biológicos mediante la degradación o represión de ARN mensajeros diana específicos1. Debido a que los miARN actúan intracelularmente, se han explorado como biomarcadores derivados de tejidos, lo que condujo al descubrimiento de las funciones específicas de los tejidos de estos miARN. Sin embargo, los miRNAs también se encuentran extracelularmente, ya sea asociados a proteínas o en exosomas/microvesículas que pueden protegerlos eficazmente de la degradación por RNasasextracelulares 2. Estudios más recientes han demostrado que el efecto protector del HDL puede no estar estrechamente relacionado con su capacidad para promover el flujo de colesterol, sino más bien con su carga no colesterolosa, en particular como portador de miARN circulantes 3, 4. Estos miRNAs no solo pueden modular el metabolismo de los lípidos, sino que también se asocian con efectos antiinflamatorios, antioxidantes y antitrombóticos del complejo HDL-miRNA 5, 6.
Para explorar más a fondo el papel de los miRNAs transportados en las partículas de HDL, es necesario establecer un protocolo simple y fácil para la extracción de miRNAs de HDL altamente purificado aislado para su uso en la rutina clínica. Se han descrito numerosos métodos para aislar el HDL. Estos métodos consumen mucho tiempo o requieren un gran volumen de plasma que puede requerir la agrupación de muestras, una diálisis extensa para desalinizar lipoproteínas aisladas y no eliminan completamente los exosomas como fuente de miARN3, respectivamente. Aquí describimos un método simple y rápido que puede aislar miARN de HDL altamente purificado utilizando un pequeño volumen de muestras de sangre a mayor escala. Creemos que este método puede servir como buena referencia para promover la investigación sobre el papel de los miRNAs circulantes y, en particular, el papel de las HDL en la facilitación de la comunicación entre diversas células y órganos.

<table><tbody><tr><td>Tubos de plástico Vacutainer Lavanda K2EDTA&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson y compañía</td><td>366643</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga</td><td>Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R&nbsp;</td><td></td><td></td>75004261</tr><tr><td>Densitómetro Densito 30PX</td><td>Mettler Toledo</td><td>MT51324450</td><td></td></tr><tr><td>solución ExoQuick&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>4484451</td><td></td></tr><tr><td>Tubo ultracentrífugo de pared gruesa de policarbonato</td><td>Thermo Scientific</td><td>O3237</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX100 ultracentrífuga&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>46902</td><td></td></tr><tr><td>Rojo Gordo 7B&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201618</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Dispositivos de filtro centrífugo 10K</td><td>Millipore</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Dispositivos de filtro centrífugo 3K</td><td>Millipore</td><td>UFC800308</td><td></td></tr><tr><td>QuickGel Lipo kit&nbsp;</td><td>Laboratorios Helena&nbsp;</td><td>3344,3544T Estándares de</td><td></td></tr><tr><td>lipoproteínas humanas para VLDL, LDL y HDL</td><td>LipoTrol; Helena Laboratories</td><td>5069</td><td></td></tr><tr><td>Rep Prep buffer&nbsp;</td><td>Laboratorios Helena&nbsp;</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>Columnas de centrifugación RNeasy MinElute&nbsp;</td><td>Analizador Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT Kit&nbsp;</td><td>Sistema</td><td></td> de detección de PCR en tiempo real Qiagen 218161 <td></td></tr><tr><td>CFX96 Touch BioRad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma Kit</td><td>QIAGEN</td><td>217184</td><td></td></tr><tr><td>miScript Primer</td><td>QIAGEN</td><td>141078139</td><td></td></tr><tr><td>miScript SYBR Green PCR Kit&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>218073</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Suero/Control de Espiga Plasmática</td><td>QIAGEN</td><td>219610</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td></td></tr> 480878 <tr><td>0.20 &#181; M filtro de jeringa estéril</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>Z227536</td><td></td></tr></tbody></table>

método rápido y simplificado para el aislamiento alto rendimiento de procesamiento de mirna desde muy puras lipoproteína de alta densidad

Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein

Los pequeños ARN no codificantes (miRNAs) han sido implicados en una variedad de enfermedades humanas, incluyendo síndromes metabólicos. Pueden utilizarse como biomarcadores para el diagnóstico y el pronóstico o pueden servir como dianas para el desarrollo de fármacos, respectivamente. Recientemente se ha demostrado que los miRNAs se transportan en las lipoproteínas, en particular en las lipoproteínas de alta densidad (HDL) y se entregan a las células receptoras para su absorción. Esto plantea la posibilidad de que los miARN desempeñen un papel crítico y fundamental en la función celular y de los órganos a través de la regulación de la expresión génica, así como mensajeros para las comunicaciones entre células y la diafonía entre órganos. Los métodos actuales para el aislamiento de miARN a partir de HDL purificado no son prácticos cuando se utilizan muestras pequeñas a gran escala. Esto se debe en gran medida a los métodos laboriosos y lentos utilizados para el aislamiento de lipoproteínas. Hemos desarrollado un enfoque simplificado para aislar rápidamente el HDL purificado adecuado para el análisis de miARN a partir de muestras de plasma. Este método debería facilitar las investigaciones sobre el papel de los miRNAs en la salud y la enfermedad y, en particular, proporcionar nuevos conocimientos sobre la variedad de funciones biológicas, fuera del transporte inverso del colesterol, que se han atribuido al HDL. Además, las especies de miARN que están presentes en el HDL pueden proporcionar información valiosa de biomarcadores clínicos para el diagnóstico de diversas enfermedades.

Aislamiento de lipoproteína de alta densidad después de eliminar las exosomas Para obtener los genes miARN de HDL altamente purificada es necesario para eliminar los exosomas que representan una fuente de contaminación miRNA 7. Esto se hizo antes de la ultracentrifugación en gradiente de densidad con un kit disponible en el mercado. Para fines prácticos un protocolo de ultracentrifugación en gradiente de densidad estándar de tres pasos ...

MicroARNs juegan un importante papel regulador y están surgiendo como nuevas dianas terapéuticas para diversas enfermedades humanas. Se ha demostrado que miRNAs se realizan en las lipoproteínas de alta densidad. Hemos desarrollado un método simplificado para aislar rápidamente HDL purificado adecuado para el análisis de los genes miARN partir de plasma humano.

Método rápido y simplificado para el aislamiento alto rendimiento de procesamiento de miRNA desde muy puras lipoproteína de alta densidad

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for ...

El objetivo general de este método es desarrollar un enfoque simplificado para aislar rápidamente lipoproteínas de alta densidad purificadas del plasma sanguíneo humano para el análisis de microARN. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en hepatología y cardiología, como comprender los mecanismos moleculares y las funciones protectoras de las lipoproteínas de alta densidad. Algunas ventajas principales de esta técnica son que los microARN de HDL purificados se obtienen previamente aislados a partir de volúmenes menores de muestras en un corto período de tiempo.En este protocolo, el plasma se obtiene a partir de muestras de sangre venosa periférica en ayunas mediante varios pasos de centrifugación, como se describe en el texto del protocolo. Transfiera el plasma a un nuevo tubo y mida la densidad del plasma utilizando un densitómetro a temperatura ambiente, según las instrucciones del fabricante.Para eliminar los exosomas circulantes que representan una fuente de contaminación de microARN, agregue 252 microlitros de solución de precipitación de exosomas a un mililitro de plasma. Incube durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Luego, centrifugue la mezcla durante 30

fast-simplified-method-for-high-through-put-isolation-mirna-from

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Investigación

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Biology

Biología

A continuación se describe un reverso transcriptasa optimizado multiplex PCR cuantitativa (QRT-PCR) en combinación con el protocolo de una plataforma de microfluidos como un costo y el tiempo efectivo instrumento de cribado de alto rendimiento para los microRNA (miRNA) los niveles de expresión, especialmente cuando se trabaja con cantidades limitadas de muestras.

Perfiles de microARN de alto rendimiento: Multiplex Optimizado QRT-PCR en la escala de nanolitros de la IFC Fluidigm dinámica ArrayTM

Este video describe la extracción de microARN circulante de muestras de plasma de pacientes con cáncer colorrectal utilizando extracción orgánica seguida de enriquecimiento de columna de fibra de vidrio. Los miARN son estables en fluidos biológicos como el suero y el plasma, lo que los convierte en biomarcadores circulantes ideales para el diagnóstico del cáncer, el pronóstico y la toma de decisiones y el seguimiento del tratamiento. Este método ayudará a identificar nuevos biomarcadores...

Extracción de miARN circulante: un método para aislar miARN de muestras de plasma mediante extracción orgánica y enriquecimiento de ARN pequeño

La presencia de microRNAs estables (miRNAs) en exosomas ha generado gran interés como un nuevo modo de comunicación intercelular, por su utilidad potencial como marcadores biológicos y como una ruta para la intervención terapéutica. Aquí se demuestra la purificación de exosomas sanguíneos y medios de cultivo seguido de PCR cuantitativa para identificar miRNAs que se transportan.

Purificación y microRNA perfiles de exosomas derivados de la sangre y Cultura Medios

Este protocolo describe un método para la extracción de ARN pequeños a partir de suero humano. Hemos utilizado este método para aislar los microARNs de suero de cáncer para su uso en arrays de ADN y PCR cuantitativa singleplex. El protocolo utiliza fenol y tiocianato de guanidina reactivos con modificaciones para producir ARN de alta calidad.

El aislamiento de los pequeños RNAs no codificantes de suero humano

Los microRNAs (miRNAs) son una clase ampliamente conservada de moléculas reguladoras. Aquí describimos un método de clonación de miRNA que se basa en dos potentes pasos de ligadura seguidos de una secuenciación de alto rendimiento. Nuestro método permite una cuantificación precisa de miRNAs en todo el genoma.

Ligadura Altamente Eficiente de los Pequeños ARN moléculas de microARN cuantificación mediante secuenciación de alto rendimiento

El líquido biliar es una valiosa fuente de vesículas/exosomas extracelulares que contienen biomarcadores potencialmente importantes. Este protocolo representa un método sólido para aislar exosomas de la bilis humana para análisis posteriores, incluido el perfil de miARN.

El aislamiento y la generación de perfiles de exosomas de la bilis humana que contiene microRNA

Este protocolo describe el aislamiento y la cuantificación de pequeños ARN de lipoproteínas de alta densidad.

El aislamiento de las lipoproteínas de alta densidad para no codificante ARN pequeño Cuantificación

Este Protocolo establece un método novedoso de aislamiento de gotas de lípido y purificación de hígado de ratón, usando un kit de aislamiento de retículo endoplásmico bien establecida.

Lipídico rápido gota protocolo de aislamiento utilizando un Kit de aislamiento de organelas bien establecidas

Aquí, se presenta un protocolo cuantitativo en tiempo real basado en la reacción en cadena de la polimerasa para la determinación del contenido nativo de microARN (absoluto/relativo) de las partículas de lipoproteína. Además, se demuestra un método para aumentar el nivel de microARN, así como un método para determinar la tasa de captación celular de las partículas de lipoproteínas.

Enriquecimiento de partículas de lipoproteínas nativas con microRNA y determinación posterior de su contenido absoluto/relativo de microRNA y su tasa de transferencia celular

Aquí, describimos una estrategia paso a paso para aislar pequeños ARN, enriquecer para microARN y preparar muestras para la secuenciación de alto rendimiento. A continuación, describimos cómo procesar lecturas de secuencia y alinearlas con microRNAs, utilizando herramientas de código abierto.

Una tubería completa para aislar y secuenciar microRNAs, y analizarlos mediante herramientas de código abierto

Se han utilizado varios métodos para analizar lipoproteínas plasmáticas; sin embargo, ultracentrifugación sigue siendo uno de los métodos más populares y confiables. Aquí, describimos un método con respecto a cómo aislar las lipoproteínas del plasma utilizando ultracentrifugación de densidad secuencial y cómo analizar las apolipoproteínas con fines diagnósticos y de investigación.

Aislamiento y análisis de lipoproteínas plasmáticas por ultracentrifugación

Aprende un método simplificado para aislar lipoproteínas de alta densidad purificadas de plasma humano. Esta técnica permite analizar microARN de HDL con volúmenes reducidos de muestra en poco tiempo.

Método rápido y simplificado para el aislamiento alto rendimiento de procesamiento de miRNA desde muy puras lipoproteína de alta densidad (Video) | JoVE Journal

Método rápido y simplificado para el aislamiento alto rendimiento de procesamiento de miRNA desde muy puras lipoproteína de alta densidad

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