Name: Citología de Impresión del Área de limpiaparabrisas tapa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Aprende citología de impresión del área limpiaparabrisas del párpado para evaluar el impacto de la fricción en la superficie ocular. Este método mínimamente invasivo permite analizar células epiteliales y comprender mejor el ojo seco.

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Nos gustaría agradecer a nuestro colega el Dr. Jalaiah Varikooty que aportó su visión y experiencia sobre el tema del limpiaparabrisas, que ayudó enormemente en esta investigación.

Ética declaración: Antes de la recolección de células de sujetos humanos, el consentimiento informado y se debe obtener la aprobación ética. 1. Preparar a las manchas NOTA: Preparar mancha en el día del experimento. <ol><li> Añadir 5 l de etidio (o 4 M) y 5 l de calceína AM (o 4 M) a 2,5 ml solución salina tamponada con fosfato (PBS) en 15 ml tubo de centrífuga; mezcla. Envolver en papel de aluminio para protegerlo de la luz y se almacena a temperatura ambiente hasta su uso. </li></ol> 2. Las células Collect <ol><li> Retire insertos de cultivo celular de su paquete y la etiqueta de cada párpado a muestrear. Marca de orientación de recogida de células en el lado del soporte de plástico de la membrana usando un marcador permanente. Conducta cortó la inspección de la lámpara con un aumento moderado (aproximadamente 20 veces) para confirmar la salud apropiada de la región que someterse a IC. </li><li> Deje caer una gota de anestésico tópico (0,5% de hidrocloruro de proparacaına) en el saco conjuntival inferior del eaojo ch e instruir a los participantes para mantener los ojos cerrados durante un minuto. </li><li> Evert párpado superior y mantenga en su lugar por las pestañas; evitar el contacto con la zona de la tapa del limpiaparabrisas. Opcional: la ayuda de un investigador secundario puede ser requerido para realizar este paso. </li><li> Aplicar membrana perpendicularmente sobre la parte central de la región de limpiaparabrisas tapa con una presión mínima. </li><li> Mantenga la membrana en su lugar por 3 - 5 segundos. Observar la membrana translúcida convertido en el área de contacto. En este punto, retire con cuidado la membrana y permitir la tapa del participante de &quot;flip&quot; en su lugar. </li><li> Inmediatamente aplicar una gota de PBS a la muestra, para evitar que se sequen. Membrana a su vez, translúcido y opaco no debe girar en cualquier momento, ya que esto indica secado. Tiene el investigador secundaria proceder inmediatamente con el procesamiento de las muestras (sección 3). </li><li> Realizar comprobación final del ojo para asegurar la integridad de la conjuntiva. Prescindir de los lubricantes oculares e instruir a los participantespara evitar frotarse los ojos hasta que el efecto anestésico desaparece (aprox. 15 min). </li></ol> Procesamiento 3. Muestra <ol><li> El uso de micro-tijeras, corte de la membrana en un medio (un medio para cada uno de los análisis aguas abajo), perpendicular a través de la mitad de la recogida de células. Corte a lo largo del margen exterior de una media membrana para separarla de la soporte de plástico; evitar la interacción con las células recogidas en la membrana, incluyendo asegurar que la membrana no se pliega sobre sí mismo. </li><li> Asegure la membrana con unas pinzas antes de separar por completo del soporte. Lugar membrana en la etiqueta del tubo de centrífuga de 2 ml que contenía 500 l de 95% (v / v) de etanol y dejar de fijar durante un mínimo de 20 minutos hasta un máximo de 2 horas antes del procesamiento (sección 4.2). </li><li> segunda mitad inmediatamente separada de la membrana (tal como se describe en la sección 3.2) y proceder de inmediato con la sección 4.1. </li></ol> La tinción 4. Muestra <ol><li> ImmunocytochemiLa tinción cal <ol><li> Coloque con cuidado la membrana de vidrio de placa de cultivo de 35 mm con fondo colección lado hacia abajo; asegurar membrana es plana. </li><li> Pipeta de 20 l de composición de tintura inmuno montado en la sección 1 a la membrana. Si rizos de ejemplo, utilizar puntas de pipeta desechables para aplanar cuidadosamente la membrana presionando sus bordes hacia abajo. Evitar el contacto con las zonas de recogida de células. </li><li> cubrir con cuidado la membrana con cubierta de vidrio deslizante. Evitar movimientos innecesarios de la muestra. Cubrir el plato con la tapa y el sello con el laboratorio de película alrededor de los bordes. No obstruya la transparencia del plato (superior e inferior) y la visibilidad de la muestra. La etiqueta del marcador de laboratorio. </li><li> Inmediatamente proceder con la proyección de imagen (sección 5.1), y luego volver a la sección 4.2 para continuar con la tinción citológica de la otra mitad de la membrana. </li></ol></li><li> La tinción citológica <ol><li> Poco a poco hidratar la membrana por adición lenta de 500 l de agua destilada en el tubo uSed para su fijación en el apartado 3.4. Aspirar los contenidos varias veces a punta de pipeta para mezclar, a continuación, eliminar el contenido. </li><li> Añadir 500 l de agua destilada. Dejar reposar durante unos segundos, luego retire. Añadir 500 l de tinción de azul Alcian y dejar actuar durante 3 minutos. Retire las manchas y realice 3 consecutiva de 500 l de agua destilada enjuagues o hasta que el líquido se enjuaga clara. </li><li> Añadir 500 l de hematoxilina # 1 de manchas y dejar actuar durante 3 minutos. Retire las manchas y realizar tres lavados consecutivos 500 l de agua destilada o hasta que el líquido se enjuaga clara. Deshidratar (inversa de la sección 4.2.1) aspirando el líquido claro. </li><li> Añadir 500 l de Papanicolaou OG-6 mancha y dejar actuar durante 3 minutos. Retirar la mancha y realice una 500 l 95% (v / v) de enjuague de etanol. </li><li> Añadir 500 l de Papanicolaou EA-65 mancha y dejar actuar durante 3 minutos. Quitar las manchas y realizar 3 consecutiva 500 l 95% (v / v) de etanol se enjuaga. </li><li> Totalmente deshidratar usando tres 500 l 100% aclarados consecutivos de etanol. El uso de TWEezers, retire la muestra de la solución; evitar las zonas de recolección de células tocar. </li><li> Coloque la membrana sobre portaobjetos de vidrio; asegurar que la línea de recogida de células es paralela o perpendicular a deslizarse margen para la alineación más fácil durante la exploración. </li><li> Aplicar una gota de etanol al 100% y cubrir con el resbalón de vidrio. Inmediatamente proceder con la proyección de imagen (sección 5.2). </li></ol></li></ol> 5. Muestra de Imágenes <ol><li> Las manchas fluorescentes de imágenes Inmunocitoquímico <ol><li> Use un microscopio confocal de barrido láser (CLSM) 11 o microscopio de fluorescencia 12, equipado con una cámara digital de color, conectado a un equipo que ejecuta un software de adquisición de imágenes. Debido a las muestras que se están contenidos dentro de placas de cultivo, un microscopio invertido puede ser necesario. </li><li> Configurar microscopio 11,12 de acuerdo con los espectros de absorción y emisión de etidio homodímero-1 (528/617 nm maxima Ex / Em en presencia de DNA) y calceína AM (494/517 nm Emáximos x / Em). </li><li> Seleccionar aumento más bajo del microscopio (por ejemplo, el objetivo 2,5X) y activar el sistema de imagen digital; observar la muestra exhibida en el monitor de la computadora. </li><li> Inspeccionar la muestra para características celulares de interés. </li><li> Seleccionar magnificación del microscopio deseado y adquirir imágenes utilizando software de imagen. </li><li> Guardar archivos en cualquier formato de archivo nativo de microscopio o un formato de archivo sin comprimir (por ejemplo, * .raw, * .tiff). </li></ol></li><li> Las manchas de imagen citológica <ol><li> Utilizar un microscopio estándar de laboratorio de campo brillante sin filtros, equipado con una cámara digital en color, conectado a un ordenador con un software de adquisición de imágenes. </li><li> Lugar y portaobjetos de vidrio de bloqueo (de la etapa 4.2.8) en la platina del microscopio. Rehidratar la muestra con 100% de etanol, según sea necesario, a lo largo de todo el procedimiento de formación de imágenes. </li><li> Seleccionar aumento más bajo del microscopio (por ejemplo, el objetivo 2,5X) y activar THsistema de imagen digital e; observar la muestra exhibida en el monitor de la computadora. </li><li> garantizar la recogida de células se alinea con X o Y del eje de control de platina del microscopio. Ajustar si es necesario, mediante la eliminación de la hoja de la cubierta y la rotación de la muestra usando una punta de pipeta o pinzas. </li><li> El uso de la imagen (s) de captura de la totalidad de la muestra con el microscopio óptico bajo el software de imágenes,. </li><li> Cambiar a la magnificación del microscopio moderada (por ejemplo, 10 - 20X objetivo) y ajustar la fuente de luz del microscopio y los parámetros de imagen de software (exposición, contraste, balance de blancos, etc.), y desactivar la medición de software automatizado. Guardar esta configuración para su uso futuro. </li><li> Determinar puntos de inicio y final de la exploración (por ejemplo, esquinas superiores izquierda y derecha inferior de la recolección de células). </li><li> El uso de la imagen (s) de captura de toda la zona de recogida de células dentro de los puntos inicial y final del software de imágenes,. Garantizar un 20% de lado a lado y de arriba a abajo solapamiento between todas las imágenes adyacentes. </li><li> Guardar archivos usando el formato de archivo nativo de microscopio o un formato de archivo sin comprimir (por ejemplo, * .raw, * .tiff). </li><li> Generar una imagen panorámica final utilizando el software automatizado de costura de elección (por ejemplo, Adobe Photoshop Elements). Usar imágenes de referencia tomados en el paso 5.2.5) para confirmar la exactitud de la costura automatizada en la imagen final. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen financiación relevante ni conflictos que revelar.

La citología de impresión se lleva a cabo normalmente en la conjuntiva bulbar, utilizando membranas de ésteres mixtos de celulosa. Las muestras se cortan a tamaño de las hojas de material a granel, esterilizar, aplicar y retirar de la superficie conjuntival usando fórceps. Utilizando el mismo material de la membrana, un dispositivo de IC pistón controlado fue diseñado recientemente para que coincida con la geometría de la superficie de la conjuntiva bulbar, y mantener una presión constante entre las aplicaciones 13...

El párpado superior humano ejecuta alrededor de 10.000 parpadea cada día 1, con sólo un 1 - 2 mm región conjuntival estrecha opuestos del globo ocular. Debido a su movimiento de limpieza durante el parpadeo, esta porción de la margen del párpado se ha denominado la región &quot;tapa de limpiaparabrisas&quot; 2. Se supone que la fricción se incrementa en esta región durante el parpadeo habitual, debido a la tapa limpia el mundo. Esto puede jugar un papel importante en la comodidad ocular. Los portadores de lentes de contacto, en particular, la experiencia malestar ocular y esta es una de las principales razones para cesar el uso de lentes 3. Cuando una lente de contacto se coloca en el ojo, el coeficiente de fricción entre el material de la lente y la superficie ocular se ha demostrado que cambiar 4. Hay evidencias que sugieren que los síntomas de sequedad podrían estar relacionados con esta fricción alterada 2,5,6. Esta asociación también se puede reflejar en los fenómenos clínicamente observables, especialmente wi tapapor epiteliopatía (LSA), también llamado margen del párpado superior tinción (ULMS) 6. LSA es una señal temprana de la irritación ocular y un predictor potencial para la enfermedad del ojo seco. Se observa y se mide por la tinción vital de las regiones borde del párpado superior e inferior. Si bien este sistema de clasificación 2 y su validez clínica (es decir, la correlación con síntomas subjetivos) están siendo objeto de debate, molestia ocular sigue siendo un enigma para los médicos y científicos por igual y, sobre todo, un inconveniente para los pacientes. Hasta la fecha, poco se sabe acerca de las variaciones clínicamente relevantes en el (sub) la anatomía y la fisiología celular de la zona del limpiaparabrisas tapa 7 y un único informe hace uso de métodos citológicos 8. La citología de impresión (IC) ha sido empleado durante más de 40 años para recoger las células de la superficie epitelial de la conjuntiva tarsal bulbar o mediante la aplicación de una membrana de 9,10. Tras la retirada, las células adherentes se someten a ctinción ytological y de imágenes microscópicas. Debido a las diferencias anatómicas y celulares de la región de limpiaparabrisas tapa, esta técnica requiere la optimización.

<table><tbody><tr><td>Azul Alcián, 1% en Ácido Acético al 3% Sigma</td><td></td><td>B8438-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina, Branquia 1</td><td>Sigma</td><td>GHS116-500ML</td><td></td></tr><tr><td>tinción de Papanicolaou, OG-6</td><td>Sigma</td><td>HT40116-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>tinción de Papanicolaou, EA</td><td>Sigma</td><td>modificado HT40232-1L</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Viabilidad/Citotoxicidad Vivo/Muerto Life Technologies</td><td></td><td>L-3224</td><td>contiene homodímero-1 de etidio y colorantes Calceína AM</td></tr><tr><td>Alcaína (0,5% clorhidrato de proparacaína)</td><td>Inserto</td> de cultivo celular Alcon <td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell, 12&nbsp; mm, PTFE hidrófilo, 0,4 y nbsp; y micro; m</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM01250&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Platos con fondo de vidrio de 35 mm</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr></tbody></table>

citología de impresión del Área de limpiaparabrisas tapa

Impression Cytology of the Lid Wiper Area

Existen pocos informes sobre la anatomía celular del área del limpiaparapado interno (LW) del párpado interno y solo un informe hace uso de métodos citológicos. En este estudio se describe la optimización de un método de recolección, tinción e imagen de células de la región LW mediante citología de impresión (CI). Las células se recogen de la superficie interna del párpado superior de los sujetos humanos utilizando membranas hidrofílicas de politetrafluoroetileno (PTFE) y se tiñen con tintes citológicos para revelar la presencia de células caliciformes, mucinas, núcleos celulares y varios grados de pre queratinización. Los colorantes inmunocitoquímicos muestran la actividad de la esterasa celular y las membranas celulares comprometidas mediante el uso de un microscopio láser de barrido confocal. Se capturan hasta 100 imágenes digitales microscópicas para cada muestra y se unen en una imagen de alta resolución a gran escala de todo el intervalo del CI. Demostramos una mayor sensibilidad de la CI que la reportada anteriormente, apropiada para identificar morfologías celulares y actividad metabólica en el área de LW. Hasta donde sabemos, esta es la primera vez que se utiliza esta selección de tintes fluorescentes para obtener imágenes de membranas LW IC. Este protocolo será efectivo en estudios futuros para revelar detalles no documentados del área de LW, como la evaluación de las particularidades celulares de los usuarios de lentes de contacto o pacientes con ojo seco o epiteliopatía del limpiador de párpados.

La membrana de cultivo celular abarcado sobre el soporte de plástico es una herramienta conveniente para la recolección de mano de las células epiteliales de la conjuntiva tapa del limpiaparabrisas. Este método elimina la necesidad de instrumentos esterilizados adicionales típicamente usados ​​para preparar y manejar las membranas de IC. La Figura 1 representa el IC de la zona de limpiaparabrisas tapa usando un inserto de cultivo celular. Hemos optimizado dos protocolos ...

Recolectamos, tiñimos y fotografiamos células de la conjuntiva del margen del párpado interno de sujetos humanos. Al caracterizar la morfología celular y la actividad metabólica, este método puede mejorar nuestra comprensión del ojo seco y el papel que puede desempeñar la fricción entre las superficies oculares en la percepción de las molestias oculares.

Citología de Impresión del Área de limpiaparabrisas tapa

Few reports on the cellular anatomy of the lid wiper (LW) area of the inner eyelid exist and only one report makes use of cytological methods. The ...

El objetivo general de este procedimiento es recolectar, procesar y visualizar células epiteliales de los márgenes palpebrales para evaluar los efectos de la fricción en la superficie ocular. Este método podría ayudar a responder preguntas clave sobre la molestia ocular, particularmente en pacientes con ojo seco y molestias relacionadas con el uso de lentes de contacto. Las principales ventajas de esta técnica son que es relativamente sencilla, rápida, mínimamente invasiva y puede utilizarse para evaluar los efectos de la fricción sobre las células epiteliales oculares.Comience por retirar los insertos de membrana de su envase. Utilizando un marcador permanente, etiquete los insertos para cada párpado que se va a muestrear, marcando la orientación de la recolección celular en el lado del soporte de plástico de la membrana. A continuación, administre una gota de anestésico tópico en el saco conjuntival inferior de cada ojo e indique al participante que mantenga ambos ojos cerrados durante un minuto.A continuación, evertir un párpado superior por las pestañas, evitando el contacto con el margen del párpado, y aplicar suavemente la membrana de inserción perpendicularmente sobre la par

impression-cytology-of-the-lid-wiper-area

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El protocolo descrito aquí es para la evaluación estructural de una preparación de retina de montaje completo. Esto incluye descripciones de la disección de tejidos, el montaje en un inserto de membrana de politetrafluoroetileno (PTFE) hidrofilizado, la carga en bolo con marcadores fluorescentes y una comparación de la fijación con carbodiimida y paraformaldehído para el análisis inmunohistoquímico de componentes celulares y sinápticos.

Protocolo optimizado para Retina Preparación Wholemount de la Imagen y la inmunohistoquímica

El uso de contraste de interferencia diferencial (DIC) de microscopía de alta resolución, una observación ex vivo de la paliza de los cilios ependymal móviles ubicada dentro de los ventrículos cerebrales de ratones se demostró por imágenes en vivo. La técnica permite una grabación de la frecuencia de latido ciliar único y ángulo superando así como sus propiedades de estimulación de oscilación de calcio intracelular.

Imágenes en vivo de la ependimarios cilios en los ventrículos laterales del cerebro del ratón

En este estudio, se optimizó una técnica detallada de microscopía óptica para la observación y el análisis en tiempo real del movimiento de los cilios CPEC ex vivo junto con un método de microscopía electrónica para el análisis ultraestructural.

Observación del Movimiento ciliar de las células epiteliales del plexo coroideo<em&gt; Ex Vivo</em

La superficie ocular normal expuesta consiste en córnea y conjuntiva. Las células epiteliales, las células caliciformes y las células inmunes están presentes en la conjuntiva. Aquí, se describe una técnica no invasiva de citología de impresión usando un dispositivo de citología de impresión y citometría de flujo para analizar células inmunes en la conjuntiva.

Una forma no invasiva de aislar y células fenotípicas de la conjuntiva

Para garantizar un análisis funcional ciliar exitoso y de alta calidad para el diagnóstico de PCD, es esencial un método preciso y cuidadoso para el muestreo y procesamiento del epitelio respiratorio. Para continuar brindando el servicio de diagnóstico de PCD durante la pandemia de COVID-19, el protocolo de videomicroscopía ciliar se ha actualizado para incluir medidas adecuadas de control de infecciones.

Muestreo y procesamiento del cepillado nasal mediante videomicroscopía ciliar digital de alta velocidad: adaptación para la pandemia de COVID-19

La inflamación de la superficie ocular daña los tejidos de la superficie ocular y compromete las funciones vitales del ojo. El presente protocolo describe un método para inducir inflamación ocular y recolectar tejidos comprometidos en un modelo de ratón de disfunción de la glándula de Meibomio (MGD).

Inducción de la inflamación de la superficie ocular y recolección de tejidos afectados

Este artículo presenta un protocolo para la microdisección ocular en roedores. El proceso implica la enucleación del globo ocular junto con la membrana nictitante (es decir, el tercer párpado). Esto es seguido por la separación de las copas oculares posterior y anterior.

Microdisección del ojo de roedor

Este protocolo describe métodos para preparar células periféricas, maduras y nucleares de fibras del cristalino ocular para la tinción de inmunofluorescencia con el fin de estudiar las complejas interdigitaciones de célula a célula y la arquitectura de la membrana.

Preparación y tinción por inmunofluorescencia de haces y células de fibra única de la corteza y el núcleo del cristalino del ojo

Los protocolos actuales describen nuevas imágenes de montaje completo para la visualización de estructuras periféricas en el cristalino ocular con métodos para la cuantificación de imágenes. Estos protocolos se pueden utilizar en estudios para comprender mejor la relación entre las estructuras a microescala del cristalino y el desarrollo/función del cristalino.

Imágenes de montura completa para visualizar y cuantificar la estructura, la morfología y la organización de las lentes periféricas

En este trabajo se presenta un protocolo para la recolección y procesamiento de la biopsia conjuntival para identificar el penfigoide de la membrana mucosa.

Técnica de biopsia conjuntival e inmunofluorescencia directa para el diagnóstico de penfigoide de mucosa

Este artículo demuestra el funcionamiento y el efecto de la microscopía confocal in vivo en el diagnóstico y tratamiento del ojo seco e investiga la aplicación y los resultados de la microscopía confocal in vivo para proporcionar una base para futuras investigaciones.

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