Los ensayos basados ​​en la microscopía para la selección de alto rendimiento de los factores del huésped que participan en

El objetivo general de este ensayo basado en microscopía de alto rendimiento es identificar factores del huésped implicados en la infección de células HeLa por Brucella. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la interacción huésped-patógeno, como la identificación de proteínas del huésped que promuevan o impidan la colonización por el patógeno intracelular Brucella. La principal ventaja de esta técnica es que el flujo de trabajo semiautomatizado, desde el laboratorio de detección hasta el análisis de imágenes, permite el uso de robots y la realización eficiente de experimentos de alto rendimiento.

Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre las interacciones huésped-Brucella mediante el uso de cribados con ARNip. La mayor parte del protocolo puede aplicarse a otras estrategias de cribado. Por ejemplo, o bibliotecas de ARNip.

Después de cultivar células HeLa y preparar placas de tamizaje con siARN según el protocolo descrito, descongele una placa negra de 384 pocillos mediante centrifugación a 300 ×g y temperatura ambiente durante 20 minutos. Prepare el medio de transfección utilizando DMEM a temperatura ambiente sin FCS. Diluya el reactivo de transfección uno a 200 y mezcle cuidadosamente antes de usar.

Utilizando un dispensador de reactivos, agregue 25 microlitros de medio de transfección a cada pocillo de la placa de 384 pocillos y mezcle las soluciones moviendo la placa hacia adelante y hacia atrás. Incube la placa a temperatura ambiente durante una hora para permitir la formación de los complejos del reactivo de transfección con el siRNA. Mientras tanto, prepare las células HeLa aspirando el medio de cultivo y agregando 2,5 mililitros de tripsina 0,05 % EDTA en PBS para lavar una vez las células subconfluentes de un matraz de 75 centímetros cuadrados.

Luego, agregue 1,5 mililitros de tripsina fresca y transfiera el matraz a 37 grados Celsius durante dos a tres minutos hasta que las células adquieran forma redondeada. Use 10 mililitros de DMEM precalentado al 60 % FCS para resuspender las células. A continuación, utilice un contador automático de células para contarlas antes de preparar una suspensión celular de 10.000 células por mililitro en DMEM con 16 % FCS.

Añada 50 microlitros de suspensión celular a cada pocillo del reactivo de transfección. Esto da como resultado 500 células por pocillo. Mueva la placa hacia adelante y hacia atrás para distribuir uniformemente las células.

Luego, deje la placa a temperatura ambiente durante cinco a 10 minutos para permitir que las células se asienten. Use parafilm para sellar la placa. E incúbela en un incubador húmedo sobre una placa de aluminio precalentada a 37 grados Celsius con 5% C02 durante 72 horas.

Trabajar con el patógeno de clase tres B. abortus es peligroso y es necesario seguir las regulaciones locales de bioseguridad, que incluyen el uso de una bata protectora, guantes protectores, mascarilla y gafas de seguridad. Un día antes de la infección, inocule la cantidad previamente determinada de cultivo inicial de B. abortus en 50 mililitros de medio TSB KM. En un frasco de 250 mililitros con tapón roscado.

Use parafilm para sellar la botella y cultive las bacterias durante la noche a 37 grados Celsius y 100 RPM en un agitador hasta alcanzar una densidad óptica de 600 entre 0,8 y 1,1. Mida la densidad óptica a 600 nm de la cultura bacteriana y prepare el medio de infección diluyendo la cultura bacteriana en DMEM con 10 % FCS para alcanzar la multiplicidad de infección deseada.

O bien, MOI. Mediante un lavador automático de placas, cambie el medio de transfección por 50 microlitros de medio de infección. Dentro de la cabina de flujo laminar, transfiera la placa al rotor del centrífugo y centrifugue la placa de 384 pocillos a 400 × g y 4 °C durante 20 minutos.

Luego, utilice parafilm para sellar la placa e incubarla sobre una placa de aluminio precalentada a 37 grados Celsius y 5% de CO2 durante cuatro horas. Después de la incubación, con el lavador automático de placas, use DMEM con 10% de FCS que contenga 100 microgramos por mililitro de dentrimysen o GM para lavar las células y así inactivar las bacterias extracelulares. A continuación, use parafilm para sellar la placa y colóquela nuevamente sobre la placa de aluminio precalentada dentro del incubador durante otras 40 horas para el ensayo del punto final.

Para fijar las células, primero use PBS para lavar los pocillos. Luego, reemplace el PBS con 50 microlitros de PFA al 3,7 % en 2 a pH 7,4.

Y incubar las células a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después de la incubación, usar 50 microlitros de PBS para cambiar el medio de fijación. Para teñir las muestras con el lavador automático de placas, comenzar usando 50 microlitros de Triton X-100 al 1% en PBS durante 10 minutos para permeabilizar las células.

Después de lavar las células tres veces con PBS, añada 50 microlitros de PBS con un microgramo por mililitro de DAPI e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, lave las células tres veces con PBS antes de protegerlas de la luz. Transfiera la placa al microscopio automatizado.

Configure los parámetros del microscopio. Seleccione el objetivo de 10-X. Luego seleccione el formato de placa correspondiente a la placa de 384 pocillos.

Adquiera nueve sitios por pocillo. Seleccione Habilitar enfoque basado en láser. Y, enfoque en el fondo de la placa y del pocillo.

A continuación, establezca el primer pocillo adquirido como el pocillo inicial para encontrar la muestra y todos los sitios para el enfoque automático por sitio. A continuación, para el canal DAPI, ajuste manualmente el desplazamiento Z para el enfoque. Luego, presione Encontrar muestra para establecer el enfoque en el fondo del pocillo.

Mediante la función de exposición automática, obtenga una buena estimación del tiempo de exposición. Corrija manualmente el tiempo de exposición para el canal DAPI para garantizar un rango dinámico amplio con baja sobreexposición. Utilice este tiempo de exposición para obtener imágenes de varios sitios a lo largo de la placa.

Y ajuste manualmente el tiempo de exposición hasta que los píxeles más brillantes alcancen aproximadamente el 80 % del brillo máximo en los sitios. Repita los pasos para ajustar el enfoque y el tiempo de exposición, según corresponda, para todos los demás canales. Luego, inicie la adquisición de toda la placa.

Para el ensayo de punto final, utilice los canales DAPI y GFP para obtener imágenes de toda la placa. Para realizar un análisis de imágenes en las células teñidas en el ensayo de punto final, después de calcular un modelo de sombreado, según el protocolo descrito en Configuración de visualización de resultados, seleccione la carpeta de entrada que contiene las imágenes y una carpeta de salida para los resultados. A continuación, defina el texto que tienen en común las imágenes y cargue los modelos de sombreado.

Haga clic en Iniciar modo de prueba y asegúrese de que la pausa y la configuración de visualización para todos los módulos estén desactivadas. Active la configuración de pausa y visualización para el módulo nueve ImageMath. El símbolo de pausa activado aparecerá en amarillo.

La función de visualización habilitada aparecerá como un ojo abierto. A continuación, haga clic en Ejecutar para realizar el análisis hasta el módulo nueve. En el módulo nueve, ajuste el parámetro multiplicar la segunda imagen por a un valor que suprima la señal de DAPI en Brucella sin suprimir los núcleos.

Para probar los valores del módulo, presione Paso. Haga clic derecho sobre la imagen recién abierta y establezca el contraste de la imagen en normalizado logarítmicamente. Repetidamente, retroceda al módulo nueve.

Ajuste el parámetro por el cual se multiplica la segunda imagen y repita el proceso en el módulo hasta que la señal de Brucella esté completamente suprimida, al mismo tiempo que se minimicen las áreas negras que indican una sobrestracción. Encontrar buenos parámetros para ciertos módulos requiere optimizar gradualmente dichos parámetros. Es definitivamente importante repetir varias veces el proceso en los módulos, probando diferentes valores y observando el efecto sobre el resultado mostrado.

Habilite la pausa y la visualización para el módulo 10. Identifique los objetos primarios. Establezca el límite inferior del umbral lo suficientemente alto como para que se segmenten los núcleos y se ignore el fondo.

Para identificar un buen valor del paso, pase el cursor sobre el módulo, haga clic derecho en la imagen de entrada y muestre el histograma, donde el pico generalmente indica el fondo. A partir de la intensidad del fondo, aumente el parámetro hasta lograr una buena segmentación de los núcleos, como se muestra en la imagen de salida. El objetivo de la canalización de análisis de imágenes es identificar células que contengan bacterias en replicación.

Esto se logra estableciendo diferentes umbrales para la señal del patógeno en el núcleo, el perinúcleo y el cuerpo celular de Voronoi. Active la pausa y la visualización para el módulo 15. Filtre los objetos, como se mostró anteriormente, y presione Ejecutar.

Establezca el valor mínimo del parámetro lo suficientemente alto para que solo se conserven las células con Brucella claramente visible en el núcleo, y todas las demás sean filtradas. Para identificar un buen valor, recorra el módulo y muestre la imagen resultante. Aumente el valor progresivamente hasta que solo se mantengan las células con Brucella claramente visible en el núcleo.

Después de filtrar las células con bacterias en el perinúcleo y el cuerpo celular de Voronoi en los módulos 16 y 17 según el protocolo descrito, salga del modo de prueba y desactive todos los símbolos de ojo junto a los módulos para asegurarse de que ninguno de los módulos muestre su visualización antes de ejecutar el análisis completo. Finalmente, presione Analizar imágenes para iniciar el análisis. Una vez finalizado el análisis, revise las imágenes PNG resultantes así como la hoja de cálculo CSV para verificar que el análisis funcionó de forma confiable en toda la placa.

Realice el ensayo de entrada y la puntuación de infección según el protocolo descrito en el texto. Esta figura muestra un ejemplo de análisis de imagen utilizado para identificar automáticamente las células infectadas en el ensayo de punto final. Se identificaron los núcleos de células HeLa teñidos con DAPI.

Un perinúcleo de ocho píxeles de ancho que rodea el núcleo. Y un cuerpo celular de Voronoi mediante la extensión del núcleo, en 25 píxeles, fueron calculados. Se consideró que una célula estaba infectada si la señal del patógeno superaba el umbral correspondiente en al menos un compartimento.

Brucella requiere reordenamientos del citoesqueleto de actina para una exitosa interacción con las células hospedadoras. Por lo tanto, el agotamiento de ARP23 es un control positivo adecuado para la selección mediante ARNip. La reducción de ARPC3 disminuyó el número de células con bacterias en proliferación dos días después de la infección.

En comparación con las células de control tratadas con secuencia aleatoria. El análisis automatizado de imágenes observó cuantitativamente una disminución en la infección de células HeLa agotadas para ARPC3 en comparación con las células de control en este gráfico. El agotamiento de ARPC3 también mostró una reducción en la infección por Brucella en el ensayo de entrada en comparación con las células de control.

Como se observa por el número reducido de Brucella intracelular representado en amarillo. Finalmente, la cuantificación de la infección mediante análisis automatizado de imágenes confirmó que el número de células infectadas, así como el número de bacterias intracelulares en las células infectadas, se redujo tras el agotamiento de ARPC3. Una vez dominado, este protocolo puede proporcionar resultados del análisis de imágenes en aproximadamente una semana y media después de iniciar el experimento.

Al intentar este procedimiento, es importante revisar cuidadosamente los resultados del análisis de imágenes para asegurarse de que los parámetros elegidos funcionen adecuadamente en toda la placa. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la imagenología de células vivas, con el fin de responder preguntas adicionales, por ejemplo, cuándo un determinado factor del huésped interactúa con Brucella durante el tráfico.

O cómo el agotamiento de un gen afecta la dinámica intracelular de la infección. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología de infecciones exploraran los factores del huésped necesarios para la infección por Brucella en un ensayo con células HeLa. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar los factores del huésped que promueven o previenen la colonización exitosa de células HeLa por el patógeno intracelular Brucella abortus.

No olvide que trabajar con Brucella abortus puede ser extremadamente peligroso y que deben seguirse estrictamente las regulaciones locales de bioseguridad.