Los ensayos basados ​​en la microscopía para la selección de alto rendimiento de los factores del huésped que participan en Brucella Infección de células Hela

El objetivo general de este ensayo basado en microscopía de alto rendimiento es identificar los factores del huésped implicados en la infección por Brucella de las células HeLa. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la interacción huésped-patógeno, como la identificación de proteínas del huésped que promueven o previenen la colonización por el patógeno intracelular Brucella. La principal ventaja de esta técnica es que el flujo de trabajo semiautomatizado desde el laboratorio veterinario hasta el análisis de imágenes permite que los robots y los eficientes y de alto rendimiento creen experimentos.

Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre las interacciones del huésped de Brucella mediante cribados de siRNA. La mayor parte del protocolo se puede aplicar a otras estrategias de detección. Por ejemplo, o bibliotecas de siRNA.

Después de cultivar células HeLa y preparar placas de cribado con siRNAs de acuerdo con el protocolo de texto, descongele una placa negra de 384 pocillos por centrifugación a 300 veces G y temperatura ambiente durante 20 minutos. Prepare el medio de transfección utilizando dmem a temperatura ambiente sin FCS. Para diluir el reactivo de transfección de uno a 200 y mezclar cuidadosamente antes de usar.

Usando un dispensador de reactivos, agregue 25 microlitros de medio de transfección a cada pocillo de la placa de 384 pocillos y mezcle las soluciones moviendo la placa hacia adelante y hacia atrás. Incubar la placa a temperatura ambiente durante una hora para permitir la formación del complejo de reactivos de transfección de siRNA. Mientras tanto, prepare las células HeLa aspirando el medio de cultivo y añadiendo 2,5 mililitros de EDTA al 0,05% de tripsina en PBS para lavar una vez las células subconfluentes de un matraz de 75 centímetros cuadrados.

A continuación, añada 1,5 mililitros de tripsina fresca y transfiera el matraz a 37 grados centígrados durante dos o tres minutos hasta que las células se redondeen. Utilice 10 mililitros de dmem 60%FCS precalentado para resuspender las células. A continuación, utilice un contador de células automatizado para contar las células antes de preparar una suspensión celular de 10.000 células por mililitro en dmem con 16% de FCS.

Agregue 50 microlitros de suspensión celular a cada pocillo de reactivo de transfección. El resultado es de 500 celdas por pozo. Mueva la placa hacia adelante y hacia atrás para distribuir uniformemente las celdas.

Luego, deje la placa a temperatura ambiente durante cinco a 10 minutos para permitir que las células se asienten. Utilice parafilm para sellar la placa. E incubarlo en una incubadora húmeda sobre una placa de aluminio precalentada a 37 grados centígrados con 5%C02 durante 72 horas.

Trabajar con el patógeno de clase tres B. abortus es peligroso y se deben seguir las normas locales de bioseguridad, que incluyen el uso de un traje protector general, guantes protectores, mascarilla y gafas. Un día, antes de la infección, inocular la cantidad previamente determinada de cultivo iniciador de B. abortus en 50 mililitros de medio TSB KM. En una botella de rosca de 250 mililitros.

Use parafilm para sellar la botella y cultivar bacterias durante la noche a 37 grados Celsius y 100 RPM en un agitador a una densidad óptica de 600.8 a 1.1. Mida la densidad óptica 600 del cultivo bacteriano. Y prepare el medio de infección diluyendo el cultivo bacteriano en dmem 10%FCS para lograr la multiplicidad deseada de infección.

O bien, MOI. Utilizando un lavador de placas automatizado, cambie el medio de transfección con 50 microlitros de medio de infección. Dentro de la campana, transfiera la placa a la jaula de centrífuga y centrifugue la placa de 384 pocillos a 400 veces G y cuatro grados Celsius durante 20 minutos.

Luego, use parafilm para sellar la placa e incubarla en una placa de aluminio precalentada a 37 grados Celsius y 5% C02 durante cuatro horas. Después de la incubación con el lavador de placas automatizado, use dmem con 10%FCS que contenga 100 microgramos por mililitro de dentrimysen o GM para lavar las células e inactivar las bacterias extracelulares. A continuación, utilice el parafilm para sellar la placa y vuelva a colocarla en la placa de aluminio precalentada de la incubadora durante otras 40 horas para el ensayo de punto final.

Para arreglar las celdas, primero use PBS para lavar los pozos. A continuación, cambie el PBS por 50 microlitros de PFA al 3,7%. En 2 a pH 7.4.

E incubar las células a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después de la incubación, use 50 microlitros de PBS para intercambiar el medio de fijación. Para teñir las muestras con el lavador de placas automatizado, comience utilizando 50 microlitros de Triton X-100 al 1% en PBS durante 10 minutos para permeabilizar las células.

Después de usar PBS para lavar las células tres veces, agregue 50 microlitros de PBS con un microgramo por mililitro de DAPI e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego, use PBS para lavar las celdas tres veces antes de protegerlas de la luz. Transfiera la placa al microscopio automatizado.

Configure los parámetros del microscopio. Seleccione el subjetivo 10-X. A continuación, seleccione el formato de placa correspondiente a la placa de 384 pocillos.

Adquirir nueve sitios por pozo. Seleccione Habilitar enfoque basado en láser. Y concéntrese en el plato y el fondo del pozo.

A continuación, establezca el primer pozo adquirido como el pozo inicial para encontrar la muestra y todos los sitios para el enfoque automático del sitio. A continuación, para el canal DAPI, ajuste manualmente el desplazamiento Z para el enfoque. A continuación, pulse Buscar muestra para establecer el foco en el fondo del pozo.

Usando la función Autoexposición, obtenga una buena estimación del tiempo de exposición. Corrija manualmente el tiempo de exposición del canal DAPI para garantizar un amplio rango dinámico con baja sobreexposición. Utilice este tiempo de exposición para obtener imágenes de varios sitios a lo largo de la placa.

Y ajuste el tiempo de exposición manualmente hasta que los píxeles más brillantes alcancen aproximadamente el 80% del brillo máximo de los sitios. Repita los pasos para establecer el enfoque y el tiempo de exposición, en consecuencia para todos los demás canales. A continuación, inicie la adquisición de la placa completa.

Para el ensayo de punto final, utilice los canales DAPI y GFP para obtener imágenes de la placa completa. Para ejecutar un análisis de imagen en células teñidas en el ensayo de punto final, después de calcular un modelo de sombreado, de acuerdo con el protocolo de texto, en Ver configuración de salida, seleccione la carpeta de entrada con las imágenes y una carpeta de salida con los resultados. A continuación, defina el texto que las imágenes tienen en común y cargue los modelos de sombreado.

Haga clic en Iniciar modo de prueba y asegúrese de que la configuración de pausa y visualización de todos los módulos esté deshabilitada. Habilite la configuración de pausa y visualización para el módulo nueve ImageMath. El símbolo de pausa habilitado aparecerá en amarillo.

La función de visualización habilitada aparecerá como un ojo abierto. A continuación, haga clic en Ejecutar para ejecutar el análisis hasta el módulo nueve. En el módulo nueve, ajuste el parámetro multiplique la segunda imagen por un valor que suprima la señal DAPI en Brucella sin suprimir los núcleos.

Para probar los valores del módulo, presione Paso. Haga clic con el botón derecho en la imagen recién abierta y establezca el contraste de la imagen en registro normalizado. Repetidamente, retroceda al módulo nueve.

Ajuste el parámetro, multiplique la segunda imagen por y vuelva a pasar por encima del módulo hasta que la señal de Brucella se suprima por completo, mientras que al mismo tiempo se minimizan las áreas negras que indican una sustracción excesiva. Encontrar buenos parámetros para ciertos módulos requiere optimizar gradualmente los parámetros. Definitivamente es importante pasar repetidamente por encima de los módulos, probando diferentes valores y observar el efecto en el resultado mostrado.

Habilite la pausa y la visualización para el módulo 10. Identificar los objetos primarios. Establezca el parámetro límite inferior en el umbral, lo suficientemente alto como para que los núcleos se segmenten y se ignore el fondo.

Para identificar un buen valor, pase por encima del módulo y, a continuación, haga clic con el botón derecho en la imagen de entrada y muestre el histograma donde el pico suele indicar el fondo. A partir de la intensidad de fondo, aumente el parámetro hasta lograr la buena segmentación de los núcleos como se muestra en la imagen de salida. El objetivo de la línea de análisis de imágenes es identificar las células que contienen bacterias replicantes.

Esto se logra estableciendo diferentes umbrales para la señal del patógeno en el núcleo, el perinúcleo y el cuerpo de la célula de Voronoi. Habilite la pausa y la visualización para el módulo 15. Filtre los objetos, como se muestra antes, y presione Ejecutar.

Establezca el valor mínimo del parámetro lo suficientemente alto para que solo se conserven las células con Brucella claramente visible en el núcleo y se filtren todas las demás. Para identificar un buen valor, pase por encima del módulo y muestre la imagen de salida. Aumente el valor paso a paso hasta que solo se mantengan las células con Brucella claramente visible en el núcleo.

Después de filtrar las células con bacterias en el perinúcleo y el cuerpo de la célula de Voronoi en los módulos 16 y 17 de acuerdo con el protocolo de texto, salga del modo de prueba y desmarque todos los símbolos de ojo junto a los módulos para asegurarse de que ninguno de los módulos muestre su visualización antes de ejecutar el análisis completo. Finalmente, presione Analizar imágenes para iniciar el análisis. Cuando haya finalizado el análisis, inspeccione las imágenes PNG resultantes, así como la hoja de cálculo CSV, para asegurarse de que el análisis funcionó de manera confiable en toda la placa.

Realice el ensayo de entrada y la puntuación de infección de acuerdo con el protocolo de texto. Esta figura muestra un ejemplo de análisis de imágenes utilizado para identificar automáticamente las células infectadas en el ensayo de punto final. Se identificaron los núcleos de células HeLa teñidas con DAPI.

Un perinúcleo de ocho píxeles de ancho que rodea el núcleo. Y se calculó un cuerpo celular de Voronoi por extensión del núcleo, en 25 píxeles. Se consideraba que una célula estaba infectada si la señal del patógeno superaba el umbral correspondiente en al menos un compartimento.

Brucella requiere reordenamientos actuantes para el acoplamiento exitoso de las células huésped. Por lo tanto, la depleción de ARP23 es un control positivo adecuado para el cribado de siRNA. La depleción de ARPC3 redujo el número de células con bacterias proliferantes dos días después de la infección.

En comparación con las células controladas tratadas revueltas. El análisis automatizado de imágenes observó cuantificablemente una disminución en la infección de las células HeLa agotadas por ARPC3 en comparación con las células controladas en este gráfico. La depleción de ARPC3 también mostró una reducción de la infección por Brucella en el ensayo de entrada en comparación con las células controladas.

Como se ve por el número reducido de Brucella intracelular representada en amarillo. Finalmente, la cuantificación de la infección mediante análisis automatizado de imágenes confirmó que el número de células infectadas, así como el número de bacterias intracelulares en las células infectadas, se redujo por el agotamiento de ARPC3. Una vez dominado, este protocolo puede dar resultados de análisis de imágenes dentro de una semana y media después de comenzar el experimento.

Al intentar este procedimiento, es importante revisar cuidadosamente los resultados del análisis de la imagen para asegurarse de que los parámetros elegidos funcionen bien en toda la placa. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la obtención de imágenes de células vivas, para responder a preguntas adicionales. Al igual que cuando estás traficando, un determinado factor de host interactúa con Brucella.

O cómo el agotamiento de un gen afecta la dinámica intracelular de la infección. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología de la infección exploraran los factores del huésped necesarios para la infección por Brucella en un ensayo de células HeLa. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar los factores del huésped que promueven, o previenen, la colonización exitosa de las células HeLa por el patógeno intracelular Brucella abortus.

No olvide que trabajar con Brucella abortus puede ser extremadamente peligroso y se deben seguir estrictamente las normas locales de bioseguridad.