Name: Química húmeda y el péptido Inmovilización de politetrafluoroetileno para la adhesión celular mejorada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Aprende a modificar superficies de PTFE mediante química húmeda para mejorar la adhesión celular en aplicaciones biomédicas. Este método simplificado requiere equipo mínimo y mejora la biocompatibilidad de polímeros médicos.

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Los autores desean agradecer la ayuda de Walter Scholdei (Instituto Max-Planck para la Investigación de Polímeros, Maguncia, Alemania.

1. Preparación de sodio solución activadora naftalenuro y activación de superficies Nota: Llevar a cabo las reacciones en una campana extractora bien ventilada. Seguir las reglas generales para la manipulación de disolventes altamente inflamables y corrosivos metales como el sodio metálico. Naftaleno tiene un olor muy desagradable (naftalina), incluso en cantidades muy pequeñas! Si no se indica lo contrario las reacciones se realizaron a temperatura ambiente. La azida de sodio es altamente tóxico! THF (99,9%, ver Lista de Materiales) se almacenó durante aproximadamente 20% (en volumen) de tamiz molecular. Se destila THF con un contenido de agua notable sobre sodio. La formación de naftalenuro sódico no se produce si trazas de agua están presentes. <ol><li> A una solución de 1,4 g (10,9 mmol) de naftaleno en 20 ml de tetrahidrofurano (THF, se secó sobre tamiz molecular 3 Å), añadir 0,25 g (10,9 mmol) de sodio metálico en una botella de vidrio de 100 ml con tapón de rosca equipado con un PTFE recubierto barra de agitación magnética. Nota: Dissolución se puede mejorar en gran medida mediante la reducción de las sales de sodio en trozos pequeños y calefacción modestos (35 - 40 ° C). La solución final tiene un color oscuro, ligeramente verdoso y se puede almacenar en condiciones estrictamente secas. </li><li> Perforar discos de PTFE de 12 mm de diámetro a partir de material de aluminio de espesor 0,5 mm. Marcar un lado (por ejemplo, mediante una carta punzón sello) y limpio con iso-propanol. </li><li> Incubar PTFE muestras individualmente en la solución de activación (paso 1.1) para el 1 - 2 min utilizando fórceps. Nota: El cambio de color de blanco a marrón oscuro indica un tratamiento exitoso. </li><li> Posteriormente enjuagar dos veces con THF y después con iso-propanol. Nota: La solución naftalenuro se agota cuando su color cambia a un color marrón claro acuosa. naftalenuro solución no utilizada (que posiblemente contiene sodio metálico) tiene que ser descompuesto por adición lenta de iso-propanol antes de su eliminación. </li><li> Oxidar las muestras tratadas en peróxido de hidrógeno (30%) que contiene 20% (w / v) de ácido tricloroacético durante 3 h. lavarcon agua y secar. La superficie tiene ahora una ligera apariencia de color marrón. Nota: La activación y el resultado de oxidación en un incrementado drásticamente humectabilidad de la superficie. Este hallazgo fue examinado en detalle previamente 14. </li><li> El tratamiento de discos oxidados con 50% (v / v) hexametilendiisocianato (HMDI) en THF seco durante 2 horas, enjuague con THF y dejar secar. </li><li> Hidrolizar muestras portadores de grupos isocianato en agua durante 2 - 3 horas y se seca. Nota: La superficie de PTFE amino-funcionalizado final es mucho más estable que las muestras de soporte de isocianato y es compatible con muchos agentes de reticulación estándar para acoplamiento adicional. </li></ol> 2. Péptido Inmovilización <ol><li> Preparar una solución de 20% (v / v) de éter de dietilenglicol diglicidil (diepóxido) en 50 mM de tampón carbonato, pH 9. </li><li> Coloque los discos aminados con el lado marcado de forma individual en una placa de 24 pocillos y añadir 1,5 ml de la solución de epóxido. Garantizar la cobertura total de las muestras. Incubar durante 2 horas y se lava dosveces con agua y una vez con tampón de carbonato. </li><li> Añadir 50 l de un 0,5 mg / ml de péptido (por ejemplo, REDV) en 50 mM de tampón carbonato, pH 9 que contiene 0,01% NaN 3, a la parte inferior de los pocillos individuales de una placa fresca 24 y se coloca cuidadosamente la epoxi-funcionalizado discos al revés -down (es decir, marcado de cara abajo) en la gota de la solución de péptido. Asegúrese de que el espacio entre el fondo del pozo y el disco de PTFE está completamente humectada debido a la acción capilar. </li><li> Incubar en una cámara húmeda (por ejemplo, cualquier caja de plástico sellable con una tapa de cierre hermético) con atmósfera humidificada (mediante la colocación de papel de seda húmedo en la parte inferior) durante al menos 3 horas o durante la noche. Nota: Aunque el motivo REDV puede ser considerado como bien caracterizado, una secuencia de aminoácidos codificada o inversa puede ser incluido como un control negativo adicional. </li><li> Lavar tres veces con agua y esterilizar en 50% iso-propanol / agua durante al menos 30 min. Antes de la siembra de células, Rinse las muestras en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). </li></ol> 3. La siembra de la célula <ol><li> Crecer HUVEC utilizando procedimientos estándar de cultivo celular 17,18. </li><li> Colocar las muestras de péptido conjugado con el lado modificado en unas placas de 24 pocillos. Utilice discos de PTFE sin tratar como control. </li><li> Semilla de 5 x 10 4 HUVEC en 2 ml de medio por pocillo y se incuba durante 4 horas a 37 ° C y 5% de CO2 en una incubadora. </li><li> Retire los discos, enjuagar cuidadosamente para eliminar las células no fijadas y la transferencia a una placa de 24 fresca. Añadir 2 ml de medio fresco y se incuba durante el periodo deseado (por ejemplo, 24 horas, 1 w, etc.). Cambio de medio cada dos días. </li><li> Preparar una solución madre de 1 mg / ml de calceína-AM en sulfóxido de dimetilo (DMSO). </li><li> Después de crecer las células eliminar el medio, se lavan con PBS y se añaden PBS que contiene 1 l / ml mancha calceína-AM (por ejemplo, 1 l de una solución madre por ml PBS). agitar y incubat suavementeE a 37 ° C durante 45 minutos en la oscuridad. </li><li> Lavar con PBS e inmediatamente tomar micrografías en un microscopio de fluorescencia equipado con filtros de FITC estándar (Ex 488 nm, Em 515 nm). Utilice amplificación de 100 veces. Realizar triplicados de no modificado, así como las muestras tratadas. </li><li> El uso de software ImageJ determinar el área colonizado por las células. Alternativamente contar las células manualmente o utilizar ImageJ. Ambos métodos darán información similar acerca de la unión y el crecimiento de las células en las superficies respectivas. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La descripción detallada del protocolo de modificación de la superficie de PTFE consiste en etapas sucesivas empezando con la eliminación de flúor de la cadena principal de polímero tal como se representa en la Figura 6. Como resultado, se forma una capa que contiene una abundante cantidad de dobles enlaces carbono-carbono conjugados en de acuerdo con el color de color marrón oscuro que se desarrolló en el tratamiento naftalenuro. oxidación estándar con peróxido de hidrógeno ácido produce una superficie...

Varios polímeros utilizados en la medicina que han sido aprobados por algún tiempo no exhiben una mayor biocompatibilidad, es decir, la falta de células adhesividad, la inducción de la encapsulación fibrótica y la trombogenicidad, por mencionar unos pocos. Las interacciones entre el biomaterial y el sistema biológico se lleva a cabo principalmente en la superficie del implante. Como consecuencia, la investigación se ha centrado en la modificación de superficie con el fin de crear propiedades adecuadas para una aplicación deseada, dejando las propiedades a granel del material no modificado. Politetrafluoroetileno (PTFE) como un polímero fisiológicamente inerte se utiliza en muchos campos de la medicina, tales como hernia de malla quirúrgica 1, los puertos médicos 2 y, lo más importante, los injertos vasculares 3. Especialmente en situaciones de contacto con la sangre la naturaleza hidrófoba de PTFE hace que la adsorción no específica de los componentes del plasma y, como consecuencia de adhesión de plaquetas, resultando a menudo en thrombotic acontecimientos y la oclusión del injerto 4. Además, PTFE, como la mayoría de los polímeros, no es compatible con la adhesión celular y la cobertura de lo que sería una característica deseable para inducir la formación de una capa beneficioso de las células endoteliales (EC) en la superficie interna (luminal) del injerto vascular 5. Se espera que un endotelio biomimético para cumplir muchas de las funciones de su equivalente natural, en particular sus propiedades antitrombogénicas 6. Una estrategia general modificación biomimético se basa en el concepto de dotar exclusivamente el material con células adhesividad mientras que deja las propiedades materiales a granel no afectado. Además, la adhesión de plaquetas se puede reducir mediante la incorporación de anti-adhesivo (antifouling) atributos de 7. Varios péptidos - en su mayoría derivados de proteínas de la matriz extracelular - se han descrito que mejoran fuertemente de adhesión celular mediante la unión a receptores celulares, que pertenece a la clase de integrinas 8. El serejemplo st-conocido en este sentido es el péptido Arg-Gly-Asp (RGD) que interactúa con la mayoría de tipos de células. Otras secuencias de aminoácidos son reconocidos por las integrinas expresadas exclusivamente en células específicas. Por ejemplo, Arg-Glu-Asp-Val (REDV) y Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) se ha encontrado que se unen a ECs de una manera específica 9. La inmovilización covalente de tales péptidos se ha llevado a cabo en una gran variedad de materiales inherentemente no adhesivas, incluyendo metales y polímeros 10,11. PTFE poroso, más precisamente PTFE expandido (ePTFE) - junto con tereftalato de polietileno (PET) - es el material más importante para la producción de injertos vasculares 12. Técnicas físicas establecidas para los tratamientos adecuados, como la modificación de plasma 13 o por métodos fotoquímicos 14, se ven obstaculizados por el hecho de que las estructuras porosas y / o tubulares no son fácilmente tratables dentro de los poros o el lumen respectivamente. química húmedaen PTFE es una tarea difícil debido a la naturaleza altamente inerte del polímero que contiene fluorin-que resiste ataques más químicos 15. En este trabajo se describe un método relativamente fácil para una estrategia de modificación covalente. Adaptado de un procedimiento para hacer bondable PTFE, grupos funcionales fueron creados en la superficie de los materiales que sirven como puntos de anclaje para su posterior conjugación de moléculas biológicamente activas.

<table><tbody><tr><td>Lámina de PTFE 0,5 mm</td><td>Cadillac Plastic&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Péptido REDV</td><td>Genecust</td><td>n/a</td><td>síntesis personalizada >95% de pureza</td></tr><tr><td>iso-propanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34965</td><td></td></tr><tr><td>tetrahidrofurano (THF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>tamiz molecular 3 y Aring;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208574</td><td></td></tr><tr><td>metal sódico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>483745</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>naftaleno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>147141</td><td></td></tr><tr><td>peróxido de hidrógeno 30%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>95321</td><td></td></tr><tr><td>ácido tricloroacético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6399&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>dietilenglicol diglicidil éter</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17741</td><td></td></tr><tr><td>diisocianato de hexametileno (HMDI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52650</td><td></td></tr><tr><td>Calceína-AM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56496</td><td></td></tr><tr><td>bicarbonato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>azida de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>placas de 24 pocillos</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>662 160</td><td></td></tr><tr><td>ATR-FTIR espectrofotómetro Nicolet Magna-IR 850</td><td>&nbsp; Nicolet</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>microscopio de fluorescencia Olympus X-70</td><td>Olympus</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>células endoteliales de la vena humbilical (HUVECs)</td><td>Lonza</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>ePTFE injerto vascular</td><td>Gore</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

química húmeda y el péptido inmovilización de politetrafluoroetileno para la adhesión celular mejorada

Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Dotar a los materiales de superficie con propiedades de células adhesivo es una estrategia común en la investigación de biomateriales e ingeniería de tejidos. Esto es particularmente interesante para los polímeros ya aprobados que tienen un uso de larga data en la medicina debido a que estos materiales son bien caracterizados cuestiones y legales asociados a la introducción de los polímeros recién sintetizados puede ser evitado. Politetrafluoroetileno (PTFE) es uno de los materiales más frecuentemente empleado para la fabricación de injertos vasculares pero el polímero carece de adhesión celular promover características. Endotelización, es decir, la cobertura completa de los injertos de la superficie interior con una capa confluente de células endoteliales se considera clave para el rendimiento óptimo, principalmente mediante la reducción de la trombogenicidad de la interfaz artificial. Este estudio investiga el crecimiento de células endoteliales en PTFE péptido modificado y compara estos resultados con los obtenidos en el sustrato sin modificar. El acoplamiento con elpéptido adhesivo de células endoteliales Arg-Glu-Asp-Val (REDV) se realiza a través de la activación del polímero que contiene fluorin-usando el reactivo naftalenuro sódico, seguido de pasos Conjugación posteriores. El cultivo celular se realiza utilizando células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs) y un excelente crecimiento celular en el material peptídico inmovilizado se demuestra en un período de dos semanas.

Los resultados de las etapas de reacción químicas cruciales fueron controlados por espectroscopia de IR (Figura 1). La activación inicial con naftalenuro de sodio genera enlaces dobles - y en un grado menor - OH funcionalidades. La señal que indica C = C enlaces desaparecen tras la oxidación, produciendo una superficie de apoyo casi exclusivamente grupos hidroxilo. Análisis de nuevas medidas Conjugación estándar no se muestran aquí. Los cambios de color debido a la activ...

La adhesividad celular es clave para muchos enfoques en la investigación de biomateriales y la ingeniería de tejidos. Se presenta una técnica paso a paso que utiliza química húmeda para la modificación de la superficie del importante polímero PTFE con péptidos.

Química húmeda y el péptido Inmovilización de politetrafluoroetileno para la adhesión celular mejorada

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un tratamiento superficial basado en química húmeda para el polímero de carbono fluorado politetrafluoroetileno, o PTFE. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los biomateriales, como cómo mejorar la biocompatibilidad de los polímeros médicos. La principal ventaja de esta técnica es que requiere un equipo mínimo y que el método es más ampliamente aplicable en comparación con otros métodos. La preparación de la solución de naftalenuro de sodio requiere condiciones estrictamente anhidras. Corte 0,25 gramos de sodio metálico en trozos pequeños para favorecer la disolución. Añada el sodio metálico a una solución de 1,4 gramos de naftaleno en 20 mililitros de tetrahidrofuran en un frasco de vidrio de 100 mililitros con tapón roscado, equipado con una barra magnética revestida de PTFE.Caliente ligeramente la solución para mejorar aún más la disolución. La solución final tiene un color oscuro, ligeramente verdoso, y puede almacenarse en condiciones estrictamente secas. Corte discos de PTFE de 12 milímetros de diámetro a partir de material de lámina de 0,5 milímetros de espesor.Marque un lado y limpie con isopropanol. Incube las muestras de PTFE individualmente en la solución activadora durante uno o dos minutos, utilizando pinzas. El cambio de color de blanco a marrón oscuro indica un tratamiento exitoso.Posteriormente, enjuague dos veces con THF y luego con isopropanol. Oxide las muestras tratadas en peróxido de hidrógeno al 30%, que contiene ácido tricloroacético al 20%, durante tres horas. Lave con agua y seque.La superficie ahora tiene un aspecto ligeramente marrón. Trate los discos oxidados con HMDI al 50 % en THF seco durante dos horas. Luego, enjuague con THF y deje secar.Finalmente, hidrolice las muestras que contienen isocianato en agua durante dos o tres horas y seque. Coloque cada disco aminado con el lado marcado hacia arriba en los pozos individuales de una placa de 24 pozos. Añada 1.5 mililitros de la solución de epóxido, asegurando una cobertura completa de las muestras.Después de incubar durante dos horas, lave dos veces con agua y una vez con tampón de carbonato. En el fondo de los pocillos individuales de una placa nueva de 24 pocillos, agregue 50 microlitros de péptido al 0,5 miligramo por mililitro y tampón de carbonato 50 milimolar, pH 9, que contenga azida sódica al 0,1%. Coloque cuidadosamente los discos funcionalizados con epoxi boca abajo sobre las gotas de la solución de péptido.Asegúrese de que el espacio entre la parte inferior de un pocillo y el disco de PTFE quede completamente humedecido por acción capilar. Incube la placa durante al menos tres horas, o durante la noche en una cámara húmeda con atmósfera humectada, lograda colocando papel de tejido húmedo en el fondo de la cámara. Tras la incubación, lave tres veces con agua y esterilice en agua con isopropanol al 50 % durante al menos 30 minutos.Antes de sembrar las células, como se describe en el protocolo escrito, enjuague las muestras con solución salina tamponada con fosfato estéril. Los resultados de los pasos cruciales de la reacción química se monitorearon mediante espectroscopía infrarroja. La activación inicial con naftalaminio sódico genera dobles enlaces y, en menor medida, funcionalidades hidroxilo.La señal que indica los enlaces dobles de carbono desaparece tras la oxidación, dando lugar a una superficie que porta casi exclusivamente grupos hidroxilo. Los cambios de color debidos a la activación y oxidación concuerdan con la química esperada. Se espera que los sistemas de enlaces dobles conjugados presenten un color marrón, y la pérdida de estos sistemas de enlaces dobles resulta en un aclarado.Además, se investigó el posible resultado de la activación y oxidación sobre la morfología de la superficie mediante microscopía electrónica de barrido. Prácticamente no se observó ningún efecto perjudicial del tratamiento. La inmovilización del péptido adhesivo para células endoteliales, arginina, glutamina, ácido aspártico valina, sobre la superficie del polímero, favorece el crecimiento de células endoteliales.Mientras que prácticamente no ocurre adhesión ni proliferación celular sobre el material no tratado, la modificación favorece fuertemente la colonización durante un período de dos semanas. Como ejemplo de una aplicación clínica, la modificación se realizó de forma idéntica sobre el material original de un injerto disponible comercialmente, fabricado de politetrafluoroetileno expandido, con resultados similares durante un período de una semana. Una vez dominada, esta técnica requiere aproximadamente 12 horas.Debe tenerse en cuenta que este procedimiento es específico para el PTFE. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo activar la superficie del PTFE y cómo inmovilizar péptidos en los pasos posteriores. Siguiendo este procedimiento, otras moléculas, como polisacáridos o factores de cuerda, pueden inmovilizarse de manera similar.Tenga en cuenta que trabajar con productos químicos altamente tóxicos y corrosivos es peligroso, y que se deben tomar precauciones estándar.

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Bioingeniería

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La electroforesis capilar para supervisar Péptido injerto sobre quitosano películas en tiempo real

Diferentes métodos para manipular arquitectura tridimensional en Hidrogeles basados en proteína se evalúan aquí con respecto a las propiedades del material. Las redes macroporoso son funcionalizadas con un péptido de la célula-adhesivo, y se evalúa su viabilidad en cultivo de células utilizando dos líneas celulares de diferentes modelos.

Fácil manipulación de arquitecturas en Hidrogeles basados en proteínas para aplicaciones de la cultura de célula

En este método, utilizamos fotopolimerización e inmovilización de técnicas de química haga clic en crear patrones de proteína o péptido en la superficie del hidrogel de polietilenglicol (PEG), proporcionando señales bioactivas para el estudio de las respuestas celulares en vitro .

Patrones bioactivas proteínas o péptidos en hidrogel con fotoquímica para usos biológicos

Aquí se presenta un protocolo para añadir péptido CD47 (pepCD47) a stents metálicos utilizando la química de polibisfosfonato. La funcionalización de los stents metálicos mediante pepCD47 evita la unión y activación de las células inflamatorias mejorando así su biocompatibilidad.

Mitigación de la fijación de células de flujo sanguíneo a implantes metálicos a través de la inmovilización de péptidos derivados de CD47

Este protocolo presenta los procedimientos experimentales para realizar el ensayo de huella de adhesión para obtener imágenes de los eventos de adhesión durante la adhesión rápida de rodadura celular.

Imágenes de adhesión molecular en laminación celular mediante ensayo de huella de adhesión

La litografía UV cercana y la microscopía de fuerza de tracción se combinan para medir las fuerzas celulares en hidrogeles con micropatrones. La liberación dirigida inducida por la luz de células individuales permite un alto número de mediciones en la misma muestra.

Control de la adhesión celular mediante técnicas de patrón de hidrogel para aplicaciones en microscopía de fuerza de tracción

Este protocolo describe la síntesis de péptidos cíclicos penetrantes de células con enlaces cruzados aromáticos y la evaluación de su permeabilidad a través de barreras biológicas.

Construcción de péptidos cíclicos penetrantes de células para mejorar la penetración de barreras biológicas

Este protocolo tiene como objetivo evaluar péptidos biofuncionales autoensamblables para la adhesión celular, la morfología de organoides y la expresión génica mediante inmunotinción. Utilizaremos una línea celular de cáncer colorrectal para proporcionar una forma rentable de obtener organoides para pruebas intensivas.

Fabricación y caracterización de organoides de cáncer colorrectal de la línea celular SW1222 en matriz de péptidos autoensamblables ultracortos

Este protocolo presenta tres métodos de preparación rápidos y sencillos que utilizan las condiciones ambientales para desencadenar el autoensamblaje de péptidos en hidrogeles. Además, se describe la caracterización de los hidrogeles peptídicos, demostrando que se pueden formar hidrogeles peptídicos mecánicamente estables en estas sencillas condiciones.

Preparación de hidrogeles de péptidos autoensamblados mecánicamente estables

Aprende a modificar superficies de PTFE mediante química húmeda para mejorar la adhesión celular en aplicaciones biomédicas. Este método simplificado requiere equipo mínimo y mejora la biocompatibilidad de polímeros médicos.

Química húmeda y el péptido Inmovilización de politetrafluoroetileno para la adhesión celular mejorada

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