Protocolo para la conversión directa de murinos fibroblastos embrionarios en células madre Trofoblasto

El objetivo general de este procedimiento es generar células madre de trofoblasto inducidas auténticas, o iTSCs, a partir de fibroblastos murinos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las células madre sobre la naturaleza de la barrera que separa la línea embrionaria de la línea extraembrionaria. La principal ventaja de esta técnica es que la expresión transgénica solo se activa de forma transitoria, lo que facilita la selección de células convertidas de manera estable.

En un laboratorio de nivel de bioseguridad dos utilizando el equipo de protección personal adecuado, cubra cinco placas de 100 mililitros con cinco mililitros de solución de poli-L-lisina, moviendo suavemente las placas para distribuir uniformemente la solución de recubrimiento. Coloque las placas en un incubador a 37 grados Celsius durante 30 minutos, luego aspire la poli-L-lisina y enjuague las placas una vez con PBS. A continuación, siembre siete veces 10 a la sexta células 293 T por placa en 10 mililitros de medio para células 293 T, agite suavemente las placas para distribuir uniformemente las células y devuélvalas al incubador.

A la mañana siguiente, sustituya el medio de crecimiento por cinco mililitros de medio de transfección. Luego, trate los cultivos con seis microlitros de un stock 1000X de solución de cloroquina y coloque las placas nuevamente en el incubador a 37 grados Celsius. Para preparar la mezcla de transfección, para cada vector lentiviral, agregue 600 microlitros de solución de ADN Lentivector gota a gota en 600 microlitros de solución salina tamponada con HEPES 2X mientras se mezcla en vórtex e incube la mezcla de transfección a temperatura ambiente.

Después de 15 minutos, agregue muy cuidadosamente la mezcla gota a gota a las células 293 T preparadas y regrese las placas al incubador. Después de cinco a seis horas, reemplace el medio con 10 mililitros de medio de producción de virus y coloque las placas nuevamente en el incubador. A la mañana siguiente, reemplace cuidadosamente el medio con siete mililitros de medio fresco de producción de virus para otra incubación nocturna.

A continuación, transfiera el medio de cada placa a tubos cónicos individuales de 15 mililitros y agregue siete mililitros de medio fresco de producción de virus sobre las placas para una incubación adicional durante la noche. A la mañana siguiente, recolecte el segundo lote de medio que contiene virus, reúna el sobrenadante con el primer lote de virus y filtre el medio que contiene virus a través de un filtro de membrana de acetato de celulosa libre de surfactantes de 0,45 micrones para su almacenamiento en alícuotas de 500 microlitros a -80 °C. Para convertir los fibroblastos en células madre de trofoblasto inducidas, lave dos veces los fibroblastos embrionarios transducidos, o MEFs, con dos mililitros de PBS.

Luego, desprenda las células con 0,5 mililitros de solución de tripsina-EDTA a 37 grados Celsius. Después de tres a cuatro minutos, confirme bajo un microscopio invertido que las células se han desprendido de la placa y, a continuación, active la tripsina con un mililitro de medio TS. Transfiera las suspensiones celulares a tubos cónicos individuales de 15 mililitros y centrifugue las células.

Luego, re-suspenda los pellet en dos mililitros de medio TS, y siembre dos veces 10 a la quinta MEFs mCherry con cuatro factores o MEFs de control no transducidos por placa de 100 mililitros en 10 mililitros de medio TS que contenga factor de crecimiento de fibroblastos cuatro y heparina, suplementado con doxiciclina, para cultivo nocturno. Al día siguiente, bajo un microscopio de epifluorescencia, utilice la expresión de la proteína mCherry para estimar la eficiencia de transducción. Si la eficiencia de transducción es aproximadamente del 100 %, regrese los cultivos al incubador, cambiando el medio en todas las placas cada dos días hasta el día 10.

Posteriormente, alimente las células con medio TS fresco que contenga factor de crecimiento de fibroblastos cuatro y heparina, sin doxiciclina, utilizando el microscopio invertido para monitorear la aparición de áreas transdiferenciadas en el plato con los cuatro factores durante hasta tres semanas. La identificación de las áreas transdiferenciadas es fundamental, ya que en este punto, los MEF no se asemejan morfológicamente a las células madre de trofoblasto. Busque colonias densamente apiladas adyacentes a las células gigantes de trofoblasto, que se identifican por su tamaño celular y núcleo grande.

Para aislar líneas individuales de iTSC, primero limpie el microscopio invertido con etanol al 70 % para minimizar la posibilidad de contaminación bacteriana. A continuación, agregue 40 microlitros de Tripsina-EDTA al 0,5 % en 12 pocillos de una placa de fondo redondo de 96 pocillos y coloque la placa en hielo. Ahora aspire el medio del plato de transdiferenciación de MEF con los cuatro factores y lave las células una vez con 10 mililitros de PBS.

Después del lavado, agregue 10 mililitros de PBS fresco a las células y coloque la placa en el portaobjetos del microscopio invertido. Utilizando una pipeta de 100 microlitros ajustada a 40 microlitros, rodee cada colonia individual con la punta de la pipeta y aspire la colonia resultante flotante. Transfiera cada colonia a pozos individuales de la placa de 96 pozos hasta que se hayan seleccionado 12 colonias.

Luego, incubar las colonias a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Al final de la incubación, disociar las células mediante pipeteo y transferir las suspensiones celulares a pozos individuales de una placa de 24 pozos que contenga 500 µL de medio TS completo más factor de crecimiento de fibroblastos y heparina para cultivo nocturno. Al día siguiente, reemplazar el medio con medio fresco de TS completo más factor de crecimiento de fibroblastos y heparina para eliminar las células muertas y devolver la placa al incubador.

Monitorear diariamente las culturas en busca de la aparición de colonias epiteliales con bordes brillantes. Cuando se observen las colonias, cultivar las células durante hasta una semana o hasta que alcancen una confluencia del 70 %. En culturas donde se activa la expresión del transgén de los cuatro factores, las células cambian rápidamente de morfología.

Alrededor de los días 14 a 21, emergen áreas claramente transdiferenciadas. Estas colonias primarias carecen de la morfología típica de las células madre de trofoblasto; sin embargo, una vez que se subcultivan, se observa una morfología epitelial característica con bordes definidos y límites brillantes, muy similar a la de células madre de trofoblasto auténticas. Cuando las células madre de trofoblasto inducidas por los cuatro factores mantienen positividad para el factor de transcripción de trofoblasto Cdx2 y Tfap2c, se puede utilizar la idea de estas líneas para análisis posteriores in vitro o in vivo.

Una vez dominada, esta técnica puede completarse en seis semanas si se realiza adecuadamente. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la inyección asistida por blastocisto, para responder preguntas adicionales sobre el potencial de quimerización de los iTSC generados. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la segregación temprana de líneas celulares exploraran la conversión del destino celular embrionario frente al extraembrionario en ratones.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo convertir directamente fibroblastos embrionarios nuevos en células madre de trofoblasto inducidas. No olvide que trabajar con vectores lentivirales puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben seguir precauciones, como utilizar procedimientos de trabajo adecuados para el nivel de bioseguridad dos.