Imagen Fluorescente combinado del infrarrojo cercano y la tomografía computarizada-Micro para visualizar de manera directa tromboembolia cerebral

El objetivo general de esta técnica de imagen directa de trombos es visualizar cuantitativamente tromboembolias cerebrales marcadas con fluorescencia in vivo y ex vivo, utilizando nanopartículas de oro, tomografía computarizada e imagenología fluorescente en el infrarrojo cercano. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la hemostasia y la trombosis, como la respuesta ortopédica grave dependiente del tiempo o de la dosis de las tromboembolias cerebrales al activador tisular del plasminógeno o a nuevos agentes trombolíticos bajo investigación. La principal ventaja de esta técnica consiste en que, tras la inyección intravenosa de nanopartículas de oro, la micro-TC de alta resolución permite capturar la evolución dinámica de las tromboembolias cerebrales visualizando cuantitativamente su ubicación y carga in vivo, lo cual luego se corrobora mediante la imagenología de trombos fluorescente en el infrarrojo cercano ex vivo.

El procedimiento será demostrado por Jeong-Yeon Kim, quien es posdoctorado de mi laboratorio. Después de recolectar entre 300 y 1.000 microlitros de sangre arterial mediante punción cardíaca, añada 70 microlitros de la muestra a 30 microlitros del factor de coagulación activado apropiado, la sonda fluorescente sensible a la actividad de entrecruzamiento de fibrina mediada por el factor 13, y cargue una jeringa de tres mililitros, equipada con una aguja de calibre 23, con la mezcla resultante. A continuación, inyecte la sangre marcada en un tubo de polietileno de 20 centímetros de largo y permita que la sangre se coagule a temperatura ambiente.

Después de dos horas, transfiera el tubo a cuatro grados Celsius durante 22 horas y luego corte el tubo en trozos de 1,5 centímetros. Utilizando una jeringa de tres mililitros llenada con PBS, expulse el trombo de cada trozo de tubo hacia pocillos individuales de una placa de seis pocillos que contenga PBS. Lave los trombos tres veces con PBS, luego inserte una jeringa de un mililitro llenada con solución salina y equipada con una aguja de calibre 30 en un extremo de un tubo PE10 de 15 centímetros y aspire cuidadosamente un trombo lavado individual al extremo opuesto del tubo.

A continuación, conecte el tubo PE10 cargado con el trombo a un tubo PE50 de tres centímetros de largo que tenga un extremo cónico de 200 micrones de diámetro. Después de confirmar la anestesia mediante la ausencia de respuesta al pellizco del dedo del pie, desinfecte el área quirúrgica con Betadine y alcohol al 70 % y use un bisturí para realizar una incisión vertical de un centímetro entre la oreja izquierda y el ojo. Pegue el extremo distal de la fibra óptica de un medidor de flujo Doppler láser sobre la superficie expuesta del hueso temporal izquierdo, un milímetro a la izquierda y cuatro milímetros por debajo del bregma, y comience la monitorización Doppler.

Luego, realice una incisión media vertical de tres centímetros a través de los tejidos blandos perivasculares para exponer el área del bulbo carotídeo izquierdo. Utilizando un hilo de seda negro estéril 6-0, ligue la arteria carótida común proximal izquierda, seguido por la ligadura de la arteria carótida interna izquierda y de la arteria pterigopalatina izquierda con hilos de seda negros estériles 7-0. Con una electrocauterización monopolar, cauterice la arteria tiroidea superior izquierda, luego use hilos de seda negros estériles 7-0 para ligar laxamente la arteria carótida externa proximal izquierda y para ligar firmemente el extremo distal del vaso.

Utilice tijeras microquirúrgicas para hacer un orificio de 0,2 a 0,25 micrones entre los sitios ligados de la arteria carótida externa e inserte el catéter que contiene el trombo en el orificio mientras afloja la ligadura proximal de la arteria carótida externa. Avance el catéter hacia la arteria carótida común para asegurarlo en su lugar y vuelva a ajustar la ligadura proximal de la arteria carótida externa. Corte el extremo distal de la arteria carótida externa mediante cauterización y gire el extremo proximal libre de la arteria carótida externa en sentido horario para alinear el vaso con la arteria carótida interna mientras retira el catéter.

Luego, afloje la ligadura de la arteria carótida interna e introduzca inmediatamente el catéter aproximadamente nueve milímetros hacia la bifurcación de la arteria cerebral media y la arteria cerebral anterior. Ahora, vuelva a apretar la sutura de la arteria carótida interna alrededor del catéter y presione suavemente la jeringa para inyectar el trombo en la zona de la bifurcación. Si en el Doppler se observa un flujo sanguíneo mayor o igual al 30 % por debajo del valor basal, retire el catéter y ligue inmediatamente el extremo proximal de la arteria carótida externa.

Para obtener imágenes del trombo mediante tomografía computarizada microscópica en el punto temporal experimental adecuado, diluya las nanopartículas de oro dirigidas al fibrinógeno hasta una concentración de 10 miligramos por mililitro en PBS 10 milimolar y someta el agente de imagen para trombos a sonicación durante 30 minutos para asegurar una suspensión homogénea de las nanopartículas. A continuación, inyecte 300 microlitros de las partículas dirigidas al fibrinógeno en la vena peniana del animal experimental. Transfiera el animal a la camilla del equipo de micro-TC y utilice un hilo sujeto a un pasador para tirar suavemente de los dientes frontales superiores con el fin de enderezar el cuello.

Cinco minutos después de la inyección de las nanopartículas de oro, comience la adquisición de imágenes. Para visualizar el trombo mediante imagenología ex vivo en el infrarrojo cercano, coloque el tejido cerebral extirpado en el equipo de imagen con la base orientada hacia arriba. Obtenga imágenes de los tromboembolismos marcados con fluorescencia en las arterias del círculo de Willis.

Luego, coloque el tejido con el vértice hacia arriba e image los tromboembolias corticales. Hidrate el tejido con unas gotas de solución salina y, utilizando el dispositivo de matriz cerebral según las instrucciones del fabricante, obtenga rápidamente seis cortes coronales del cerebro de dos milímetros de grosor. Manteniendo los cortes hidratados con solución salina, obtenga imágenes adicionales en el infrarrojo cercano de ambas superficies, frontal y posterior, de las secciones.

Para cuantificar el área del trombo tras la imagenología por micro-TC, abra los archivos de secuencia de imágenes y seleccione Imagen seguido de Tipo y luego 8 bits para convertir las imágenes a escala de grises de 8 bits. Cuando un píxel de los archivos de imagen de TC corresponda a 0,053 milímetros, utilice Analizar Ajustar Escala para ingresar uno, 0,053 y milímetros como Distancia en píxeles, Distancia conocida y Unidad de longitud, respectivamente. Luego, en Editar, elija Selección seguido de Especificar para colocar una región de interés en un área del parénquima cerebral sin una región hiperdensa relacionada con trombo u hueso.

Dado que la región de interés especificada se aplica a cada corte de la pila, confirme que la región no se superponga con una región hiperdensa en ninguno de los cortes. A continuación, en Plugin, seleccione Región de Interés y Sustracción de Fondo en la Región de Interés e ingrese dos como número de desviaciones estándar respecto a la media. Localice lesiones hiperdensas relacionadas con tromboembolias y acerque la zona lesional.

Ahora, seleccione Imagen seguido de Ajustar y Umbral, e ingrese un Nivel de Umbral Inferior de 22 y un Nivel de Umbral Superior de 255. Seleccione Sobre/Debajo para mostrar los píxeles por debajo del valor del umbral inferior en azul, los píxeles umbralizados en escala de grises y los píxeles por encima del valor del umbral superior en verde. Luego, utilice la herramienta de selección de mano alzada para delinear regiones de interés que rodeen las lesiones hiperdensas relacionadas con tromboembolias, sin incluir áreas óseas.

Utilice Analizar, Establecer mediciones para seleccionar Área, Valor medio de grises y Densidad integrada (área por valor medio). Marque las siguientes opciones: Limitar al umbral y Mostrar etiqueta. Utilice Analizar Medir para obtener los datos cuantificados y luego guarde los resultados.

Estas imágenes de micro-TC de referencia se obtuvieron in vivo cinco minutos después de la inyección de nanopartículas de oro dirigidas al fibrinógeno, una hora tras un accidente cerebrovascular embólico en ratones. El trombo cerebral se puede visualizar claramente en la zona de bifurcación de la arteria cerebral media y la arteria cerebral anterior de la arteria carótida interna distal. Las imágenes de seguimiento de micro-CT demuestran que no hay cambios en el trombo del círculo de Willis en los animales tratados con solución salina; sin embargo, los animales tratados con activador tisular del plasminógeno muestran una disolución gradual del trombo del círculo de Willis a lo largo del tiempo, indicada por las cabezas de flecha azules.

Existe una fuerte correlación entre la densidad por TC in vivo y el análisis espectrofotométrico ex vivo en infrarrojo cercano para tromboembolias residuales a las 24 horas. Por ejemplo, en estas imágenes, las áreas hiperdensas en micro-TC, visualizadas mediante partículas de oro que se dirigen a la fibrina, corresponden directamente a las áreas de señal en infrarrojo cercano identificadas por la sonda fluorescente sensible a la actividad de entrecruzamiento de fibrina mediada por el factor de coagulación 13A, que se une al trombo durante el proceso de maduración del coágulo preformado. Además, como se visualiza en estas imágenes, la tinción con TTC puede utilizarse para evaluar los efectos de la trombólisis en el daño cerebral isquémico en animales tratados con solución salina control en comparación con aquellos tratados con activador tisular del plasminógeno.

Una vez dominada, esta técnica de obtención de imágenes mediante micro-TC in vivo e imágenes fluorescentes ex vivo del trombo con infrarrojo cercano puede realizarse en aproximadamente una hora si se lleva a cabo correctamente y cuando están disponibles las sondas de imagen. Al intentar este procedimiento, es importante recordar el uso de nanopartículas de oro no agregadas y dirigidas a la fibrina para la obtención de imágenes directas de trombos cerebrales basadas en micro-TC. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como microscopía electrónica o ICPMS, que es espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente, con el fin de responder preguntas adicionales como la distribución tisular y la cinética sanguínea de las nanopartículas de oro.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del accidente cerebrovascular o la investigación cardiovascular exploraran el tromboembolismo en modelos animales predispuestos a trombosis coronaria o infarto cerebral embólico. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo elaborar coágulos marcados con fluorescencia para el accidente cerebrovascular tromboembólico en ratones y realizar imágenes seriadas y cuantificación de tromboembolias cerebrales in vivo y luego ex vivo, permitiendo así el seguimiento de la evolución del trombo.