Un alto contenido In Vitro Islotes pancreáticos de células β plataforma de descubrimiento de replicación

El objetivo general de esta plataforma de cribado de replicación de células beta de alto contenido es facilitar la investigación de las vías moleculares que restringen el crecimiento de las células beta. Este método puede ayudar a responder preguntas importantes en el campo de la biología de las células beta. Como una de las moléculas de señalización clave y las vías que controlan la regeneración de las células beta.

Las principales ventajas de esta técnica son que permite aumentar el revestimiento de la celda de rendimiento para una evaluación específica y el análisis de datos automatizado de una replicación de celda de islote primario. El empleo de esta técnica tiene el potencial de extenderse hacia el desarrollo de la terapia regenerativa para la diabetes. Una enfermedad con un gran coste sanitario y económico para nuestra sociedad.

Comience usando una jeringa de 10 mililitros cargada con solución digestiva pancreática equipada con una aguja de calibre 22 para emular el conducto biliar común en o justo distal a la unión de los conductos hepático y hepático común. Sosteniendo el conducto biliar común con un mango de bisturí, inyecte lentamente 10 mililitros de la solución. Después de que se haya administrado toda la colagenasa, use pinzas curvas y tijeras para separar el páncreas inflado del colon, los intestinos, el estómago y la ranura descendentes.

A continuación, coloque hasta dos páncreas en un tubo de 50 mililitros con hielo que contenga cinco mililitros de solución de digestión pancreática. Cuando se haya recogido todo el páncreas, coloque los tubos de digestión en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 15 minutos con un suave remolino cada tres minutos. Al final de la digestión, agite vigorosamente los tubos verticalmente 10 veces.

Y agregue 10 mililitros de tampones de lavado en frío a las muestras. Agite vigorosamente los tubos cinco veces más y colóquelos sobre hielo. A continuación, llene los tubos hasta un volumen final de 50 mililitros con tampón de lavado en frío e invierta los tubos cinco veces.

A continuación, centrifugar los pañuelos y verter los sobrenadantes, teniendo cuidado de no desalojar los gránulos. Vuelva a suspender la suspensión del tejido en 25 mililitros de tampón de lavado, seguido de un suave vórtice. Repita los pasos de giro y resuspensión dos veces más.

Vierta las suspensiones de tejido a través de un tamiz de tejido de malla 30 en un vaso de precipitados estéril de 250 mililitros. Enjuague los tubos de digestión con 20 mililitros adicionales de tampón de lavado y vierta los lavados en la malla para eliminar los tejidos pancreáticos y grasos no digeridos. Divida el material filtrado entre dos nuevos tubos de 50 mililitros y granule el tejido por centrifugación.

A continuación, decantar el sobrenadante e invertir los tubos para drenar el exceso de tampón. Para purificar los islotes, agregue 20 mililitros de gradiente de densidad fría a los gránulos de tejido pancreático y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo cinco veces para volver a suspender homogéneamente el contenido. A continuación, superponga lentamente 10 mililitros de HBSS en la pared de cada tubo de gradiente, teniendo cuidado de mantener una interfaz líquida aguda y separar las células pancreáticas por centrifugación.

Utilice una pipeta de 10 mililitros para transferir la capa de islotes de la interfaz a los nuevos tubos cónicos de 50 mililitros. A continuación, lave los islotes con 40 a 50 mililitros de tampón de lavado tres veces. Invirtiendo sus tubos para volver a suspender los pellets entre cada centrifugación.

Después del lavado final, coloque los tubos en una campana de cultivo de tejidos. Aspirar el sobrenadante. Y volver a suspender los pellets en seis mililitros de medio de islote.

Tamizar los islotes de cada tubo en pocillos individuales de seis pocillos en placa de cultivo de tejidos. Y gire la placa para recoger los islotes en el medio de los pozos. Evalúe la pureza de los islotes bajo el microscopio.

Para purificar aún más los islotes, recójalos con una pipeta de un mililitro y transfiéralos al pozo adyacente con seis mililitros de medio de islote. Repita el remolino de los islotes, la recolección, la transferencia y la evaluación microscópica hasta lograr una pureza superior al 90 por ciento. A continuación, transfiera los islotes a una sola placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros que contenga 20 mililitros de medio para los islotes.

Después de que se hayan recolectado todos los islotes, coloque la placa de cultivo en una incubadora de cultivo de tejidos durante la noche. A continuación, cubra los pocillos de una placa de 384 pocillos con 40 microlitros de 804 G, medio acondicionado por pocillo y coloque la placa en la incubadora durante la noche. Al día siguiente, use un raspador de células para separar suavemente los islotes.

Luego transfiera los islotes a un tubo de 50 mililitros. Recoger los islotes por centrifugación. Luego lávelos con 20 mililitros de p, b, s tibios.

Centrifugar durante un minuto. Aspirar el sobrenadante. Y volver a suspender el pellet en cero punto dos, cinco por ciento de Trypsin.

Incubar los islotes durante 10 minutos a 37 grados centígrados utilizando una pipeta de un mililitro para aspirar y dispensar los islotes 10 veces a los cinco y 10 minutos. Después de la segunda triteración, se cuenta una muestra de 20 microlitros de las células tripsinizadas de los islotes. Si los tejidos están completamente digeridos, suspenda las células disociativas de los islotes a una concentración de cuatro punto cinco veces diez a cuatro células por mililitro en el medio de función de los islotes.

A continuación, utilice un aspirador de colector de 12 pocillos para eliminar el medio de condición 804G de la placa de 384 pocillos preparada previamente. Y tamizar 70 microlitros de islotes por pocillo en las filas c a n en las columnas cuatro a 21. Deje que los islotes se adhieran a la incubadora de cultivo de tejidos durante 48 horas.

Después de dos días, use el aspirador de colector de 12 pocillos para extraer cuidadosamente el medio del islote y use una pipeta de 12 canales para agregar 35 microlitros de medio de función de islote a cada pocillo. A continuación, transfiera 35 microlitros de las dos soluciones compuestas recién preparadas de interés a cada pocillo. Y devolver los islotes a la incubadora durante otras 48 horas.

Después de 48 horas, fije, tiña y analice los cultivos de islotes tratados con compuesto utilizando una plataforma automatizada de imágenes de alto contenido. En un experimento típico, la tasa de replicación de las células beta DAPI, PD-1 e insulina positiva está determinada por el porcentaje de células beta que coexpresan Ki-67. La replicación de células alfa se mide como el porcentaje de células DAPI positivas, PD negativas, positivas para glucagón y coexpresantes de Ki-67.

Por ejemplo, en este experimento representativo, se observó que el dipryridamol promovía la replicación de las células beta, pero no alfa. Esta técnica se puede completar en siete días. Siguiendo este procedimiento, los compuestos que se encuentran en la replicación de las células beta se pueden estudiar más a fondo para revelar los mecanismos de acción.

Esta técnica ha permitido a las investigaciones en el campo de la biología de las células beta identificar nuevos factores de señalización y vías que regulan el crecimiento de las células beta. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo probar la capacidad de las moléculas pequeñas para estimular selectivamente la regeneración de células beta.