Preparación de núcleos de tejido incluidas en parafina fijadas con formalina para ambos RNA y DNA Extraction

El objetivo general de este procedimiento es extraer secuencialmente el ARN y el ADN de los núcleos de tejido de archivo fijados en formol e incluidos en parafina. Se trata de un protocolo de recolección de núcleos de tejido de los que extraeremos tanto ARN como ADN. La principal ventaja de este protocolo es que mejora los rendimientos de ARN y ADN de regiones específicas en el bloque de tejido.

Este procedimiento se ha desarrollado en gran medida en tejidos de cáncer de próstata de archivo. También se puede aplicar a otros tipos de tejidos de archivo. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de extracción de muestras de tejido no se utilizan habitualmente en los laboratorios de investigación.

En su lugar, la mayoría de los laboratorios de investigación utilizan secciones transversales, lo que agota los tejidos más rápido y añade una heterogeneidad significativa a la muestra. Comience revisando el portaobjetos del microscopio y delineando la región de interés con un marcador permanente de punta fina. A continuación, corte una sección de película de parafina lo suficientemente grande como para cubrir la región de interés en el portaobjetos del microscopio.

Luego, coloque la película firmemente en la guía, envolviendo la película sobre los bordes para evitar que se deslice. Con un marcador permanente de punta fina, delinee todo el tejido y la región de interés dentro del tejido. A continuación, retire la película del portaobjetos y transfiérala al bloque de tejido correspondiente.

Oriente la película volteándola o girándola de modo que el contorno de todo el tejido coincida con la forma observada del tejido en el bloque. Presione la sección de película firmemente contra la superficie del bloque para evitar el deslizamiento. Con la punta del marcador permanente, haga hendiduras poco profundas pero visibles a lo largo del contorno de la región de interés y luego retire la película.

A continuación, limpie el punzón receptor del juego de punzones de 0,6 milímetros sumergiendo la punta en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contiene un mililitro de lejía y deslizando el punzón hacia arriba y hacia abajo varias veces. Repita el lavado con el tubo que contiene un 70 por ciento de etanol y luego agua. Ahora presione el punzón limpio en la región de interés a una profundidad de tres milímetros y retírelo.

Suelte el núcleo en un tubo de microcentrífuga de baja unión empujándolo fuera del punzón con la aguja. Agregue un mililitro de xileno a los tubos de microfuga que contienen los núcleos de tejido y el vórtice vigorosamente durante diez segundos. Luego colóquelo en un bloque de calor ajustado a 50 grados centígrados durante tres minutos.

Después de la incubación, centrifugar durante dos minutos a temperatura ambiente a máxima velocidad. Después de la centrifugación, coloque los corazones en hielo durante cinco minutos para solidificar el residuo ceroso. Ahora, retira con cuidado la parafina que se ha acumulado alrededor del menisco junto con el sobrenadante con la punta de una pipeta.

A continuación, repita el tratamiento con xileno. Después de retirar la mezcla de parafina y xileno, agregue un mililitro de etanol al 100 por ciento y haga vórtice vigorosamente durante diez segundos. Después de centrifugar a máxima velocidad durante dos minutos, deseche con cuidado el etanol.

Repita el lavado con etanol una vez más antes de comenzar la homogeneización. Vuelva a suspender los núcleos desparafinados en 700 microlitros de etanol al 100 por ciento antes de la homogeneización. Utilice un homogeneizador de tejido motorizado en una configuración media para moler los núcleos en partículas finas.

Se requiere una homogeneización completa de los núcleos de tejido para un rendimiento óptimo de ADN y ARN. A continuación, llene tubos separados de 15 mililitros con aproximadamente diez mililitros de lejía, solución neutralizante de ARNasa y etanol al 70 por ciento. Después de la homogeneización de la muestra, lave la sonda del homogeneizador en cada una de las soluciones de limpieza en orden.

Haga funcionar el homogeneizador a la velocidad más alta durante la etapa de lavado. Limpie la sonda con un pañuelo de papel y deje que la sonda se seque por completo antes de homogeneizar la siguiente muestra. Inspeccione visualmente las cuchillas de la sonda en busca de piezas de tejido residuales y, si las encuentra, limpie la sonda nuevamente.

Después de la homogeneización, lleve el volumen de la muestra a un mililitro con etanol al 100 por ciento, luego centrifugue a velocidad máxima durante 15 minutos. Aspire cuidadosamente el etanol y seque al aire los gránulos durante aproximadamente 15 a 20 minutos antes de comenzar la extracción de proteinasa K. Vuelva a suspender los gránulos en 150 microlitros de tampón de digestión de proteinasa K y agite los tubos para aflojar el gránulos.

Se recomienda la digestión nocturna de la proteinasa K para una mayor recuperación del ADN. Agregue 10 microlitros de proteinasa K estable a la temperatura y mezcle agitando. Incubar a 56 grados centígrados durante 15 minutos con una leve agitación.

Incuba los tubos en hielo durante tres minutos. Después de enfriar, centrifugar el tubo durante 15 minutos a máxima velocidad. A continuación, sin alterar los gránulos, transfiera con cuidado cada sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga para la purificación del ARN.

Extraiga el ARN y el ADN utilizando el procedimiento optimizado en el protocolo escrito, que incluye un tiempo prolongado de digestión de tejidos para la extracción de ADN. El ARN y el ADN se pueden recuperar de muestras de tejido más antiguas fijadas en formol e incluidas en parafina utilizando este método. Los ácidos nucleicos se coextrajeron de muestras de cáncer de próstata con edades comprendidas entre los tres y los 14 años.

El rendimiento medio fue de 2.270 nanogramos de ARN y 820 nanogramos de ADN. Curiosamente, no hubo una correlación significativa entre la edad de la muestra de tejido y la recuperación de ácido nucleico. En general, los rendimientos de ARN y ADN se correlacionaron entre las muestras, aunque en la mayoría de los casos, se recuperó más del doble de ARN en relación con el ADN.

Para demostrar el rendimiento del ADN genómico extraído con este protocolo, se amplificaron extractos de ADN convertidos en bisulfito de muestras de cáncer de próstata de archivo mediante PCR específica por metilación. Los elementos repetitivos de ALU se utilizaron como control de metilación y mostraron poca variación entre muestras. GSTP1, un gen conocido por estar hipermetilado en el cáncer de próstata, no mostró amplificación detectable por PCR específica de metilación cuando se utilizó ADN extraído de muestras benignas.

Las muestras de ADN de pacientes con cáncer de próstata agresivo exhibieron valores de umbral del ciclo de QPCR detectables que eran más bajos que los de las células de cáncer de próstata indolente, lo que indica un aumento de la metilación de GSTP1 en el cáncer de próstata agresivo. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres o cuatro horas para el ARN, y después de la digestión durante la noche, en cuatro horas para el ADN si se realiza correctamente. Esta técnica debería permitir a los investigadores en patología molecular explorar biomarcadores de ADN y ARN de diagnóstico en una variedad de cánceres.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar núcleos de tejido para la extracción de ADN y ARN de áreas de interés mapeadas con precisión en bloques de tejido de archivo.