Comparación de los métodos de tabaco Protein Removal célula huésped mediante escaldado plantas intactas o por tratamiento térmico de los extractos
8 de agosto de 2016
Tres de calor se presentan métodos de precipitación que elimina de manera efectiva más de 90% de las proteínas de la célula huésped (HCP) de tabaco extrae antes de cualquier otra etapa de purificación. La planta de profesionales de la Salud irreversiblemente total a temperaturas superiores a 60 ° C.
El objetivo general de este conjunto de experimentos es precipitar proteínas de células huésped vegetales mediante calor, facilitando así la purificación cromatográfica posterior de proteínas bioterapéuticas recombinantes. Este método puede ayudar a optimizar el desarrollo del proceso y aumentar la estabilidad del producto, por ejemplo, mediante la activación de proteasas del huésped.
La principal ventaja de esta técnica es que es fácil de implementar en proteasas existentes y se puede adaptar rápidamente a diferentes proteínas diana. La demostración del procedimiento estará a cargo de Hannah Gruchow, una estudiante de maestría de mi laboratorio. Para precipitar térmicamente las proteínas de la célula huésped.
Por ejemplo, a partir de hojas de tabaco. Después de cultivar plantas de tabaco según el protocolo descrito en el texto, prepare un baño de agua con un volumen de trabajo de ocho litros en un recipiente de espuma de poliestireno aislado térmicamente. Transfiera todo el conjunto a una placa agitadora magnética y coloque una barra magnética en el baño de agua.
Luego rodee la barra de agitación con una baldosa de soporte no magnética, colocándola encima de la barra de agitación aproximadamente un centímetro. Sobre esta baldosa se colocará más adelante una canasta de polipropileno durante el procedimiento. Añada ocho litros de tampón al baño de agua.
Luego, coloque una canasta de polipropileno de 23 por 23 por 23 centímetros sobre las baldosas de soporte. Asegúrese de que el soporte no interfiera con la rotación de la barra de agitación y de que la canasta esté completamente sumergida en el líquido. A continuación, retire la canasta.
Utilice un termostato ajustable para llevar el baño de agua a 70 grados Celsius. Espere al menos 15 minutos después de alcanzar la temperatura deseada para asegurar que todo el conjunto haya alcanzado el equilibrio térmico. A continuación, prepare alícuotas de 150 gramos a partir de las hojas de tabaco.
Coloque una alícuota en la canasta evitando la compresión irreversible y el daño a las hojas, por ejemplo, por desgarro. Sumerja cuidadosa pero rápidamente la canasta en el líquido caliente y colóquela sobre las baldosas de soporte.
Luego, coloque un bloque de acero inoxidable encima de la canasta para evitar la flotación. Incube las hojas durante cinco minutos en el líquido escaldante. O seleccione un tiempo adecuado para el diseño experimental.
Monitoree la temperatura del líquido durante todo el período de incubación. Después de la incubación, retire cuidadosamente la canasta del líquido escaldante y deje escurrir las hojas durante 30 segundos. Luego, saque las hojas de la planta de la canasta, transfiéralas a la licuadora e inmediatamente comience la extracción según los protocolos descritos en el texto.
Para calentar y precipitar las HCP en un recipiente agitado. Transfiera un baño de agua a una placa de agitación magnética y coloque un recipiente de acero inoxidable de dos litros en el baño de agua de manera que el centro del recipiente quede alineado con el centro de la placa de agitación. Coloque una barra de agitación magnética en el recipiente de acero inoxidable.
Llene el recipiente con tampón de extracción. Luego con agua desionizada. Llene el baño de agua hasta cinco centímetros por debajo del borde superior del recipiente de acero inoxidable.
Utilice una tapa de espuma de poliestireno para cubrirla. A continuación, inserte un termómetro en el recipiente de acero inoxidable a través de un orificio en la tapa. Luego, ajuste la temperatura del baño de agua a 78 grados Celsius e incube todo el conjunto durante 15 minutos para alcanzar el equilibrio térmico.
Cuando el ensamblaje haya alcanzado el equilibrio, vacíe el recipiente y vierta 300 mililitros de extracto en el recipiente mientras aún está en el baño de agua y active el cronómetro. Agite el extracto a 150 rpm mientras incuba durante cinco minutos. Asegúrese de que el extracto alcance una temperatura de 70 grados Celsius durante al menos dos minutos durante el período de incubación.
Después de la incubación, retire el baño de agua caliente del agitador magnético. Saque el recipiente de acero inoxidable y colóquelo en un balde con agua helada. Luego, coloque el balde sobre la placa agitadora.
Asegúrese de que el homogenato vegetal se agite bien a 150 rpm. Coloque el termómetro en el extracto e incúbelo hasta que alcance una temperatura de 20 grados Celsius o la temperatura especificada. Después de preparar dos baños de agua con un volumen de trabajo de ocho litros según el protocolo descrito, use agua desionizada para llenar el primer baño.
Configure el termostato a 74,5 grados Celsius e incube el ensamblaje durante 15 minutos para alcanzar el equilibrio térmico. Prepare un recipiente aislado para almacenamiento colocando un vaso de plástico de 0,5 litros dentro de un vaso de plástico de un litro. Utilice un material aislante, como algodón hidrófilo, para rellenar los espacios.
Utilizando el tubo LS24, conecte el intercambiador de calor a una bomba peristáltica en un extremo y a una manguera de salida en el otro extremo. Coloque ambos extremos del tubo junto con el termómetro en el recipiente aislado de almacenamiento. Y llénelo con 300 milímetros de tampón de extracción.
A continuación, coloque el intercambiador de calor en el baño de agua caliente e inicie la bomba peristáltica a una velocidad de 300 mililitros por minuto. Después de tres minutos, asegúrese de que la temperatura resultante en el recipiente sea de 70 grados Celsius, aproximadamente 4,5 grados Celsius por debajo del punto de consigna del baño de agua.
Deseche el tampón de extracción del recipiente aislado y prepare alícuotas de 300 mililitros del extracto vegetal. Luego, con una alícuota, llene el recipiente aislado. Ahora bombee el extracto vegetal a través del intercambiador de calor a 300 mililitros por minuto durante cinco minutos.
Luego, asegúrese de que la temperatura del extracto sea de 70 grados Celsius después de tres minutos o iguale la temperatura indicada en el diseño experimental. Después de cinco minutos, transfiera el intercambiador de calor al baño de agua con hielo. Asegúrese de que la temperatura del extracto esté por debajo de 30 grados Celsius antes de continuar.
Retire la manguera de entrada conectada a la bomba peristáltica del recipiente aislado. Y continúe bombeando para recoger el extracto vegetal precipitado por calor residual dentro del intercambiador de calor. Luego detenga la bomba.
Para realizar la filtración por bolsa del extracto vegetal, coloque un filtro de bolsa en el canasto de soporte correspondiente insertado en la carcasa del filtro. Coloque un recipiente de un litro debajo del canasto y aplique las alícuotas del extracto al filtro a una velocidad de 150 mililitros por minuto. Después de la filtración, utilice un turbidímetro para medir la turbidez de una dilución uno a 10 del filtrado en tampón de extracción.
Aliquote una muestra de un mililitro y procese el filtrado de la bolsa. Por ejemplo, mediante filtración en profundidad y cromatografía. Analice posteriormente la muestra de acuerdo con el protocolo descrito en el texto.
La precipitación térmica de las proteínas de células huésped mediante escaldado reduce la proteína soluble total o TSP en un 96 ± 1 por ciento. El escaldado recuperó hasta un 83 ± 1 por ciento de DsRed y un 51 por ciento de la proteína diana Vax8. Aumentando su pureza del 0,1 por ciento al 1,2 por ciento antes de la separación cromatográfica.
La capacidad del filtro disminuyó a temperaturas de escaldado superiores a 63 grados Celsius. Lo cual puede solucionarse mediante la adición de floculantes después de la extracción de proteínas y de auxiliares de filtración después de la filtración por bolsa. Un recipiente agitado para la precipitación por calor eliminó un máximo del 84 ± 1 por ciento de las HCP.
Alcanzando una pureza de 0,33 ± 0,02 por ciento para Vax8 y de 20,2 ± 1,4 por ciento para DsRed. En contraste con el escaldado y la configuración del intercambiador de calor, la precipitación de HCP en un recipiente aumenta la capacidad de filtración profunda aguas abajo en 2,5 veces. Esto refleja las fuerzas de cizallamiento más bajas en el recipiente en comparación con el bombeo del extracto a través del intercambiador de calor o la homogenización tras el escaldado.
Aproximadamente el 88,3 ± 0,7 por ciento del contenido de HCP se eliminó de forma constante del extracto utilizando un intercambiador de calor entre 60 y 70 grados Celsius. Se logró una pureza del 0,31 ± 0,01 por ciento para Vax8 y del 27,6 ± 2,0 por ciento para DsRed.
Finalmente, el intercambiador de calor también logró la menor capacidad de filtración aguas abajo. Aclarando solo 13,5 más o menos 6,0 litros por metro cuadrado antes de obstruirse. Una vez dominada esta técnica, puede realizarse en menos de 50 minutos más la muestra, si se realiza adecuadamente.
Al intentar este método, es importante recordar asegurarse de que la proteína diana sea estable al calor. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la cromatografía para purificar aún más el producto hasta el nivel requerido. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biotecnología vegetal exploraran, mediante una tecnología, la purificación de proteínas candidatas a vacunas y especies de *Nicotiana*.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo precipitar proteínas de células huésped vegetales utilizando escaldado, recipiente agitado o intercambiador de calor.
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Descripción general
Este estudio presenta tres métodos de precipitación por calor que eliminan eficazmente más del 90 % de las proteínas de células huésped (HCP) de extractos de tabaco. Los métodos facilitan los pasos posteriores de purificación de proteínas bioterapéuticas recombinantes.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biotecnología
- Purificación de proteínas
- Desarrollo farmacéutico
Antecedentes
- Las proteínas del hospedador pueden interferir con la purificación de proteínas recombinantes.
- La precipitación por calor es una técnica utilizada para eliminar proteínas no deseadas.
- La eliminación eficaz de las proteínas del hospedador es crucial para la estabilidad del producto.
- Este método puede adaptarse para diversas proteínas diana.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para precipitar proteínas de células huésped vegetales mediante calor.
- Optimizar el desarrollo del proceso de biofármacos recombinantes.
- Mejorar la estabilidad del producto final.
Métodos Utilizados
- Precipitación térmica de extractos de tabaco.
- Control de temperatura para inducir la agregación de proteínas.
- Técnicas posteriores de purificación cromatográfica.
- Realización por un estudiante de maestría en el laboratorio.
Resultados principales
- Más del 90 % de las HCP se eliminaron de los extractos.
- El tratamiento térmico agregó eficazmente las HCP vegetales por encima de 60 °C.
- El método es fácil de implementar y adaptable.
- Facilitó la purificación de proteínas recombinantes.
Conclusiones
- La precipitación por calor es un método viable para la eliminación de proteínas celulares huésped (HCP).
- Esta técnica puede mejorar la eficiencia de los procesos de purificación de proteínas.
- Estudios futuros podrían explorar su aplicación a otras proteínas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La contaminación por proteínas del huésped (HCP) sigue siendo un cuello de botella crítico en la purificación de productos bioterapéuticos, particularmente en sistemas de expresión basados en plantas, donde altas concentraciones de HCP dificultan la eficiencia cromatográfica. Este estudio evalúa tres métodos escalables de precipitación por calor—escaldado de hojas intactas de tabaco, tratamiento en reactor agitado y procesamiento mediante intercambiador de calor—para aglomerar y eliminar selectivamente las HCP a temperaturas superiores a 60 °C, mejorando así los resultados de la purificación posterior. Al permitir una mayor pureza de la proteína diana antes de la cromatografía, estos enfoques favorecen la intensificación del proceso, reducen el consumo de tampón y mejoran la robustez general del proceso de fabricación de candidatos a vacunas y proteínas terapéuticas producidas en plantas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación funcional de proteínas diana al reducir la interferencia de las proteínas huésped celulares en los protocolos de purificación en etapas iniciales.
- Valor operativo: Proporciona un paso rápido de clarificación basado en calor, compatible con el cribado de expresión a pequeña escala en Nicotiana spp.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera extractos clarificados con fondo reducido de proteínas celulares huésped (HCP), mejorando las relaciones señal-ruido en inmunoensayos posteriores y mediciones de actividad.
- Valor operativo: Estandariza la preparación del material de partida para lograr un rendimiento cromatográfico consistente en corridas replicadas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Apoya la producción de candidatos vacunales como Vax8 con mayor pureza, facilitando la evaluación de inmunogenicidad y seguridad.
- Valor operativo: Se integra en procesos existentes de perfusión o cosecha por lotes sin requerir modificación genética del huésped.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
La precipitación por calor funciona como una operación unitaria entre la cosecha y la cromatografía, aplicable en los flujos de trabajo de proteínas recombinantes basadas en plantas, desde el descubrimiento inicial hasta la generación de suministro preclínico.
- Biología del Descubrimiento: Reduce el ruido mediado por las proteínas del huésped en la detección de la proteína diana, apoyando la eliminación de riesgos mecanicistas de los candidatos terapéuticos.
- Tamizaje: Mejora la claridad y filtrabilidad del extracto, permitiendo un tamizaje fiable de purificación de alto rendimiento.
- Analítica: Proporciona métricas cuantificables de reducción de proteínas del huésped (por ejemplo, eliminación del 84–96 %) y mejoras en la pureza (por ejemplo, DsRed del 0,1 % al 27,6 %) para la comparación de procesos.
- Investigación Traducional: Mantiene la integridad de la proteína diana (por ejemplo, Vax8, DsRed) tras el tratamiento, permitiendo la continuidad hacia la formulación y las pruebas de eficacia.
- Reutilización Empresarial: Adaptable a distintos sistemas de expresión vegetal y proteínas diana con mínima revalidación, lo que favorece su implementación a nivel de plataforma.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en los resultados de purificación mediante una reducción constante de las proteínas celulares huésped (HCP) y una disminución del ensuciamiento cromatográfico.
- Valor operativo: Aumenta la capacidad del filtro profundo aguas abajo (hasta 2,5 veces en recipiente agitado) y reduce la frecuencia de intercambio de tampón.
- Valor estratégico: Disminuye el riesgo de fabricación al eliminar impurezas del proceso desde una etapa temprana, reduciendo la probabilidad de fallos de lote en etapas avanzadas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos derivados de plantas al mejorar las métricas tempranas de desarrollabilidad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el control de procesos térmicos y en la evaluación de la estabilidad de proteínas para evitar la desnaturalización del objetivo.
- Depende del acceso a recipientes con control de temperatura, intercambiadores de calor o infraestructura de escaldado con agitación y monitoreo precisos.
- Necesita la estandarización del tiempo de escaldado, la temperatura y la geometría del recipiente entre diferentes sitios para lograr una eliminación reproducible de las proteínas celulares huésped (HCP).
- Implica compromisos: el escaldado puede reducir la capacidad del filtro, mientras que el uso de intercambiadores de calor presenta desafíos de limpieza a pesar de su escalabilidad.
- Exige una optimización empírica mediante el diseño de experimentos para equilibrar la eliminación de HCP, el rendimiento del producto y la operabilidad en etapas posteriores para cada proteína objetivo.
