La determinación de supresión del sistema inmunológico frente a la protección del SNC para Intervenciones farmacológicas en la desmielinización autoinmune

El objetivo general de este método conceptual es determinar si los tratamientos farmacológicos para la encefalomielitis autoinmune experimental demuestran su protección del sistema nervioso central durante el ataque de la infiltración de células inmunitarias o como consecuencia de la supresión de la infiltración de células inmunitarias. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo inmunológico neural. Por ejemplo, ¿cómo la manipulación de los tiempos de tratamiento de EAE diferencia los efectos sobre la infiltración de células inmunitarias frente a la protección?

Las implicaciones de esta técnica también se extienden hacia el tratamiento de la esclerosis múltiple, ya que en la actualidad no existen tratamientos protectores neurales para esta enfermedad. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando descubrimos que el tratamiento de ratones EAE con un inhibidor del sistema Xc-transportador era tanto neuroprotector como inmunomodulador. Aunque este método se puede utilizar para estudiar tratamientos farmacológicos, también se puede aplicar a estudios con ratones knockout genéticos sometidos a EAE u otras manipulaciones.

Comience usando tijeras estériles para picar los cerebros y la médula espinal de los animales individuales en pedazos pequeños. A continuación, utilice un émbolo de jeringa de tres mililitros por pañuelo para triturar cada muestra sobre filtros de células individuales de 70 micras en tubos cónicos individuales de 50 mililitros mientras enjuaga los filtros con medio. Cuando todas las piezas hayan sido maceradas, llevar el volumen final en los tubos hasta 50 mililitros con medio fresco, luego centrifugar las suspensiones celulares.

Vuelva a suspender cada pellet en cuatro mililitros de solución de gradiente de densidad del 40%. A continuación, coloque cuidadosamente la célula lentamente por las paredes de los tubos cónicos individuales de 15 mililitros sobre dos mililitros de solución de gradiente de densidad del 70% por tubo. Separe las células por centrifugación y use pipetas de transferencia de un mililitro para desechar cuidadosamente las capas superiores de mielina.

A continuación, transfiera las células viables de las interfaces de muestra a nuevos tubos cónicos de 15 mililitros y lave las células en un volumen final de 15 mililitros de medio fresco por tubo. Vuelva a suspender los gránulos en 200 microlitros de medio fresco y transfiera las suspensiones celulares a pocillos individuales de una placa inferior redonda de 96 pocillos. Centrifuga la placa y retira los sobrenadantes.

A continuación, resuspender los pellets en 200 microlitros de medio de reestimulación e incubar las células a 37 grados centígrados durante cuatro horas. Al final de la incubación, vuelva a centrifugar la placa y retire los sobrenadantes. A continuación, lavar las células en 200 microlitros de PBS suplementado con 2%FCS y resuspender las células en 200 microlitros de PBS suplementado con 2%FCS y FC-block durante 10 a 15 minutos en hielo.

Al final de la incubación, lavar las células como se acaba de demostrar y volver a suspender los gránulos en 15 microlitros de cóctel de tinción de superficie celular durante 15 minutos en hielo. A continuación, centrifugar las células y lavar las muestras dos veces en 200 microlitros de PBS. A continuación, vuelva a suspender las células en los reactivos de tinción del factor de transcripción FOXP3 de acuerdo con las instrucciones del fabricante durante 30 minutos hasta toda la noche a 4 grados centígrados.

Al final de la incubación, lavar las células con 150 microlitros de tampón de permeabilización. A continuación, centrifugar las células y resuspender los gránulos en los anticuerpos intracelulares de interés en 15 microlitros de tampón de permeabilización sobre hielo. Después de 30 minutos, centrifugar las células seguidas de tres lavados en 200 microlitros de tampón de permeabilización.

Después del último lavado, vuelva a suspender los gránulos en 200 microlitros de PBS y analice las muestras por citometría de flujo, comprobando las células vivas CD4 positivas, TCR beta positivas. También es importante evaluar la proliferación de células T periféricas porque los cambios en la periferia pueden afectar la infiltración de células inmunitarias en el SNC. Para cuantificar el número de astrocitos y células gliales presentes en las muestras de tejido de la médula espinal después de la inducción de EAE, obtenga imágenes de cada sección con un aumento de 4x y guarde las imágenes como archivos TIFF.

A continuación, en ImageJ, seleccione la imagen de interés y utilice la herramienta de selecciones de polígonos para trazar toda la sección de tejido espinal. En el menú de la imagen, seleccione el tipo y 16 bits para convertir la imagen a 16 bits. A continuación, abra el menú de proceso y seleccione el fondo del sujeto para establecer el radio de la bola rodante al menos del tamaño del objeto más grande que no forme parte del fondo.

Compruebe el paraboloide deslizante y haga clic en Aceptar. A continuación, en la imagen, seleccione ajustar y umbral, y utilice las barras deslizantes para establecer el nivel de umbral inferior. Para obtener el porcentaje del área umbralizada dentro de la región seleccionada, en analizar y establecer mediciones, seleccione fracción de área. Asegúrese de que el límite del umbral esté desactivado y que la etiqueta de visualización esté marcada, y haga clic en OK.To obtener las mediciones, en analizar, seleccionar medida.

Aparecerá un cuadro emergente de resultados. Guarde estos datos y compare los valores de la fracción de área entre los grupos de tratamiento. Para cuantificar la tinción básica de mielina por densidad óptica, abra la imagen de interés y utilice la herramienta de secciones poligonales para dibujar una región de interés dentro de la muestra.

En Analizar y establecer mediciones, seleccione el valor medio de gris y confirme que el límite al umbral esté desactivado y que la etiqueta de visualización esté activada. Haga clic en Aceptar. A continuación, en el menú Analizar, seleccione Medir. Aparecerá un nuevo cuadro emergente de resultados con los datos del valor medio de gris de la proteína básica de mielina.

La extirpación de la médula espinal y el análisis citométrico de flujo permiten evaluar la infiltración de células inmunitarias del sistema nervioso central, donde la infiltración de células inmunitarias es máxima en el pico de la enfermedad. El análisis estadístico de los números de células CD4 positivas, interferón gamma positivas, IL-17 positivas y FOXP3 positivas puede revelar la importancia de los cambios observados en el número de células T infiltrantes CD4 positivas en animales tratados con fármacos, en comparación con los animales de control, con un análisis de coexpresión en profundidad esencial para descartar el sesgo como un factor de confusión en la reducción general del número de células T infiltrantes CD4 positivas. Para eliminar la posibilidad de que una reducción en la infiltración de células T en el sistema nervioso central sea consecuencia de la inhibición de la proliferación, activación y diferenciación en la periferia, se puede evaluar el número de células T que proliferan activamente y la proporción de subtipos de células T.

Para la evaluación cuantitativa de la integridad de la mielina, se puede realizar un análisis estadístico de la densidad óptica de la tinción de la proteína básica de mielina, revelando una desmielinización significativa del tejido de la médula espinal en animales knockout genéticos no especificados en comparación con los compañeros de camada de tipo salvaje, por ejemplo. Para corroborar aún más que la neuroinflamación se mantiene o disminuye mediante intervenciones terapéuticas, la gliosis reactiva también se puede evaluar midiendo el área de la fracción media de la gliosis reactiva, como se acaba de demostrar. Una vez dominada, la técnica de citometría de flujo se puede completar en dos días si se realiza correctamente, mientras que la cuantificación de la tinción tisular se puede realizar en aproximadamente dos horas por tinción.

La inmunomodulación se puede evaluar introduciendo los tratamientos antes de la infiltración de células inmunitarias para cuantificar los cambios migratorios y proliferativos en las células T. La protección del SNC puede evaluarse mediante la introducción de los tratamientos durante el pico de la enfermedad, cuando las células inmunitarias ya se han infiltrado en el SNC. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe evaluar la configuración de umbral óptima en ImageJ solo para el resaltado específico de la tinción celular.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar los efectos de tratamientos específicos sobre el sistema nervioso central, la proliferación de células T y las respuestas de migración. Alterando los tiempos de tratamiento antes y después de la infiltración de células inmunitarias.