Name: La determinación de supresión del sistema inmunológico frente a la protección del SNC para Intervenciones farmacológicas en la desmielinización autoinmune (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Aprende a diferenciar efectos inmunomoduladores de neuroprotectores en modelos de encefalomielitis autoinmune experimental usando citometría de flujo y análisis de tejido. Este método ayuda a desarrollar terapias para esclerosis múltiple.

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Este trabajo fue financiado por el NINDS-P30 NS069324, El Nacional de Esclerosis Múltiple SocietyRG 4587-A-1, La Fundación Internacional de Investigación Civitan, La Fundación Mike L. Jezdimir mielitis transversa, La Fundación Universidad de Alabama Servicios de Salud - Fondo General de Dotación, El Nacional Science Foundation 1355183 y T32 AI007051 del Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas de los Institutos nacionales de Salud.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Los pacientes con EM continúan experimentando recaídas de la enfermedad mientras esté tomando medicamentos que atenúan la activación y / o infiltración de células T en el SNC, lo que justifica el desarrollo de opciones de tratamiento que protegen directamente el sistema nervioso central. EAE clásicamente se ha utilizado para modelar los síntomas de la EM y puede ser una herramienta poderosa en el estudio de la naturaleza de las interacciones entre el sistema inmune y sistema nervioso central in vivo. El uso de la sincronización de las consideraciones de tratamiento en EAE, por ejemplo, antes o después de la iniciación de la enfermedad, en conjunción con el examen de la infiltración de células inmunes en el SNC y la proliferación y activación en la periferia, es posible delimitar los efectos de los tratamientos tanto en el sistema inmune y el SNC. Mientras EAE en el ratón C57BL / 6 se utiliza más ampliamente, EAE en el ratón SJL puede ser más representativa de la mayoría de los casos de EM, ya que estos ratones tienen un fenotipo de recaída-remisión y la infiltración de células inmunes en el parénquimadel cerebro 10. ratones SJL tienen clara recuperación durante la remisión, así, por lo que es posible comenzar el tratamiento después de la enfermedad se ha presentado, pero en tiempos de disminución de la inflamación. Es importante tener en cuenta que los ratones SJL no siempre recaída y remitir en sincronía, lo que resulta en potencialmente gran variabilidad cuando los resultados se agruparon. Por lo tanto, algunos investigadores pueden optar por mostrar resultados representativos de las puntuaciones clínicas de un animal, teniendo ratones para el análisis FACS e histología en los puntos individualizados en la progresión de la enfermedad. Teniendo en cuenta cuando se realizan manipulaciones a ratones EAE puede ayudar en la determinación de cómo un tratamiento afecta al sistema inmune o del SNC. Hay muchas opciones para cuando comience el tratamiento, cada una con su connotación de si las células inmunes han entrado en el sistema nervioso central y la forma en que puede estar interactuando con el sistema nervioso central. Tratamiento antes de inicio de los síntomas implica que las células inmunes aún no han entrado o causado daños en el sistema nervioso central.El tratamiento después de la aparición de los síntomas implica que las células inmunes han entrado en el sistema nervioso central y han causado algún daño. Utilizando ratones SJL, el tratamiento también puede comenzar durante una recaída, donde las células inmunes se están infiltrando en forma activa y causando inflamación, o durante la remisión, donde las células inmunes pueden ser menos frecuente en el SNC con menos inflamación. hipótesis iniciales con respecto a cómo los tratamientos afectan el sistema nervioso central y el sistema inmunológico se pueden hacer cuando se considera en donde las células inmunes están en el proceso patológico durante el tratamiento. Hay un número de maneras en las que los tratamientos pueden afectar a las células inmunes y la CNS, cada uno con el resultado final de la reducción de severidad de los síntomas de EAE. Por lo tanto, es necesario el uso de análisis de citometría de flujo e inmunohistoquímica para examinar cómo las células inmunes se ven afectados en la periferia y el SNC, si las células inmunes han entrado en el sistema nervioso central, y cómo el sistema nervioso central reacciona al tratamiento. Mientras que el análisis de citometría de flujo de la médula espinal puede determinar el número de células hahe entrado en el sistema nervioso central en un momento dado, no se puede determinar que este efecto es debido al tráfico de célula inmune reducida a no ser que la proliferación de las células inmunes no se ve afectada en el bazo. Por lo tanto, es necesario analizar tanto el tejido periférico y el sistema nervioso central y determinar qué resultados significan mecánicamente cuando se comparan ambos tejidos. También es posible que los perfiles de actividad de las células inmunes a ser alterados por el tratamiento, por ejemplo con un interruptor en un perfil de células T helper pesada patógena a un perfil de células T reguladoras pesada. En cuanto a los marcadores para los diferentes tipos de células y la comparación de la expresión por ciento entre los animales tratados y no tratados tanto, es también una consideración importante. Un concepto emergente en la investigación MS sugiere que las células B desempeñan un papel importante en la desmielinización autoinmune. Esto se basa en estudios que muestran que las células B son necesarias para la reactivación de las células T 20. Este concepto se apoya en el éxito de los tratamientos como el rituximab, un anticuerpo contra CD20 expresionado en la superficie de las células B 21,22. Como lo demuestra el éxito de la ocrelizumab anticuerpo monoclonal en los ensayos clínicos, las drogas dirigidas a diferentes epítopos del antígeno CD20 pueden mejorar la eficacia de la terapéutica específica de células B-23. Una de las limitaciones de las técnicas presentadas aquí es que es posible que las células inmunitarias para entrar en el CNS, pero ser incapaces de viajar en el parénquima. La inmunohistoquímica se puede utilizar para detectar manguitos perivasculares de células inmunes y evaluar la distancia recorrida en el parénquima entre los animales tratados y no tratados. Otra posible limitación implica los efectos de la microbioma sobre la EAE patogénesis. Microbiota intestinal comensal puede influir mucho en la patogénesis de enfermedades 24; Por lo tanto, los ratones alojados en diferentes colonias e incluso en diferentes jaulas pueden tener grandes diferencias en la gravedad de la enfermedad. En consecuencia, es preferible siempre que sea posible utilizar los controles de la misma camada criados en la misma jaula paraexperimentos con EAE. Una nota final es que si se trata de forma experimental deseable eliminar los efectos de los cambios proliferativos de células inmunes en la periferia, es posible que se pueda hacer por medio de la inducción de la transferencia pasiva en lugar de la inducción activa descrita en este protocolo. La confirmación adicional para la neuroprotección se puede lograr utilizando un sistema de co-cultivo 11 para poner a prueba los mecanismos específicos de la muerte celular o a través del uso de ratones knockout condicional que permite la eliminación de las proteínas de forma selectiva en un tipo de célula. Además, para extender la exploración de agentes farmacológicos que son neuroprotectores, los marcadores de la transección axonal y la muerte neuronal deben ser incluidos. Otra área de importancia es la remielinización. axones lesionados son incapaces de mielinizar prestar más apoyo que las terapias neuroprotectoras deben ser una parte importante de las terapias de remielinización. Además, los axones no mielinizados son más vulnerables a las lesiones que myelinaaxones TED. Esto sugiere que cuando un axón se convierte en intervenciones terapéuticas desmielinizadas que promueven la remielinización oportuna impedirá la lesión axonal. Para estudiar estas posibilidades, otros modelos in vivo para la desmielinización y remielinización se pueden utilizar (es decir, cuprizone y lisolecitina). El método descrito en la presente memoria se centró en la evaluación de la neuroprotección mediante la cuantificación de la pérdida de mielina. Para la evaluación de la remielinización del número de células progenitoras, así como su capacidad para proliferar y madurar también sería importante investigar. Con la mención de estos modelos alternativos, se debe considerar también diferentes modelos de encefalitis que están mediadas por virus. Hay dos modelos virales de ARN bien caracterizados que producen la pérdida de la mielina: una es la encefalomielitis murina de Theiler, un virus sin envoltura Picornaviridae, y el otro es el virus de hepatitis de ratón, un miembro de la familia del virus Coronaviridae 25,26. La EAE es una herramienta valiosa para studies de cómo manipulaciones o tratamientos afectan el sistema inmune y el sistema nervioso central in vivo. El protocolo descrito aquí puede ayudar a determinar donde los tratamientos están afectando el proceso de la enfermedad, ya sea en la periferia, en la barrera sangre-cerebro, o en el SNC. No hay tratamientos actuales para la EM curan la enfermedad y los pacientes a menudo experimentan declive en el tiempo. Del mismo modo, otras enfermedades que implican la infiltración de células inmunes en el SNC y la degradación de la mielina, incluyendo encefalomielitis diseminada aguda, mielitis transversa y la neuromielitis óptica, tratamientos falta que protegen el sistema nervioso central ya que está directamente bajo el ataque de la infiltración de células inmunes. Teniendo en cuenta el tiempo de tratamiento y el uso de análisis de citometría de flujo del bazo y la médula espinal en relación con la inmunohistoquímica de la CNS para evaluar la inflamación y el daño permitirá determinaciones mecanicistas ser realizados en relación con los tratamientos.

La esclerosis múltiple (MS) se caracteriza por lesiones inflamatorias predominantemente en las regiones de la materia blanca del cerebro en la enfermedad temprana. Después de progresión a largo plazo, gris atrofia de la materia se detecta mediante imágenes de resonancia magnética y marca la fase neurodegenerativa de la enfermedad. gliosis reactiva, desmielinización y daño axonal en la sustancia blanca se atribuyen a las células inmunes que infiltran el SNC. Ninguno de los tratamientos utilizados actualmente en MS revertir o prevenir la neurodegeneración directamente en el SNC - en cambio, reducir la inflamación mediante la atenuación de la activación de células T y / o la infiltración en el sistema nervioso central. Debido a que no existe una cura para la EM y los pacientes que usan tratamientos actuales continúan experimentando progresión de la enfermedad, los descubrimientos de fármacos que impiden la desmielinización y la pérdida neuronal son de importancia crítica. Sin embargo, diferenciar entre los efectos sobre las células inmunes y los de la CNS puede ser difícil experimentalmente, como el resultado - es decir, la reducción de daños en el SNC - ve los sAME independientemente de los mecanismos mediante los cuales se produce. Por lo tanto, la evaluación de la protección CNS debe asoció con evaluaciones de CNS-infiltración de células y la proliferación de las células inmunes inmunes en la periferia para determinar cómo afecta a los agentes farmacológicos mecanismos de la enfermedad. La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal bien establecido de trastornos inflamatorios autoinmunes que era directamente responsable del descubrimiento de fármacos utilizados actualmente para tratar la EM 1-4. Los ratones a menudo se utilizan para EAE, con ratones C57BL / 6 de ser una cepa popular basada en la disponibilidad de variantes genéticas. C57BL / 6 ratones inducidos con EAE exhiben progresión de la enfermedad crónica con inicio alrededor de 10 días después de la inducción. La infiltración del parénquima de la médula espinal y cerebelo son características de la histopatología de estos animales, con ausencia de infiltración en el parénquima cortical 5. lesiones Además, corticales y desmielinización en el blluvia son características de la enfermedad 6-9, que son relativamente ausente en ratones C57BL / 6. Por lo tanto, puede ser preferible cuando es posible utilizar ratones SJL, que tienen la enfermedad de recaída-remisión y lesiones encontradas en el cerebro y la médula espinal que parecen similares a los de MS 10. El tratamiento no puede ser clasificado como neuroprotector si las células inmunes nunca llegan al SNC. Por lo tanto, este protocolo hace uso de análisis de citometría de flujo de cerebro, médula espinal, y los bazos de ratones EAE para determinar los efectos del tratamiento sobre la infiltración de células inmunes en el SNC y la proliferación de células inmunes en la periferia, como se ha demostrado previamente 11. También se describen los análisis inmunohistoquímicos de tejido del SNC para determinar la extensión y naturaleza de la neuroprotección. La combinación de estos métodos permite la determinación de si las células inmunes se activan y proliferan en la periferia, si las células inmunes entraron en el CNS, y si el CNS era protected de la inflamación o daño. Si se sospecha de efectos neuroprotectores pesar de los efectos sobre el sistema inmune, los experimentadores pueden alterar el tratamiento se inicia veces después de la infiltración de células inmunes en ha producido el CNS. A continuación, presentamos un protocolo utilizando dos modelos diferentes de la EAE activo, un modelo animal mediada por células T de la EM, y citometría de flujo análisis combinado con técnicas de inmunohistoquímica en varios puntos de tiempo durante la enfermedad para determinar la eficacia de las terapias experimentales en diferentes aspectos de patogénesis de MS. Este método ayudará a los investigadores en la diferenciación entre los efectos sobre la proliferación de células inmunes y la infiltración frente a protección de CNS, por lo que es más fácil a reducir cómo fármacos actúan sobre la patogénesis de enfermedades.

<table><tbody><tr><td>Molde de incrustación de 22 x 22 x 20 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9719245</td><td></td></tr><tr><td>molde de incrustación de 22 x 30 x 20 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9531194</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol (55 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>2-Metilbutano</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3551-4</td><td></td></tr><tr><td>30 x 22 x 20 mm molde de incrustación</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-30</td><td></td></tr><tr><td>ACK Tampón de lisado</td><td>de calidad biológica</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>552775</td><td>0,2 mg/ml concentración de stock</td></tr><tr><td>anti-Foxp3-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5773-82</td><td>0,5 mg/ml concentración de stock</td></tr><tr><td>anti-GFAP (cóctel)</td><td>Biolegend</td><td>835301</td><td>1 - 3 mg/ml concentración de stock</td></tr><tr><td>anti-Iba-1 Anticuerpo policlonal (50 &#181; g)</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>0,5 mg/ml concentración de stock</td></tr><tr><td>anti-IFN-& gamma; APC</td><td>eBioscience</td><td>17-7311-82</td><td>0,2 mg/ml concentración de existencias</td></tr><tr><td>anti-IL-17A PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-7177-82</td><td>0,2 mg/ml concentración de existencias</td></tr><tr><td>anti-Ki-67 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5698-82</td><td>0,2 mg/ml concentración de existencias</td></tr><tr><td>anti-MBP (D-18)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-13912</td><td>0,2 mg/ml concentración de existencias</td></tr><tr><td>anti-TCR&beta; FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5961-85</td><td>0,5 mg/ml concentración de stock</td></tr><tr><td>anti-TCR&beta; PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5961-83</td><td>0,2 mg/ml</td></tr> concentración de stock <tr><td>Biotinilado Cabra Anti-Conejo IgG</td><td>Vector Labs</td><td>BA-1000</td><td>1,5 mg/ml</td></tr> concentración de stock <tr><td>Biotinilado Caballo Anti-Ratón IgG</td><td>Vector Labs BA-2000</td><td>&nbsp;</td><td>Concentración de caldo de 1,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Ácido cítrico, anhidro, 99,5 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC42356-5000</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sal tetrasódica dihidratada, 99 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC446085000</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio, caja de 10</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Golgi Plug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td>inhibidor del transporte de proteínas</td></tr><tr><td>Immedge Bolígrafo de barrera hidrofóbica</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9545623</td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>EMD Millipore</td><td>407952-5mg</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina, 100x</td><td>Corning</td><td>25-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoácidos No Esenciales</td><td>Corning</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Cerca de IR Vivo/Muerto Kit de tinción</td><td>Life Technologies</td><td>L10119</td><td>tinte</td></tr> de <tr><td>viabilidad Suero normal de cabra</td><td>Vector Labs</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Suero normal de caballo</td><td>Vector Labs</td><td>S-2000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído, 96%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC416785000</td><td></td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Cuidado de la salud</td><td>17-0891-01</td><td>gradiente de densidad</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500 medio de</td><td>montaje resinoso</td></tr><tr><td>Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)</td><td>Sigma</td><td>P1585-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de proteína básica antimielina purificado</td><td>BioLegend</td><td></td> 808401 <td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Corning</td><td>25-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek CRYO-OCT Compuesto</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>detergente no iónico</td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC Kit (Estándar)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9206402</td><td>avidina-biotina-peroxidasa&nbsp; complejo (ABC) en inmunoperoxidasa&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de sustrato de peroxidasa (DAB) de Vector</td> <td>LaboratoriesFisher Scientific</td><td>NC9276270</td><td>solución de DAB</td></tr></tbody></table>

la determinación de supresión del sistema inmunológico frente a la protección del snc para intervenciones farmacológicas en la desmielinización autoinmune

Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination

Un importante sello distintivo de la enfermedad desmielinizante autoinmune esclerosis múltiple (EM) es la infiltración de células inmunitarias en el cerebro y la médula espinal que resulta en la destrucción de la mielina, que no solo ralentiza la conducción de los impulsos nerviosos, sino que causa lesiones axonales que resultan en deterioro motor y cognitivo. Los tratamientos actuales para la EM se centran en atenuar la infiltración de células inmunitarias en el sistema nervioso central (SNC). Estos tratamientos disminuyen el número de recaídas, mejorando la calidad de vida, pero no eliminan completamente las recaídas, por lo que la discapacidad a largo plazo no mejora. Por lo tanto, se justifican los agentes terapéuticos que protegen el SNC. Tanto en modelos animales como en pacientes humanos con EM, la entrada de células T en el SNC generalmente se considera el evento inflamatorio iniciador. Para evaluar si un fármaco protege el SNC, se debe descartar cualquier efecto potencial sobre la infiltración o proliferación de células inmunitarias en la periferia. Este protocolo describe cómo determinar si la protección del SNC observada después de la intervención farmacológica es una consecuencia de la atenuación de las células inmunitarias infiltrantes del SNC o del bloqueo de la muerte de las células del SNC durante las agresiones inflamatorias. La capacidad de examinar los tratamientos para la EM que protegen el SNC durante las agresiones inflamatorias es muy crítica para el avance de las estrategias terapéuticas, ya que los tratamientos actuales reducen, pero no eliminan por completo, las recaídas (es decir, la infiltración de células inmunitarias), lo que hace que el SNC sea vulnerable a la degeneración.

Este protocolo describe cómo determinar si los tratamientos farmacológicos para la encefalomielitis autoinmune experimental muestran protección del SNC como consecuencia de la supresión de la infiltración de células inmunitarias o son neuroprotectores durante el ataque de la infiltración de células inmunitarias.

La determinación de supresión del sistema inmunológico frente a la protección del SNC para Intervenciones farmacológicas en la desmielinización autoinmune

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in ...

El objetivo general de este método conceptual es determinar si los tratamientos farmacológicos para la encefalomielitis autoinmune experimental demuestran su protección del sistema nervioso central durante el ataque de la infiltración de células inmunitarias o como consecuencia de la supresión de dicha infiltración. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología neural. Por ejemplo, cómo la manipulación de los tiempos de tratamiento de la EAE diferencia los efectos sobre la infiltración de células inmunitarias frente a la protección. Las implicaciones de esta técnica también se extienden hacia la terapia de la esclerosis múltiple, ya que actualmente no existen tratamientos neuroprotectores para esta enfermedad. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando descubrimos que tratar ratones con EAE con un inhibidor del transportador del sistema Xc- era tanto neuroprotector como inmunomodulador. Aunque este método puede utilizarse para estudiar tratamientos farmacológicos, también puede aplicarse a estudios que empleen ratones con deleción génica sometidos a EAE u otras manipulaciones.Comience utilizando tijeras estériles para picar los cerebros y médulas espinales de animales individuales en trozos pequeños. Luego, use un émbolo de jeringa de tres mililitros por tejido para machacar cada muestra sobre filtros celulares de 70 micrones individuales, depositándolos en tubos cónicos individuales de 50 mililitros, mientras enjuaga los filtros con medio. Una vez que todos los trozos hayan sido macerados, complete el volumen final en los tubos hasta 50 mililitros con medio fresco y luego centrifugue las suspensiones celulares.Re-suspender cada pellet en cuatro mililitros de solución de gradiente de densidad al 40%. A continuación, colocar cuidadosamente las células lentamente por las paredes de tubos cónicos individuales de 15 mililitros, encima de dos mililitros de solución de gradiente de densidad al 70% por tubo. Separar las células mediante centrifugación y utilizar pipetas de transferencia de un mililitro para descartar cuidadosamente las capas superiores de mielina.A continuación, transfiera las células viables desde las interfaces de la muestra hacia nuevos tubos cónicos de 15 mililitros y lave las células en un volumen final de 15 mililitros de medio fresco por tubo. Reuspenda los pellet en 200 microlitros de medio fresco y transfiera las suspensiones celulares a pozos individuales de una placa de fondo redondo de 96 pozos. Centrifugue la placa y deseche los sobrenadantes con un movimiento brusco.Luego, resuspenda los pellet en 200 microlitros de medio de restimulación e incube las células a 37 grados Celsius durante cuatro horas. Al final de la incubación, centrifugue nuevamente la placa y retire los sobrenadantes. A continuación, lave las células con 200 microlitros de PBS suplementado con 2% de FCS y resuspenda las células en 200 microlitros de PBS suplementado con 2% de FCS y bloqueador FC durante 10 a 15 minutos en hielo.Al final de la incubación, lave las células como se acaba de demostrar y re suspenda los pellet en 15 microlitros de una mezcla de tinción de superficie celular durante 15 minutos en hielo. Luego, centrifugue las células y lave las muestras dos veces en 200 microlitros de PBS. A continuación, re suspenda las células en los reactivos de tinción de factores de transcripción FOXP3 según las instrucciones del fabricante durante 30 minutos hasta toda la noche a 4 grados Celsius.Al final de la incubación, lave las células con 150 microlitros de tampón de permeabilización. Luego, centrifugue las células y re suspenda los pellets en los anticuerpos intracelulares de interés en 15 microlitros de tampón de permeabilización sobre hielo. Después de 30 minutos, centrifugue las células seguido de tres lavados con 200 microlitros de tampón de permeabilización.Después del último lavado, resuspenda los pellet en 200 microlitros de PBS y analice las muestras mediante citometría de flujo, seleccionando las células vivas positivas para CD4 y positivas para TCR beta. También es importante evaluar la proliferación de linfocitos T periféricos porque los cambios en la periferia pueden afectar la infiltración de células inmunitarias en el SNC. Para cuantificar el número de astrocitos y células gliales presentes en las muestras de tejido de la médula espinal después de la inducción de EAE, obtenga imágenes de cada sección con un aumento de 4x y guarde las imágenes como archivos TIFF.A continuación, en ImageJ, seleccione la imagen de interés y utilice la herramienta de selección poligonal para trazar toda la sección del tejido espinal. En el menú de imagen, seleccione tipo y 16 bits para convertir la imagen a 16 bits. Luego, abra el menú de procesamiento y seleccione sustraer fondo para establecer el radio de la bola rodante como mínimo al tamaño del objeto más grande que no forme parte del fondo.Verifique el paraboloide deslizante y haga clic en Aceptar. Luego, en imagen, seleccione ajustar y umbral, y use las barras deslizantes para establecer el nivel umbral inferior. Para obtener el porcentaje del área umbralizada dentro de la región seleccionada, en analizar y establecer mediciones, seleccione fracción de área. Asegúrese de que la opción limitar al umbral esté desmarcada y que la opción mostrar etiqueta esté marcada, y haga clic en Aceptar. Para obtener las mediciones, en analizar, seleccione medir.Aparecerá un cuadro emergente con los resultados. Guarde estos datos y compare los valores de fracción de área entre los grupos de tratamiento. Para cuantificar la tinción básica de mielina por densidad óptica, abra la imagen de interés y utilice la herramienta de secciones poligonales para dibujar una región de interés dentro de la muestra.En analizar y establecer mediciones, seleccione el valor medio de gris y confirme que la opción limitar al umbral esté desactivada y que la opción mostrar etiqueta esté activada. Haga clic en Aceptar. Luego, en el menú analizar, seleccione medir. Aparecerá un cuadro emergente de resultados con los datos del valor medio de gris de la proteína básica de la mielina.La extracción de la médula espinal y el análisis citométrico de flujo permiten evaluar la infiltración de células inmunitarias en el sistema nervioso central, donde la infiltración celular inmunitaria alcanza su máximo en el pico de la enfermedad. El análisis estadístico del número de células positivas para CD4, positivas para interferón gamma, positivas para IL-17 y positivas para FOXP3 puede revelar la significancia de los cambios observados en el número de linfocitos T infiltrantes CD4-positivos en animales tratados con fármacos, en comparación con animales control, siendo esencial un análisis detallado de coexpresión para descartar sesgos como factor de confusión en la reducción general del número de linfocitos T infiltrantes CD4-positivos. Para eliminar la posibilidad de que la reducción de linfocitos T infiltrantes en el sistema nervioso central sea consecuencia de la inhibición de la proliferación, activación y diferenciación en la periferia, se puede evaluar el número de linfocitos T en proliferación activa y la proporción de subtipos de linfocitos T.Para la evaluación cuantitativa de la integridad de la mielina, se puede realizar un análisis estadístico de la densidad óptica de la tinción de la proteína básica de la mielina, lo que revela una desmielinización significativa del tejido de la médula espinal en animales con knockout genético no especificado en comparación con sus camadas de tipo silvestre, por ejemplo. Para respaldar aún más si la neuroinflamación se mantiene o disminuye mediante intervenciones terapéuticas, también se puede evaluar la gliosis reactiva midiendo la fracción media del área para la gliosis reactiva, tal como se acaba de demostrar. Una vez dominada, la técnica de citometría de flujo puede completarse en dos días si se realiza adecuadamente, mientras que la cuantificación de la tinción del tejido puede realizarse en aproximadamente dos horas por cada tinción.La inmunomodulación puede evaluarse introduciendo los tratamientos antes de la infiltración de células inmunitarias para cuantificar los cambios migratorios y proliferativos en las células T. La protección del SNC puede evaluarse introduciendo los tratamientos durante el pico de la enfermedad, cuando las células inmunitarias ya han infiltrado el SNC. Al realizar este procedimiento, es importante recordar evaluar los ajustes óptimos de umbral en ImageJ para resaltar específicamente la tinción celular.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar los efectos de tratamientos específicos sobre el sistema nervioso central, la proliferación de linfocitos T y las respuestas de migración. Al modificar los tiempos de tratamiento antes y después de la infiltración de células inmunitarias.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Ciertas cepas de ratón son capaces de resistir la inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) con proteína básica de mielina. Aquí se describe es un protocolo de inmunización simple que invierte la falta de respuesta e induce la enfermedad paralítica en varios típicas manchas de EAE de ratón resistentes.

Superar la falta de respuesta en encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) cepas de ratones resistentes a través de transferencia adoptiva y la estimulación antigénica

Una nueva preparación ex vivo para obtener imágenes de la médula espinal de ratón. Este protocolo permite la formación de imágenes de dos fotones de las interacciones celulares en vivo a lo largo de la médula espinal.

De dos fotones de imágenes de Dinámica Celular en la médula espinal de ratón

Las enfermedades desmielinizantes se pueden modelar en animales mediante la aplicación focal de lisolecitina en el SNC. Una sola inyección de lisolecitina en la médula espinal del ratón produce una lesión que se repara espontáneamente con el tiempo. El objetivo es estudiar los factores implicados en la desmielinización y la remielinización, y probar agentes para mejorar la reparación.

Experimental La desmielinización y remielinización de la Médula Espinal murino por inyección Focal de lisolecitina

Este manuscrito describe los métodos para la inducción y puntuación del modelo experimental de encefalomielitis autoinmune (EAE), junto con la evaluación de la distribución de células inmunitarias y los niveles de citocinas de ARNm en ganglios linfáticos, bazo, sangre y médula espinal mediante citometría de flujo y PCR cuantitativa, respectivamente, en varias fases de la enfermedad.

La inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental en ratones y evaluación de la distribución de la enfermedad dependiente de las células inmunes en diversos tejidos

Aquí, presentamos los protocolos para investigar el deterioro de la unidad neurovascular durante la encefalomielitis autoinmune experimental en vivo. Específicamente abordamos cómo determinar permeabilidad de la barrera blood - brain y gelatinasa actividad involucrada en la migración de leucocitos a través de la glía INCURVATA4.

Visualizar el deterioro de las barreras endoteliales y Glial de la unidad Neurovascular durante la encefalomielitis Autoinmune Experimental In Vivo

Este manuscrito presenta un protocolo para inducir la encefalomielitis autoinmune experimental activa (EAE) en ratones. También se presenta un método para el aislamiento y caracterización de los linfocitos infiltrados en el sistema nervioso central (SNC) para mostrar cómo los linfocitos participan en el desarrollo de la enfermedad autoinmune del SNC.

Análisis citométrico de flujo de infiltración de linfocitos en el sistema nervioso central durante la encefalomielitis autoinmune experimental

El presente protocolo describe la inducción de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón utilizando glicoproteína oligodendrocitos de mielina y monitoreando el proceso de la enfermedad utilizando un sistema de puntuación clínica. Los síntomas experimentales relacionados con la encefalomielitis autoinmune se analizan mediante análisis de tomografía microcomputarizada de fémur de ratón y prueba de campo abierto para evaluar el proceso de la enfermedad de manera integral.

Inducción y diversos indicadores de evaluación de la encefalomielitis autoinmune experimental

El presente protocolo describe una inyección de dos puntos de lisofosfatidilcolina a través de un marco estereotáxico para generar un modelo de desmielinización estable y reproducible en ratones.

Una inyección de dos puntos establecida de manera estable de modelo de desmielinización focal inducida por lisofosfatidilcolina en ratones

Hasta la fecha, los protocolos para el aislamiento simultáneo de todos los principales tipos de células residentes en el sistema nervioso central del mismo ratón son una demanda insatisfecha. El protocolo muestra un procedimiento aplicable en ratones con encefalomielitis autoinmune naïve y experimental para investigar redes celulares complejas durante la neuroinflamación y, al mismo tiempo, reducir el número de ratones requerido.

Aislamiento simultáneo de los principales tipos de células residentes en el sistema nervioso central de ratones adultos con encefalomielitis autoinmune

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) sirve como modelo animal de esclerosis múltiple. En este artículo se describe un enfoque para la puntuación de la inflamación, desmielinización y lesión axonal de la médula espinal en EAE. Además, se presenta un método para cuantificar los niveles de luz de neurofilamentos solubles en el suero de ratones, lo que facilita la evaluación de la lesión axonal en ratones vivos.

Puntuación de la inflamación del sistema nervioso central, la desmielinización y la lesión axonal en la encefalomielitis autoinmune experimental

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal de esclerosis múltiple (EM), que comparte con la enfermedad humana una respuesta autoinmune humoral robusta. En este trabajo presentamos un protocolo ELISA sencillo y flexible para cuantificar autoanticuerpos en el suero de ratones inmunizados con EAE.

Cuantificación de anticuerpos autorreactivos en ratones tras encefalomielitis autoinmune experimental

Aprende a diferenciar efectos inmunomoduladores de neuroprotectores en modelos de encefalomielitis autoinmune experimental usando citometría de flujo y análisis de tejido. Este método ayuda a desarrollar terapias para esclerosis múltiple.

La determinación de supresión del sistema inmunológico frente a la protección del SNC para Intervenciones farmacológicas en la desmielinización autoinmune (Video) | JoVE Journal

La determinación de supresión del sistema inmunológico frente a la protección del SNC para Intervenciones farmacológicas en la desmielinización autoinmune

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