Name: Murino modelo experimental de desarrollo del tumor original y la metástasis peritoneal vía Ortotópico La inoculación con células de carcinoma de ovario (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Aprende a establecer un modelo murino de carcinoma de ovario mediante inoculación ortotópica para estudiar el desarrollo tumoral y la metástasis peritoneal. Este método permite analizar la diseminación metastásica en cáncer epitelial de ovario.

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Los autores agradecen a los miembros del Departamento de Obstetricia y Ginecología y Biología del Cáncer por sus útiles discusiones y asistencia técnica. Este estudio fue apoyado por una Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSP) subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica (15K15604; H. Kajiyama).

El protocolo de tratamiento se ajusta a las directrices para la experimentación con animales adoptada por la Universidad de Nagoya. 1. Preparación de las suspensiones celulares <ol><li> clara línea de ovario humano carcinoma de células. <ol><li> Mantener ES-2 células 12 en medio RPMI-1640 con 10% de suero bovino fetal (FBS) y penicilina / estreptomicina (penicilina: 100 unidades / ml, estreptomicina: 0,1 mg / ml). Células de cultivo a 37 ° C en un 5% de CO2 humidificada. </li><li> Recoger células en la fase de crecimiento logarítmico en 0,05% / 0,02% de solución de EDTA tripsina (tripsina / EDTA). <ol><li> En primer lugar, eliminar los viejos medios desde el recipiente de cultivo de células, a continuación, lavar las células una vez con PBS (PBS sin Ca2 + / Mg2 +, 3 - 4 ml por cada 25 cm 2). </li><li> A continuación, añadir 1 ml por cada 25 cm 2 de tripsina / EDTA. Girar el recipiente de cultivo celular para cubrir la monocapa de células con tripsina / EDTA. Después de retirar y desechar tripsina / EDTA, devolver la célularecipiente de cultivo a la incubadora durante 3-5 min o hasta que las células se separan. </li><li> Se examinan las células con un microscopio para asegurar que las células se separan de la superficie del recipiente de cultivo celular y flotante. </li><li> Añadir suero fresco que contiene medio de crecimiento para inactivar la tripsina (5 ml por 25 cm 2), y volver a suspender las células. Transferencia de las células resuspendidas a un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 5 min. Realizar centrifugación ya sea a 4 ° C o temperatura ambiente. Retirar con cuidado el sobrenadante y las células con medio de cultivo una nueva suspensión (5 ml por cada 25 cm2). </li></ol></li><li> Recuento de células (por ejemplo, por exclusión con azul de tripano) y luego volver a suspender en medio de crecimiento a una densidad de 2 x 10 8 células / ml. Poner las células suspendidas en el hielo. </li></ol></li><li> Descongelar la matriz extracelular congelada (ECM) a base de hidrogel alícuotas en un baño de hielo. </li><li> Añadir la suspensión celular a alícuotas de hidrogel a base de ECM en una proporción de 1: 1 (final de la celda concentración: 1 x 10 5 células / l de hidrogel a base de medio-ECM) y mezclar bien. Colocar las suspensiones de células preparadas en un baño de hielo hasta su uso. </li></ol> 2. ortotópico La inoculación con suspensiones celulares NOTA: cirugía no requiere un conjunto dedicado. La cirugía se puede realizar en una mesa de trabajo de laboratorio en un área de la habitación que está separado y tiene una actividad mínima. Una campana laminar también se puede utilizar. instrumentos quirúrgicos estériles se deben utilizar tijeras y no deben ser utilizados para hacer incisiones en la piel. <ol><li> Utilizar ratones desnudos hembra (BALB / c nu / nu) a las 8 semanas de edad para este modelo ortotópico de la inoculación. </li><li> En primer lugar, anestesiar el ratón de usar la inhalación con isoflurano (2-4%). Comprobar la profundidad anestésica mediante la comprobación de falta de abstinencia cuando se pizca dedo del pie firme. Después se anestesia el ratón, aplicar una pomada oftálmica estéril sosa para los ojos para evitar el secado según sea necesario. </li><li> Coloque el ratón anestesiado en una operacing etapa del vientre hacia abajo. Desinfectar el área quirúrgica varias veces con alcohol y un exfoliante a base de clorhexidina a base de yodo o. </li><li> Se practica una incisión de 2 cm ~ verticalmente cerca de la columna vertebral entre el arco costal derecho y el fémur. Utilice un paño quirúrgico estéril alrededor de la incisión. Fijar las superficies de la piel incisas con abrazaderas para mantener la abertura. Nota: Los retractores pueden utilizarse en lugar de abrazaderas. </li><li> A continuación, hacer una segunda incisión (aproximadamente 1 cm) en el peritoneo parietal en virtud de la primera incisión para abrir la cavidad abdominal. Sujetar las superficies abdominales incisas. Clip el tejido graso que rodea el tubo de Falopio y ovario ipsilateral con una abrazadera para eliminar el ovario de la cavidad abdominal. Con cuidado, coloque el ovario y la trompa de Falopio en gasa. A continuación, colocar el vientre del lado del ratón bajo el microscopio de disección. </li><li> Coloque la suspensión de células en una jeringa de insulina (1/2 cc, 29 G) justo antes de la inyección. inyectar cuidadosamente la suspensión celular preparada (1- 2 l) en el ovario. Para varios sec, retener la aguja dentro del ovario para asegurar la gelificación del hidrogel a base de ECM. Después de la gelificación, las células tumorales inyectadas permanecen en el interior del ovario. </li><li> Con cuidado, devolver el ovario en el cuerpo. Suturar la segunda incisión con la seda médica estéril, y luego sellar la piel con grapas para heridas. </li><li> Después de la cirugía, los ratones se administrarán una analgesia (por ejemplo, el meloxicam, intramuscular (im) o subcutánea (sc), 0,2 mg / kg) para el período de 24 hr inicial. </li></ol> 3. El tratamiento post-quirúrgico <ol><li> Coloque cada ratón en una jaula separada sobre papel limpio con una compresa caliente para mantener caliente el ratón hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. A continuación, volver a los animales a sus jaulas para la cría y el seguimiento. Monitorear los ratones diariamente durante 3 - 7 días después del tratamiento quirúrgico. </li><li> El seguimiento de los ratones postoperatorio <ol><li> En caso de signos de dolor, administrar analgesics diaria (por ejemplo, el meloxicam, im o sc, 0,2 mg / kg). </li><li> Si los ratones tienen signos de infección (por ejemplo, enrojecimiento, hinchazón, secreción), administrar una inyección diaria con un reactivo anti-infeccioso (por ejemplo, la penicilina, im, 100.000 UI / kg). </li></ol></li><li> Retire los materiales de cierre cutáneo 10 - 14 días después del tratamiento post-quirúrgico. </li></ol> 4. Análisis de tumores y metástasis NOTA: El tumor se formó en los inyectados ovario de 2 - 3 semanas después de la inoculación. <ol><li> Sacrificar los ratones mediante dióxido de carbono, y luego recoger las muestras (por ejemplo, tumores, metástasis, órganos) 13-15 para su posterior análisis 14,16-20. NOTA: Si un sistema de imágenes in vivo está disponible, las células que llevan enzimas que producen bioluminiscencia (por ejemplo, luciferasa) o la proteína fluorescente (por ejemplo, GFP) se pueden utilizar en este protocolo. Este protocolo modificado proporcionará información útil parala dinámica de la propagación de las células cancerosas del tumor primario. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los modelos animales son esenciales para analizar los mecanismos de desarrollo del tumor, progresión, metástasis, y la eficacia del fármaco contra las células cancerosas. Los ratones con células de cáncer de ovario humano también se han utilizado como un modelo animal. A continuación, describimos un procedimiento menos invasivo para la administración de células tumorales de ovario en un sitio ortotópico. Usando este procedimiento, la inoculación en el ovario a través de un enfoque retroperitoneal desde el flanco dorsal ...

El carcinoma de ovario epitelial (EOC) representa la mayor tasa de mortalidad por cáncer en las neoplasias ginecológicas 1. COE se asocia con un mal pronóstico, debido principalmente al retraso de su sintomatología, y con frecuencia se asocia con múltiples diseminaciones intraperitoneal y metástasis a distancia 2-4. diseminación peritoneal es un proceso de múltiples pasos. En primer lugar, las células tumorales se desprenden de las lesiones primarias, y migran hacia la cavidad abdominal. Cuando las células tumorales se unen a la mesotelio peritoneal, empiezan a invadir los tejidos a través del mesotelio 5,6. Con el fin de entender mejor la biología del tumor (por ejemplo, la progresión del cáncer y la respuesta terapéutica), modelos de ratón proporcionan una gran cantidad de información. Un xenoinjerto con células de cáncer humano es ampliamente utilizado para modelos de ratones en los que se inoculan células de cáncer humano por vía subcutánea, por vía intraperitoneal, por vía intravenosa, y ortotópicamente. Un modelo animal con una forma ortotópica gtumor techo elevado puede generar de manera más eficiente y con precisión los resultados que reflejan el entorno de tumor en seres humanos en comparación con un modelo animal con un tumor heterotópicamente injertado. Por lo tanto, para muchos tumores humanos, los modelos de trasplante ortotópico se han establecido 7-11. A continuación, describimos la inoculación ortotópico de células EOC humanos mediante un enfoque retroperitoneal desde el flanco dorsal, que ha de invasión limitada en comparación con la inoculación ventral. Esta técnica puede proporcionar una variedad de información útil sobre EOC, especialmente el mecanismo de difusión intraperitoneal.

<table><tbody><tr><td>Matriz Matrigel &nbsp;</td><td>BD</td><td>354234</td><td>Jeringa de insulina de hidrogel a base de ECM</td></tr><tr><td></td><td>TERUMO</td><td>SS-05M2913</td><td>1/2 cc, 29 G x 1/2"</td></tr> <tr><td>Aguja de sutura con sutura</td><td></td><td></td><td>11 mm, 3/8, Nylon6-0</td></tr><tr><td>Reflex 7 mm Aplicador de clip para heridas</td><td>CellPoint Scientific</td><td>204-1000</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Pinzas para heridos, Reflex, 7 mm,</td><td>CellPoint Scientific</td><td>203-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

murino modelo experimental de desarrollo del tumor original y la metástasis peritoneal<em&gt; vía</em&gt; ortotópico la inoculación con células de carcinoma de ovario

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

El carcinoma de ovario epitelial (EOC) se asocia con un mal pronóstico, ya que muestra la diseminación peritoneal. Para mejorar el pronóstico, es importante para controlar la diseminación peritoneal. Sin embargo, todavía no está claro cómo las células tumorales se desprenden de las lesiones primarias y se unen a la mesotelio. Se necesita el establecimiento de un modelo animal apropiado para obtener una comprensión del mecanismo de la difusión peritoneal in vivo. En el estudio actual, se introduce el proceso de la inyección local de células EOC en la superficie del ovario murino para el desarrollo de metástasis, incluyendo el peritoneo y órganos distantes. Se utilizaron ratones desnudos hembra (BALB / c nu / nu) a las 8 semanas de edad. Bajo un campo microscópico de vista, las células EOC (1 x 10 5 células / l de matriz-medio extracelular (ECM) a base de hidrogel / ovario unilateral / ratón) se inyectaron en ovarios murinos a través de un enfoque retroperitoneal desde el flanco dorsal. Este método propuesto es un ficheross procedimiento invasivo para el ratón y minimiza el daño al ovario. A continuación, describimos los pasos metodológicos en el desarrollo de la formación del tumor original y metastásico del COE.

<html> Seis ratones desnudos tenían sus ovarios inoculados con la línea celular de carcinoma de células claras humana ES-2, tal como se describe en este protocolo. Como se muestra en la Figura 1A, después de 2 semanas, 5 de los 6 ratones tenían un tumor en el ovario inoculado con ES-2 células, pero no había tumor en el ovario contralateral sin inoculación (utilizado como control). Además, 2 de los 5 ratones mostraron múltiples diseminaciones peritoneales con ascitis. Las ...

Para aclarar el proceso de múltiples etapas de diseminación peritoneal de carcinoma de ovario, el estudio actual presenta un modelo experimental murino de desarrollo del tumor original y la metástasis peritoneal a través de la inoculación ortotópico con estas células tumorales.

Murino modelo experimental de desarrollo del tumor original y la metástasis peritoneal<em&gt; vía</em&gt; Ortotópico La inoculación con células de carcinoma de ovario

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

El objetivo general de este procedimiento es observar el desarrollo de la formación de tumores originales y metastásicos en el carcinoma de ovario epitelial. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la oncología ginecológica, como comprender la biología tumoral o la diseminación peritoneal. La principal ventaja de esta técnica es que la inoculación ortopédica de carcinoma epitelial de ovario humano, o células EOC, se realiza mediante un enfoque retroperitoneal cultivado en el flanco dorsal. Para preparar una línea celular de carcinoma de células claras de ovario humano, siembre y mantenga las células ES2 en medio RPMI-1640 con 10% FBS y PenStrep a 37 grados Celsius y 5% CO2. En la fase de crecimiento logarítmico, retire el medio antiguo del cultivo y use de tres a cuatro milímetros de PBS para lavar las células una vez. A continuación, agregue un milímetro de tripsina/EDTA y agite suavemente el recipiente para cubrir toda la monocapa. Retire y deseche la solución de tripsina y devuelva las células al incubador durante tres a cinco minutos. Tras examinar las células bajo el microscopio para asegurarse de que se han desprendido y están flotando, agregue cinco milímetros de medio de crecimiento fresco que contenga suero para inactivar la tripsina y volver a suspender las células antes de transferirlas a un tubo cónico de 15 milímetros. Centrifugue la suspensión a 300 veces G y temperatura ambiente

murine-experimental-model-original-tumor-development-peritoneal

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Ortotópico modelos animales de cáncer de ovario reproducir mejor las enfermedades humanas y por lo tanto, mejorar nuestra comprensión de la progresión del cáncer y la respuesta del tumor a la terapia. Un modelo de ratón recibe una inyección intrabursal de luciferasa que expresan las células tumorales de ovario. El tratamiento se administra a través de una sonda nasogástrica. El crecimiento del tumor está controlado...

En vivo de imágenes y tratamientos terapéuticos en un modelo de ratón ortotópico de cáncer de ovario

Un modelo ortotópico de cáncer de ovario seroso en ratones inmunocompetentes para In vivo Imágenes y seguimiento de tumores de las respuestas inmunitarias del tumor

En este video, demostramos el desarrollo de un modelo tridimensional in vitro del revestimiento de la cavidad peritoneal. Este cultivo organotípico puede ayudar a investigar la adhesión, invasión y proliferación de las células de cáncer de ovario.

Modelado de la metástasis del cáncer de ovario en el revestimiento de la cavidad peritoneal: un método para establecer un modelo 3D in vitro del revestimiento peritoneal

En este video, demostramos la inyección intrauterina de células de cáncer de ovario en un modelo de ratón. Este modelo ortotópico murino nos ayuda a monitorizar de forma no invasiva el crecimiento tumoral y a evaluar la eficacia de nuevas terapias para la prevención y el tratamiento del cáncer de ovario recurrente.

Inyección intrauterina de células cancerosas: una técnica para administrar células cancerosas para establecer un modelo de ratón de cáncer de ovario intraperitoneal

Este video describe el protocolo para crear un modelo experimental murino para estudiar el desarrollo tumoral y la metástasis peritoneal. Este modelo de cáncer de ovario se genera mediante la inoculación ortotópica de células epiteliales de cáncer de ovario humano en los ovarios de una ratón.

Inoculación ortotópica de células de cáncer de ovario en ovarios murinos: un procedimiento para establecer un modelo de ratón de cáncer de ovario para estudiar la diseminación peritoneal de las células

Describimos una plataforma de imágenes animales no invasiva que permite la detección, cuantificación y seguimiento del crecimiento y la recurrencia del cáncer de ovario. Este modelo de xenoinjerto intraperitoneal imita el perfil clínico de las pacientes con cáncer de ovario.

Modelo murino de imagen no invasivas para detectar y vigilar cáncer ovárico de Recurrencia

La metástasis del cáncer de ovario se caracteriza por numerosas lesiones intraperitoneales difusas, por lo que la cuantificación visual precisa de la carga tumoral es un desafío.  En este trabajo describimos un método para la cuantificación in situ y ex vivo de la carga tumoral metastásica utilizando células tumorales marcadas con proteína fluorescente roja (RFP) e imágenes ópticas.

La cuantificación de la intra-peritoneal del cáncer ovárico Metástasis

El presente protocolo describe la inyección de células de osteosarcoma intratibia para generar modelos de ratón con osteosarcoma ortotópico y lesiones de metástasis pulmonar.

Inyección de células de osteosarcoma intratibial para generar osteosarcoma ortotópico y metástasis pulmonar modelos de ratón

Este protocolo describe el establecimiento de un modelo ex vivo tridimensional (3D) de la interacción entre la célula cancerosa y el epiplón. El modelo proporciona una plataforma para dilucidar los mecanismos protumorales dentro del nicho adiposo y para probar nuevas terapias.

Un modelo ex vivo de metástasis peritoneal de cáncer de ovario con epiplón humano

Este manuscrito describe el desarrollo de un modelo animal que permite probar directamente los efectos de la hipoxia tumoral sobre la metástasis y descifrar los mecanismos de su acción. Aunque los experimentos que se describen aquí se centran en el sarcoma de Ewing, se puede aplicar un abordaje similar a otros tipos de tumores.

Modelo In Vivo para Pruebas Efecto de la hipoxia sobre la metástasis tumoral

Aprende a establecer un modelo murino de carcinoma de ovario mediante inoculación ortotópica para estudiar el desarrollo tumoral y la metástasis peritoneal. Este método permite analizar la diseminación metastásica en cáncer epitelial de ovario.

Murino modelo experimental de desarrollo del tumor original y la metástasis peritoneal vía Ortotópico La inoculación con células de carcinoma de ovario (Video) | JoVE Journal

Murino modelo experimental de desarrollo del tumor original y la metástasis peritoneal

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