El análisis automatizado de C. elegans Comportamiento de la nadada El uso de software Célest
7 de diciembre de 2016
Se describe una metodología eficiente y simple para el análisis computarizado de comportamiento natatorio nematodos en líquido. El método requiere poca o ninguna inversión para C. elegans laboratorios. El hardware utilizado es estándar, y los programas de ordenador para el análisis del comportamiento (Celeste) es un código abierto uno.
El objetivo general de esta metodología es evaluar cuantitativamente el comportamiento de natación de C.Elegans utilizando el software de visión por computadora llamado CeleST, para C.Elegans Swim Test"Este método de análisis puede ayudar a abordar el impacto de las mutaciones genéticas o las intervenciones farmacológicas en el comportamiento de natación de C.elegans. También puede marcar fácilmente la disminución de las capacidades locomotoras asociada a la edad. Las principales ventajas de esta técnica son que se puede rastrear a varios animales simultáneamente, con diferentes aspectos de la postura de natación analizados para puntuar ocho parámetros del comportamiento de natación y una evaluación automatizada de los datos.
Comience por obtener un microscopio estereoscópico y una cámara CCD digital, así como una computadora con software de grabación de video digital y software de visión por computadora para el análisis del comportamiento de natación de C. Elegans. Dentro del software de grabación de video digital, configure los siguientes ajustes:Cubra el microscopio con un paño oscuro para evitar el deslumbramiento en el área de la gota de natación en el portaobjetos del microscopio y mejorar la calidad de la imagen. Ajuste la distancia de trabajo y el aumento del microscopio a la vista completa del área de natación, y ajuste el espejo base para obtener un contraste nítido de los animales contra el fondo.
Luego, configure la iluminación en campo oscuro para visualizar los cuerpos de los adultos como blancos sobre un fondo negro. A continuación, pipetee 60 microlitros de 1 tampón M9 en un anillo de 10 milímetros, preimpreso en un portaobjetos de microscopio, y asegúrese de que la gota cubra completamente el área interior del anillo. Transfiera cuatro nematodos adultos a la gota de 1 tampón M9 mientras minimiza el transporte de bacterias que pueden enturbiar el líquido.
Minimice las bacterias en el pozo de natación permitiendo que los nematodos se arrastren brevemente en una región no asentada de la placa antes de ser transferidos, o mezclando ligeramente el pozo de natación para dispersar rastros de bacterias menores antes de registrar. A continuación, coloque el portaobjetos cargado con nematodos adultos en la base del microscopio para registrar su comportamiento de natación en líquido en videos de 30 segundos. Para grabar, seleccione Nueva secuencia en RAM bajo el encabezado Inicio, luego presione el botón rojo de grabación.
Finalmente, una vez completada la grabación, haga clic en el encabezado Inicio y seleccione Exportar secuencia completa, para fragmentar el video en una secuencia de fotogramas de imagen. Comience iniciando el software de visión artificial para el análisis del comportamiento de natación de C. elegans de Mat Lab haciendo clic en el botón Ejecutar. En la pantalla de inicio del programa de análisis de natación, use los botones Agregar un video "o Agregar varios videos" para cargar secuencias de fotogramas de imagen de uno en uno o en grupos mientras adjunta etiquetas relevantes, como genotipo, fecha, prueba y duración.
A continuación, haga clic en Procesar vídeos"para habilitar el seguimiento simultáneo de varios animales en las secuencias cargadas. En la nueva pantalla que aparece, seleccione los videos deseados en el cuadro de la izquierda y haga clic en Agregar a la lista"A continuación, demarque la zona de natación seleccionando tres puntos dentro del anillo e inicie el procesamiento haciendo clic en Procesar todos los videos enumerados anteriormente. Vea el progreso del procesamiento de video en la parte inferior central de la pantalla.
Una vez que se haya completado, cierre la pantalla de procesamiento de video. Comience haciendo clic en Calcular medidas" para abrir una nueva pantalla donde los videos procesados se pueden cargar uno a la vez para validar o rechazar el seguimiento de animales individuales. Utilice este paso manual para centrarse en las áreas de seguimiento omitido, que se muestran en los bloques rojos, y contrastar con el seguimiento correcto, que se indica en los bloques verdes.
Encuentre la validez del cuerpo segmentado" en la primera barra de color de la pantalla en la mitad inferior. Tenga en cuenta que el porcentaje de fotogramas válidos está en verde y el porcentaje de fotogramas rechazados está en rojo. A continuación, navegue y modifique los bloques de tramas válidas o rechazadas utilizando las opciones siguiente bloque, Cambiar validez "Bloque dividido" y Aislar trama".
En el raro caso de que dos animales se crucen en una zona de baño con poca gente, cambie sus números de identificación en un rango de fotogramas específico con el botón "Switch". Finalmente, haga clic en Guardar y calcular medidas" para guardar la entrada de validez antes de cargar otro video procesado. A continuación, seleccione "Cerrar" para salir de la pantalla Calcular medidas.
Tenga en cuenta que el software calcula mapas de curvatura del rendimiento de natación de animales individuales en el fondo, así como los ocho parámetros que se indican más adelante. En la pantalla de inicio del programa de software Computer Vision, haga clic en "Mostrar resultados" para obtener la salida del análisis. A continuación, cree grupos de muestras para el tratamiento estadístico seleccionando las secuencias de fotogramas analizadas deseadas en el cuadro de la izquierda y moviéndolas a un grupo de muestras existente más nuevo haciendo clic en los botones Añadir a la muestra seleccionada o Añadir a una nueva muestra.
Haga clic en Mostrar gráficos para estas muestras" para ir a una segunda pantalla que muestra los gráficos y las estadísticas clave de las muestras para cada uno de los ocho parámetros por selección en la parte superior de la pantalla. A continuación, seleccione Histogramas 2D "para trazar combinaciones de dos parámetros cualesquiera a través de los menús desplegables de medición en el eje X y medición en el eje Y a la izquierda de la pantalla. Haga clic en Cerrar" para salir y volver a la pantalla Mostrar resultados.
Luego, seleccione el botón de exportación en la parte superior izquierda de la pantalla para guardar datos numéricos detallados como un archivo csv para abrir y manipular aún más en un programa de hoja de cálculo. Finalmente, seleccione Cerrar "para salir de la pantalla Mostrar resultados" y volver a la pantalla de inicio. Haga clic en "Salir" para garantizar el almacenamiento de la base de datos que contiene las secuencias de video analizadas.
Ciertos parámetros de la natación, como la tasa de inicio de olas, el índice de actividad, la brazada de pincelada y la velocidad de desplazamiento, disminuyeron gradualmente con la edad, incluso en antecedentes genéticos favorables. Por otro lado, el número de ondas corporales, la asimetría, el estiramiento y los parámetros de rizado aumentaron con la edad en los adultos mutantes de tipo salvaje y envejecidos. Aunque todos los nematodos comienzan como adultos sanos, algunos pierden rápidamente su condición física, mientras que otros mantienen el vigor durante períodos de tiempo más largos, lo que indica que los ancianos malos tienen una duración de salud considerablemente más corta que los ancianos elegantes.
Una vez dominado, el análisis de cuatro gusanos nadadores se puede adquirir en cuestión de minutos. El cálculo tarda unos seis minutos por vídeo y se puede realizar de forma remota. Es factible procesar 250 animales por día.
Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo adquirir videos de pruebas de natación y procesar datos para obtener la evaluación de la locomoción en líquido.
Descripción general
Este artículo presenta una metodología sencilla para analizar el comportamiento de nado de C. elegans utilizando el software de código abierto CeleST. El enfoque es rentable y utiliza equipos de laboratorio estándar, lo que lo hace accesible para diversos entornos de investigación.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Análisis del comportamiento
- Genética
Antecedentes
- C. elegans es un organismo modelo ampliamente utilizado en estudios genéticos y conductuales.
- Comprender el comportamiento natatorio puede proporcionar información sobre los efectos de mutaciones genéticas e intervenciones farmacológicas.
- Los cambios relacionados con la edad en las capacidades locomotoras pueden evaluarse cuantitativamente.
- Las técnicas de visión por computadora mejoran la precisión del análisis conductual.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para evaluar cuantitativamente el comportamiento de natación de C. elegans.
- Evaluar el impacto de factores genéticos y ambientales en el comportamiento de natación.
- Facilitar el análisis de la disminución asociada con la edad en la locomoción.
Métodos Utilizados
- Uso de un microscopio estereoscópico y una cámara CCD digital para la grabación de video.
- Aplicación del software CeleST para rastrear y analizar el comportamiento natatorio.
- Grabación del comportamiento de nado en un entorno controlado con interferencia bacteriana mínima.
- Procesamiento de los datos de video para extraer parámetros conductuales clave y generar análisis estadísticos.
Resultados principales
- Se pueden rastrear múltiples C. elegans simultáneamente, lo que permite un análisis exhaustivo.
- Se observaron declives relacionados con la edad en ciertos parámetros de natación.
- Algunos nematodos mantuvieron la aptitud física más tiempo que otros, lo que indica variabilidad en el envejecimiento.
- El método permite un análisis rápido del comportamiento de natación, mejorando la eficiencia de la investigación.
Conclusiones
- El software CeleST proporciona una plataforma robusta para analizar el comportamiento de nado de C. elegans.
- Esta metodología puede contribuir significativamente a estudios sobre genética y envejecimiento.
- Las investigaciones futuras pueden aprovechar este enfoque para explorar más preguntas conductuales y fisiológicas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El análisis automatizado del comportamiento natatorio de C. elegans permite el cribado fenotípico de alto rendimiento para el descubrimiento de compuestos neuroactivos y la validación de dianas. Al cuantificar parámetros de locomoción en medio líquido, el método facilita la reducción de riesgos mecanicistas de intervenciones farmacológicas y genéticas en un sistema modelo escalable y reproducible. Este enfoque mejora la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al vincular las respuestas conductuales con la función de los circuitos neuronales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la valoración cuantitativa de la función neuromuscular en mutantes genéticos.
- Valor operativo: Apoya la reducción del riesgo biológico mediante el seguimiento simultáneo de ocho parámetros del comportamiento natatorio en cientos de animales.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al identificar compuestos que modifican la disminución asociada con la edad en la capacidad locomotora.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayos: Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo posteriores mediante la delimitación estandarizada de zonas de nado y el seguimiento automatizado.
- Resultados cuantitativos: Genera mapas de curvatura y ocho parámetros basados en la postura sin umbrales de corte, lo que permite una evaluación fiable de compuestos.
- Escalabilidad: Procesa 250 animales por día con cálculo remoto, facilitando la reutilización de la plataforma en múltiples campañas de cribado.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Relaciona los fenotipos del comportamiento de nado con modelos de envejecimiento y neurodegeneración mediante tendencias en parámetros relacionados con la edad.
- Continuidad traslacional: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica al mantener lecturas conductuales consistentes a través de diferentes flujos de trabajo.
- Avance ajustado al riesgo: Orienta las decisiones de continuar o no continuar al revelar fenotipos novedosos en fondos genéticos bien caracterizados.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la validación temprana del blanco hasta la identificación de compuestos activos, al proporcionar lecturas cuantitativas del comportamiento que aportan información para la comprensión mecanicista y la priorización de compuestos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante el análisis automatizado de la postura natatoria y la dinámica del movimiento.
- Selección: Ofrece disponibilidad para ensayos y reproducibilidad mediante el seguimiento simultáneo de múltiples animales y el procesamiento estandarizado de videos.
- Análisis: Proporciona resultados estadísticos y estadísticas clave para cada uno de los ocho parámetros, permitiendo comparaciones entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante la alineación de biomarcadores relacionados con la edad en las trayectorias de deterioro de la locomoción.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una capacidad reutilizable para la selección de comportamientos en múltiples proyectos y áreas terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos mediante la reducción de la ambigüedad mecanicista en la función neuromuscular.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad mediante evaluación automatizada de datos e intervención manual mínima.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción del desarrollo, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas mediante la desactivación temprana del riesgo fenotípico.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, basadas en umbrales cuantitativos de comportamiento natatorio.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de software de visión por computadora y en el manejo de C. elegans.
- Necesita un microscopio estereoscópico, una cámara CCD digital y una computadora con el software CeleST para la captura y análisis de videos.
- Exige la estandarización entre equipos en la delimitación de la zona de nado y en la etiquetación de los videos según genotipo, fecha, ensayo y duración.
- Incluye consideraciones de adaptación entre diferentes sistemas modelo debido a su dependencia de ensayos de locomoción en medio líquido.
- Presenta limitaciones prácticas, como la necesidad de minimizar la contaminación bacteriana en los pozos de nado para mantener la calidad de la imagen.
