La reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón con factores de transcripción para inducir un programa Hemogenic

El objetivo general de este protocolo de inducción hemogénica consiste en desencadenar un proceso de desarrollo en fibroblastos de ratón mediante la sobreexpresión de factores de transcripción para generar in vitro células precursoras hematopoyéticas que produzcan células hematopoyéticas tras un cultivo prolongado. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la programación hematopoyética, como si es posible desarrollar un protocolo para obtener de novo células madre hematopoyéticas auténticas (HSCs) capaces de diferenciarse en múltiples líneas y de ser trasplantadas. La principal ventaja de esta técnica radica en que, mediante la sobreexpresión de un número mínimo de factores de transcripción, puede iniciarse el proceso de desarrollo en células reprogramadas sin necesidad de pasar por un estado intermedio pluripotente.

Después de cultivar fibroblastos embrionarios de ratón o MEFs y producir el virus según el protocolo descrito, use gelatina al 0,1 por ciento en PBS para recubrir previamente placas de 6 pocillos. Asegúrese de que la gelatina cubra toda el área del pocillo. Coloque las placas en el incubador a 37 grados celsius durante al menos 20 minutos.

Luego, retire las placas y aspire la gelatina. Siembre los MEF con DMEM estándar a una densidad de 25.000 células por pocillo y permita que las células se asienten durante la noche a 37 grados centígrados. Prepare un cóctel viral de 100 microlitros mezclando 50 microlitros de M2RTTA y 12,5 microlitros de cada uno de GATA2, GFI1B, CFOS y ETV6.

Aspire el medio de los MEF y agregue dos mililitros de DMEM estándar con 8 microgramos por mililitro de bromuro de hexadimetrina. Luego, transduzca cada pocillo de MEF con 15 microlitros de la mezcla vírica e incube durante la noche a 37 grados centígrados. Tras 16 a 20 horas de incubación, reemplace el medio en cada pocillo con dos mililitros de DMEM estándar fresco, suplementado con un microgramo por mililitro de DOX.

Incubar a 37 grados Celsius durante tres días. En el día cuatro, preparar medio de cultivo hematopoyético suplementado con hidrocortisona, factor de células madre, ligando de tirosina quinasa tres relacionado con MFS, interleucina tres, interleucina seis y DOX. A continuación, aspirar el medio de los MEF y usar un mililitro de PBS para lavar las células.

Luego, después de aspirar el PBS, agregue un mililitro de tripsina al 0,05 por ciento por pocillo para disociar y recolectar las células. Cuente las células utilizando el hemocitómetro, luego centrifugue a 300 × g durante cinco minutos y use 12 mililitros del medio hematopoyético recién preparado para resuspender las células. A continuación, siembre 10 000 células por pocillo en placas de seis pocillos recubiertas con gelatina.

Cada seis días, cambie el medio por medio de cultivo hematopoyético suplementado fresco durante toda la duración del cultivo. Analice las células de acuerdo con el protocolo descrito en el texto. Después de diseccionar las placentas de ratones preñados según el protocolo descrito en el texto, use de dos a cinco mililitros de colagenasa tipo uno al 0,2 por ciento en PBS con 20 por ciento de FBS para lavar el tejido y, utilizando una aguja de calibre 18 acoplada a una jeringa de cinco mililitros, disocie mecánicamente el tejido en la solución de PBS.

Incube las células placentarias en dos a cinco mililitros de solución de colagenasa a 37 grados Celsius durante 1,5 horas. Luego, pase las células varias veces a través de agujas de calibre 20 a 25 acopladas a jeringas de 5 mililitros para disociarlas mecánicamente de forma adicional. A continuación, filtre las suspensiones de células individuales a través de filtros celulares de 70 micrones.

Luego, utilizando un hemocitómetro, cuente las células y irradie a 2.000 voltios centigray para la inactivación mitótica. Añada diez mililitros de medio de cultivo hematopoyético suplementado con lo siguiente a una placa de diez centímetros. Coloque el filtro de 0,65 micrones directamente sobre el medio de cultivo en la placa, permitiendo que flote para crear una interfase líquido-gas y deje la placa aparte.

Disociar los MEF transducidos del día 25 como se demostró anteriormente en este video y mezclar 33.000 de los MEF transducidos con 167.000 células de los agregados placentarios inactivados mitóticamente. Para generar un agregado, centrifugar la mezcla de células MEF y placentarias a 300 × g durante cinco minutos. Aspirar el medio y utilizar de 30 a 50 microlitros de DMEM estándar para resuspender las células sedimentadas, introduciendo la suspensión de células individuales en una punta de pipeta no biselada de 200 microlitros.

A continuación, tape la punta de la pipeta con una película de parafina. Luego, coloque la punta tapada en un tubo cónico de 15 mililitros y centrifúgelo a 300 ×g durante cinco minutos para que se forme un pellet en el extremo cubierto de la punta. Retire cuidadosamente la punta del tubo de 15 mililitros y colóquela en el extremo de una pipeta P200.

Deseche la película de parafina y expulse el botón celular sobre el filtro que flota en la placa con medio de cultivo. Cultive los agregados sobre los filtros flotantes a 37 grados Celsius y cinco por ciento de dióxido de carbono durante cuatro a cinco días. Mediante un raspador celular, recoja los agregados, combínelos y utilice colagenasa al 0,5 por ciento para digerirlos.

Después de la disociación, utilice de dos a cinco mililitros de PBS con cinco por ciento de FBS para lavar los agregados y centrifugue a 300 ×g durante cinco minutos. Re suspenda los agregados en 500 microlitros de DMEM sin FBS, Pen-Strep ni L-glutamina. Añada toda la suspensión a tres mililitros de medio de metilcelulosa al uno por ciento suplementado con diez nanogramos por mililitro de Tepo, evitando cuidadosamente la formación de burbujas.

Plaque volúmenes iguales de esta mezcla en tres placas de cultivo no tratadas de 35 por 10 milímetros para ensayos de UFC. Como control, cultive agregados placentarios irradiados. Finalmente, cuente manualmente las colonias hematopoyéticas bajo un microscopio después de 10 a 14 días de cultivo a 37 grados Celsius con 5 por ciento de dióxido de carbono.

En el proceso de reprogramación de MEFs a HSCs, las células se transducen con factores de transcripción como se muestra aquí. Después de tres días de expansión y exposición a DOX para iniciar la activación del transgén, las células se disocian, dividen y cultivan en placas recubiertas con gelatina y medio hematopoyético suplementado. En el día 20 en cultivo, tras la transducción con medio de reprogramación, los MEFs 34/H2BGFP adoptan cambios morfológicos evidentes, incluida una morfología endotelial distinta a la de los MEFs.

Un cultivo adicional hasta el día 35 da como resultado varias células redondeadas de tipo hematopoyético que emergen de los intermediarios de tipo endotelial, que son positivos para GFP y se tiñen positivos para los marcadores hematopoyéticos Sca1 y CD45. Un cultivo más prolongado da lugar a células que expresan CD45 mientras mantienen la expresión del reportero humano CD34. Tras la agregación placentaria, las células en cultivo adquieren potencial clonogénico y generan colonias en metilcelulosa que contienen diversas morfologías hematopoyéticas y células de tipo blasto.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar cada sección lentamente para no cometer errores. Cualquier equivocación será difícil de detectar hasta semanas después de comenzar la reprogramación. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como los ensayos de células formadoras de empedrado y los ensayos de células iniciadoras de cultivo a largo plazo, con el fin de responder preguntas adicionales, tales como si las células derivadas poseen verdaderamente función hematopoyética, tal como se demuestra en los ensayos funcionales.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la programación de células madre hematopoyéticas exploraran otras estrategias de reprogramación y protocolos de optimización en sangre, células endoteliales y otros tipos celulares. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir un programa hemogénico en fibroblastos de ratón, la sobreexpresión de factores de transcripción y cómo ensayar funcionalmente la célula derivada. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.