Name: La reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón con factores de transcripción para inducir un programa Hemogenic (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Aprende a inducir un programa hemogénico en fibroblastos embrionarios de ratón mediante la sobreexpresión de factores de transcripción para generar células precursoras hematopoyéticas in vitro.

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Este trabajo fue apoyado por una subvención del NHLBI a K.M. e I.R.L. (1RO1HL119404). Carlos-Filipe Pereira recibió una beca Revson Senior Biomedical Fellowship. Agradecemos al Centro de Recursos Compartidos de Mount Sinai hESC / iPSC y a S. D'Souza por su asistencia con materiales y protocolos. También agradecemos a las instalaciones de citometría de flujo, genómica y ratones de Mount Sinai.

declaración de la ética: líneas celulares de ratón se derivan siguiendo las pautas de cuidado de animales de la Escuela de Medicina de Icahn en el Monte Sinaí, y debe hacerse de acuerdo con cualquier institución de destino. 1. fibroblastos de embriones de ratón (MEF) Aislamiento de C57BL / 6 ratones <ol><li> Configurar el apareamiento cronometrado 13. Una vez que se visualiza un tapón vaginal, considere este Día 0,5. </li><li> Se separan las hembras enchufados en la fecha enchufe y comprobar en ellos el día 10-11 para confirmar el embarazo. </li><li> En el Día 13,5-14,5 eutanasia a los ratones hembras embarazadas mediante inhalación de CO 2 seguido por dislocación cervical. </li><li> Remojar embarazada abdomen femenino 70% de etanol, diseccionar la cavidad abdominal con tijeras estériles y fórceps abajo de la línea media, y retirar quirúrgicamente los cuernos uterinos que contienen los embriones 14. Sacar los embriones suavemente mientras cortando el tejido abdominal restante. NOTA: Recuperar aproximadamente 8 embriones con 4 en cada lado. </li><li> Coloque el útero hORNs que contienen los embriones en una placa de 10 cm con 5-10 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato fría (PBS). </li><li> Con tijeras y pinzas estériles, hará una incisión a lo largo de los cuernos uterinos para aislar los sacos que llevan los embriones. La transferencia de los sacos a una nueva placa de 10 cm con 5-10 ml de PBS estéril enfriado y colocar en hielo. </li><li> Colocar algunos de los sacos en una nueva placa de 10 cm con 5-10 ml de PBS enfriado estéril. Con unas tijeras estériles y fórceps de corte suavemente abierto los sacos (sin cortar demasiado profundo) con el fin de evitar la perforación de los embriones. </li><li> Separar los embriones de la placenta por cortar el cordón umbilical. </li><li> La transferencia de los embriones a una nueva placa de 10 cm que contiene 5-10 ml de PBS enfriado en hielo y dejar al completar las disecciones restantes. </li><li> Decapitar a los embriones utilizando pinzas estériles. Corte con cuidado por la línea media del embrión utilizando tijeras y pinzas estériles, a partir de la zona decapitado a abrir el abdomen. Posición fórceps debajo tque los órganos viscerales (incluyendo el corazón, el hígado y los pulmones) y raspar a cabo 15. </li><li> Cortar el tejido restante en trozos pequeños con unas tijeras y fórceps y transferir a un tubo cónico de 50 ml que contiene 10 ml de tripsina. </li><li> Pipetear arriba y abajo con una pipeta de 10 ml 20-30 veces para mezclar y se disocia el tejido. </li><li> Incubar el tejido y la mezcla de tripsina en un baño de agua a 37 ° durante 45 min, agitando de vez en cuando. </li><li> Pipetear arriba y abajo con una pipeta de 10 ml durante aproximadamente 5 minutos para mezclar el contenido. </li><li> Añadir células tripsinizadas a 3x volumen de estándar de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 10% (FBS), 10 mg / ml de penicilina / estreptomicina (P / S), y 1 mM de L-glutamina (L-GLUT) en platos de 10 cm (~ 10 ml) y cultivo a 37 ° C hasta la confluencia (aproximadamente 2-4 días). Cultura acerca de 1-2 embriones por placa de 10 cm. NOTA: una vez las células Freeze placas son confluentes. Las células congeladas se pueden descongelar y se pasaron 2 veces más. Las células pueden ser, alternativamente,dividir 2 veces antes de la congelación, y luego una vez más después de ser descongelados. </li></ol> 2. Producción viral <ol><li> Expandir las células 293T en placas con 10 ml de DMEM con 10% FBS, 1% P / S, y 1% de L-GLUT para la transfección de 10 cm. <ol><li> Trypsinize células 293T con 2 ml de tripsina, se incuba a 37 ° C durante 5 min, recoger las células en tubos de 15 ml, vuelta a 300 xg, y la placa de forma apropiada (10 ml por placa de 10 cm). </li></ol></li><li> 24 horas antes de la transfección, se dividió confluentes 10 cm placa de células 293T 1: 6 y semillas en 10 cm recubierto de gelatina (gelatina al 0,1% en PBS) placas. NOTA: Se requieren 4 placas por el virus. <ol><li> Para placas de capa en gelatina, añadir por lo menos 2 ml de la solución de gelatina al 0,1% para cubrir el fondo de placas de 10 cm. Incubar a 37 ° C durante al menos 20 min. Aspirar la gelatina antes de la adición de las células a las placas. </li></ol></li><li> En un tubo de 15 ml, añadir 84 g de plásmido (por ejemplo GATA2, Gfi1b, cFos o ETV6 (sub-clonado en el vect pFUW-tetoo 16) o FUW-M2rtTA 17), 84 mg psPAX2, y 42 mg pMD2.G. Se añade agua (H2O) para compensar el volumen de 2 ml. Preparar un tubo para cada factor (por ejemplo. GATA2, Gfi1b, directores financieros, ETV6 y FUW-M2rtTA). </li><li> Añadir 250 l de 2 M CaCl 2 a cada tubo que contiene la mezcla 2 ml compuesta de 84 g del gen elegido (GATA2, Gfi1b, cFos, ETV6 o FUW-M2rtTA) + 84 g psPAX2 + 42 g pMD2.G + H 2 O . </li><li> Con una pipeta Pasteur insertado en la pipeta auxilios, la liberación de burbujas en el 2,25 ml de ADN + H 2 M CaCl mezcla de O + 2 2. A medida que las burbujas se producen, colocar la punta de un P1000 contra la pipeta de vidrio y lentamente expulsar 2 ml de 100 mM de N, N-bis (2-hidroxietil) -2-aminoetano solución salina de ácido sulfónico (BES) por la pipeta Pasteur 1 ml a la vez. </li><li> Incubar todos los tubos en la campana de cultivo a temperatura ambiente durante al menos 15 min. NOTA: La mezcla de 4,25 ml (ahora ADN + H2O + 2 M de CaCl2 </sub&gt; + BES solución salina) se verá ligeramente nublado. </li><li> A medida que la mezcla se incuba, medios de aspirado placas 293T despegue y añadir 10 ml de DMEM + 10% FBS + 1 mM de L-glutamina + 25 nM cloroquina. NOTA: Este medio no contiene P / S. </li><li> Después de al menos 15 min de incubación (o hasta que el cambio de medios de comunicación en las células 293T), añadir el 4,25 ml de ADN + H 2 O + 2 M CaCl 2 + BES mezcla de solución salina gota a gota a las células 293T, distribuyendo de manera uniforme a través de 4 placas de células por tubo (es decir, ligeramente más de 1 ml de la mezcla por plato). </li><li> Incubar las placas durante la noche (O / N) a 37 ° C. </li><li> 24 horas después de la incubación, en lugar de los medios de comunicación en todas las placas con 4 ml de DMEM estándar (véase el paso 1.15). </li><li> Mantener las células en una incubadora a 32 ° a partir de ahora. </li><li> 24 horas después del paso 2.10, recogen los medios de comunicación independientes en tubos de 50 ml. Reemplazar los medios recogidos de cada placa con 4 ml de DMEM estándar. NOTA: 4 placas por los resultados iniciales de la mezcla del tubo en 16 ml de medio recogido. <ol><li> UNespués de 12 horas de la incubación, recoger soporte de nuevo en los mismos tubos de 50 ml y reemplazar con otros 4 ml de DMEM estándar. </li><li> Después de 12 horas de incubación, recoger los medios de comunicación y añadir a los mismos tubos de 50 ml. NOTA: cada tubo debe contener ahora unos 48 ml de medio que contiene virus. </li></ol></li><li> Para concentrar el virus recogido, primer filtro de los medios recogidos a través de filtros de 0,45 M de unión bajas en proteínas. </li><li> Verter los medios filtrados que contienen virus en tubos de centrífuga concentración viral (alrededor de 16 ml a la vez). </li><li> Giran a 4000 xga 4 ° C durante 25 min y retirar de flujo a través. NOTA: Un pequeño volumen de medios concentrados y el virus será visible en el filtro. </li><li> Añadir otros 16 ml de medio que contiene el virus se filtró para el volumen de medio + virus concentrado que queda en el filtro y se mezcla invirtiendo el tubo. </li><li> tubo de centrifugado a 4.000 xga 4 ° C durante 25 minutos y el descarte de flujo continuo. </li><li> Agregue el resto se filtracolección para los medios de comunicación volumen concentrado + virus queda en el filtro y se mezcla invirtiendo el tubo. </li><li> Girar una vez más en 4000 xga 4 ° C durante 10 a 20 min (dependiendo del volumen en el filtro) y asegúrese de que el volumen restante de concentrado medios + virus que queda en el filtro es de aproximadamente 1 ml. Si es mayor que 1 ml de concentrado de medios + virus permanece en el filtro, girar de nuevo a 4.000 xg durante 1 min y repetir hasta que se deja de 1 ml en el filtro. </li><li> Alícuota de 200 l de virus concentrado en tubos de 1,5 ml y se congelan a -80 ° C o usar inmediatamente. </li></ol> 3. La reprogramación MEF <ol><li> Pre-capa 6 placas de pocillos con 0,5 ml de gelatina al 0,1% en PBS por pozo, asegurando que la gelatina cubre toda el área del pozo. Colocar en una incubadora a 37 ° C y se incuba durante al menos 20 min. Después de la incubación, retirar las placas y aspirar la gelatina. </li><li> MEFs placa con DMEM estándar a una densidad de 25.000 células por pocillo (150.000 célulaspor placa de 6 pocillos) en la placa de 6 pocillos gelatinizada (s) de la etapa 3.1 y dejar reposar hasta la O / N en una incubadora a 37ºC. </li><li> Preparar un cóctel de virus de 100 l mediante la mezcla de 50 l M2rtTA y los restantes 50 l de una mezcla de GATA2, Gfi1b, directores financieros, y ETV6 (12,5 l cada una). </li><li> Aspirar los medios de MEFs y añadir 2 ml de DMEM estándar con 8 mg de bromuro de hexadimetrina / ml. </li><li> Transducir cada pocillo de las placas MEF con 15 l de cóctel de virus e incubar O / N a 37 ° C. NOTA: Este es el Día 0 del proceso de reprogramación. </li><li> En el Día 1, después de 16-20 horas de incubación, sustitución de los medios con 2 ml de DMEM estándar fresco suplementado con 1 mg / ml DOX por pocillo. </li><li> Preparar medios de cultivo hematopoyético complementado con hidrocortisona (10 -6 M), 100 ng / ml de factor de células madre (SCF), 100 ng / ml Fms relacionadas con tirosina quinasa 3 ligando (Flt3L), 20 ng / ml de interleucina-3 (IL- 3), 20 ng / ml de interleucina-6 (IL-6), y 1 mg / ml DOX. </li><li> En el Día 4 aspirate medios de cada pocillo y lavar las células con 1 ml de PBS por pocillo. </li><li> Aspirar PBS, se disocian las células utilizando 1 ml de tripsina al 0,05% por pocillo y recoger las células. </li><li> Recuento de células con un hemocitómetro, centrifugado a 300 xg durante 5 min, se resuspenden en 12 ml de medio hematopoyéticas descrito en la etapa 3.7 y la placa 60.000 células por placa de 6 pocillos en placas recubiertas de gelatina 0,1% (2 ml por pocillo, 10.000 células por pocillo ). </li><li> Reemplazar los medios con medio de cultivo fresco complementado hematopoyético cada 6 días durante la duración del cultivo (35 a 36 días). </li><li> Analizar cualquiera de las células intermedias o emergentes células hematopoyéticas similares a través de inmuno-tinción 12, análisis FACS 8,12, QRT-PCR 12, y la secuencia de ARNm 12 para confirmar la adquisición de hemogenic endotelial o marcadores HSC-como y la expresión génica. </li></ol> 4. La formación de la unidad (CFU) Los ensayos de agregación de la placenta y de colonias en metilcelulosa <ol><li> Diseccionar las placentas de embarazadas C5/ 6 ratones 7BL descrito previamente 18 en E12.5 y mantener el tejido en hielo. </li><li> Para iniciar la disociación placenta 19, lavado de tejido de la placenta en 2-5 ml de 0,2% de colagenasa tipo I en PBS con 20% de SFB y disociar mecánicamente con una aguja 18G montado en una jeringa de 5 ml haciendo pasar la placenta y PBS a través de la aguja, al menos, 3 veces. </li><li> Después de disociación mecánica, mantener las células placentarias en 2-5 ml de solución de colagenasa a 37 ° C durante 1,5 horas. </li><li> células paso a través de las agujas 20-25 g preparado en jeringas de 5 ml varias veces para más disociar mecánicamente las células de la placenta. </li><li> Filtro de suspensiones de células individuales a través de 70 micras coladores celulares. </li><li> Contar las células con un hemocitómetro y irradiar a 2000 cGy para la inactivación mitótica 20. </li><li> Añadir 10 ml de medio de cultivo hematopoyético suplementado con 100 ng SCF / ml, 100 ng ml Flt3L /, 20 ng / ml de IL-3, 20 ng / ml de IL-6, y 10 ng / trombopoyetina ml (TPO) a una 10 cm plato. NOTA: DOX no se requiere en esta etapa. </li><li> Colocar un filtro de 0,65 micras directamente en medios de cultivo hematopoyético en el plato, lo que le permite flotar para crear una interfaz de gas-líquido y fijar el plato a un lado. </li><li> Disociar día 25 MEFs transducidas (derivados de paso 3,11) como se describe en los pasos 3.8-3.10 y mezclar 33000 de los MEFs transducidas con 167.000 células de los agregados de la placenta de la etapa 4.6 (relación 1: 6). </li><li> Para generar un agregado 18,21, primera vuelta por la MEF y la mezcla de células de la placenta de la etapa 4.9 durante 5 minutos a 300 x g. Aspirar los medios de comunicación y resuspender las células sedimentadas en 30 a 50 l de DMEM estándar utilizando una pipeta P200, dibujo de la suspensión de células individuales en el 200 l punta de la pipeta nonbevelled. </li><li> Ocluir la punta de la pipeta con la película de parafina. Coloque la punta bloqueado en un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugar durante 5 minutos a 300 xg por lo que se forma un pellet en el extremo cubierto de la punta. </li><li> Retire la punta del tubo de 15 ml con cuidado y lugarla punta en el extremo de la pipeta P200. Desechar la película de parafina y extruir el sedimento de células en el filtro flotante desde el paso 4.8. NOTA: La placa como máximo 3 agregados por filtro. </li><li> La cultura de los agregados en las flotantes 0,65 micras filtros para 4-5 días en 37 ° C con 5% de CO2. </li><li> Recoger los agregados (como máximo 3 por filtro) con un raspador de células, combinarlos, y digerir con 0,2% de colagenasa, siguiendo el mismo protocolo que realiza con todo el placentas para disociar las células (pasos 4.2 a 4.5). </li><li> Después de la disociación, lavar los agregados con 2-5 ml de PBS suplementado con FBS al 5% y centrifugar las células a 300 xg durante 5 min. </li><li> Volver a suspender los agregados en 500 l de DMEM sin FBS, P / S, o L-GLUT. Tome este 500 l resuspensión y añadirlo a los medios de metilcelulosa 3 ml 1% suplementado con 10 ng / ml de TPO, evitando cuidadosamente la formación de burbujas. Placa volúmenes iguales de esta mezcla en placas de cultivo de 3 35 x 10 mm no tratado paraEnsayos de UFC 12. </li><li> Como control, la cultura irradió agregados de la placenta sin mezclar en MEFs reprogramadas 4-5 días y el lugar en ensayos de CFU como se describió anteriormente en los pasos 4.7-4.16. NOTA: Estos agregados solos no forman colonias. </li><li> Recuento de las colonias hematopoyéticas manualmente bajo el microscopio después de 10-14 días de cultivo a 37 ° C con 5% de CO 2. </li><li> Cytospin 22 recogió colonias para mostrar el fenotipo morfológico de células individuales. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.

Generación de HSPCs de novo a partir de células somáticas fácilmente alcanzables ofrece un método único para estudiar la hematopoyesis in vitro, y la oportunidad de aplicar esta tecnología potencialmente para el sistema humano. Esta traducción generaría una nueva herramienta para estudiar la enfermedad hematológica humano en un plato, así como proporcionar las plataformas de pruebas de drogas y la orientación de genes oportunidades para tratar numerosos trastornos con nuevas terapias o transplantes de ...

La hematopoyesis es un proceso de desarrollo complejo en el que las células madre hematopoyéticas (HSC) brote fuera endotelio hemogenic presente en una variedad de sitios hematopoyéticas embrionarias tales como la aorta-gónada-Mesonefros y la placenta 1,2. La incapacidad de la cultura HSCs in vitro impide el análisis en profundidad de este proceso, así como la aplicación clínica de estos estudios. Para evitar esta limitación, los estudios anteriores han intentado derivar HSCs de novo ya sea a través de la diferenciación de células pluripotentes madre (PSC) 3, o plasticidad inducida en las células somáticas y diferenciación dirigida usando medios de reprogramación 4,5. Estos estudios, sin embargo, no generan células engraftable clínicamente seguras o permiten el estudio de la hematopoyesis definitiva del desarrollo &quot;en un plato.&quot; La novela de trabajo establecido por Yamanaka y sus colegas para generar células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) a partir de fibroblastos somática provides un marco para el factor de transcripción (TF) las estrategias basadas en la sobreexpresión de la reprogramación de células suerte 6,7. Este trabajo ha llevado a los investigadores en varios campos para generar tipos de células de elección a través de la reprogramación de las células somáticas TF fácilmente obtenibles. El objetivo de la estrategia de reprogramación se describe aquí es inducir un proceso hemogenic a partir de células somáticas de ratón utilizando un enfoque reprogramación basado TF con el objetivo de trasladar estas conclusiones al sistema humano para reprogramar fibroblastos específicos del paciente con el fin de estudiar la hematopoyesis humana in vitro y generar productos sanguíneos específicos del paciente para el modelado de la enfermedad, las pruebas de drogas, y el trasplante de células madre. El primer paso para asegurar la reprogramación adecuada en este sistema de ratón fue desarrollar una línea reportero que sirvió como una lectura para la expresión de CD34, un marcador conocido en las células progenitoras endoteliales y células madre hematopoyéticas. Para ello, las líneas de ratones transgénicos huCD34-TTA y teto-H2BGFP se utilizaron para gfibroblastos enerate dobles de ratón transgénico embrionarias (MEFs), ahora denotados 34 / H2BGFP, que presentan fluorescencia verde después de la activación del promotor de CD34 8. Esto permitió la detección de una variedad de TFS sabe que son necesarios en diferentes puntos durante la especificación y el desarrollo hematopoyético. Comenzando con 18 TFS en pMX vectores retrovial (determinados a través de la literatura minera y el perfilado de la etiqueta GFP retener las HSC de la anteriormente descrita 34 ratones / H2BGFP), 34 / H2BGFP MEFs fueron transducidas con todos los factores y se cultivan en AFT024 HSC-apoyar las células del estroma. Después de la detección de 34 activación / H2BGFP, TFS se retiraron posteriormente de la reprogramación cóctel hasta que se identificó el conjunto óptimo de TFS para la activación de reportero. Después de esta pantalla inicial, los factores se transfirieron a un sistema de vector inducible pFUW DOX para permitir la expresión controlable de la TFS. Dado que estos dos sistemas controlables DOX son incompatibles (las 34 células / H2BGFP y los vectores inducibles pFUW), MEFs deSe requiere C57BL / 6 ratones de tipo salvaje. También era necesario para proporcionar un microambiente apropiado para permitir hemogenesis proceder y crear progenitores clonogénicos multilinaje. Los estudios actuales que tratan de reprogramar células somáticas en células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPCs) se han reunido variados niveles de éxito 9-11. Hasta la fecha, la generación de ratón y humanos con HSPCs trasplantables a largo plazo y la capacidad de repoblación de auto-renovación no se ha conseguido utilizando el mismo conjunto de TFS. En este protocolo, se realiza una descripción detallada de la estrategia previamente establecida para inducir de forma reproducible hemogenesis en MEFs. Se demuestra que la introducción de un conjunto mínimo de TFS (GATA2, Gfi1b, directores financieros, y ETV6) es capaz de instigar un programa complejo de desarrollo in vitro que proporciona una plataforma en la que la hematopoyesis en el desarrollo y aplicación clínica de reprogramación hematopoyéticas pueden ser estudiados más a fondo 12.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; Filtros M</td> Filtros centrífugos <td>Corning</td><td>430625</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini's Benchmark</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de 18 G</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de 20 G</td><td>BD</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de 25 G</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa Tipo I</td><td>Sigma</td><td>C0130-100MG</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Medios Myelocult</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>M5300</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>R & D Systems</td><td>455-MC</td><td></td></tr><tr><td>Flt3L</td><td>R & D Systems</td><td>427-FL</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>R & D Systems</td><td>403-ML</td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>R & Sistemas</td><td>D 406-ML</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>R & D Systems</td><td>488-TO</td><td></td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>Sigma</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Polibreno (bromuro de hexadimetrina)</td><td>Sigma</td><td>AL-118</td><td></td></tr><tr><td>Durapore 0.65 &mu; Filtros de membrana M</td><td>Millipore</td><td>DVPP14250</td><td></td></tr><tr><td>medios de metilcelulosa</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>Methocult M3434</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Tecnologías de células madre 07904</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 ratones</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G-1890 100g</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO</td><td>Addgene</td><td>plásmido #20321</td><td></td></tr><tr><td>Gata2</td><td>Origene</td><td>MR226728</td><td></td></tr><tr><td>Gfi1b</td><td>Origene</td><td>MR204861</td><td></td></tr><tr><td>cFos&nbsp;</td>Plásmido <td>Addgene</td><td>#19259</td><td></td></tr><tr><td>Etv6</td><td>Origene</td><td>MR207053</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td></td><td>Plásmido Addgene #12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td></td><td>Plásmido Addgene #12259</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670-100g</td><td></td></tr><tr><td>FUW-M2rtTA</td><td>Plásmido Addgene #20342</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm cultivo platos</td><td>Thermo Scientific</td><td>171099</td><td></td></tr></tbody></table>

la reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón con factores de transcripción para inducir un programa hemogenic

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Este protocolo detalla la inducción de un programa hemogénico en fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) a través de la sobreexpresión de factores de transcripción (TFs). Primero diseñamos una pantalla reportera utilizando MEFs de ratones transgénicos dobles CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) humanos. Las células CD34+ de estos ratones marcan las histonas H2B con GFP y dejan de marcarse tras la adición de doxiciclina (DOX). Las MEFS se transducieron con TFs candidatas y luego se observaron para detectar la aparición de células GFP+ que indicarían la adquisición de un destino de células hematopoyéticas o endoteliales. A partir de 18 TFs candidatos, y a través de un proceso de eliminación combinatoria, obtuvimos un conjunto mínimo de factores que inducirían el mayor porcentaje de células GFP+. Descubrimos que Gata2, Gfi1b y cFos eran necesarios y que la adición de Etv6 proporcionó la inducción óptima. Una serie de análisis de expresión génica realizados en diferentes momentos durante el proceso de reprogramación revelaron que estas células parecían pasar por una célula precursora que experimentó una transición endotelial a hematopoyética (EHT). Como tal, este proceso de reprogramación imita la hematopoyesis del desarrollo "en un plato", lo que permite el estudio de la hematopoyesis in vitro y una plataforma para identificar los mecanismos que subyacen a esta especificación. Esta metodología también proporciona un marco para la traducción de este trabajo al sistema humano con la esperanza de generar una fuente alternativa de células madre hematopoyéticas (HSC) específicas del paciente para una serie de aplicaciones en el tratamiento y estudio de enfermedades hematológicas.

La hematopoyesis es un proceso complejo del desarrollo que se inicia en varios sitios embrionarias. Células endoteliales Hemogenic residen en estos sitios y dan lugar a través de las CMH de células en ciernes 23. Este proceso actualmente no puede ser reproducido mediante la colocación de HSCs o precursores hematopoyéticos en cultivo, lo que exige una metodología para obtener de alguna manera estas células in vitro, ya sea por HSPC expansión ex vivo o la gener...

El protocolo descrito aquí detalla la inducción de un programa hemogénico en fibroblastos embrionarios de ratón a través de la sobreexpresión de un conjunto mínimo de factores de transcripción. Esta tecnología puede trasladarse al sistema humano para proporcionar plataformas para futuros estudios de la hematopoyesis, la enfermedad hematológica y el trasplante de células madre hematopoyéticas.

La reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón con factores de transcripción para inducir un programa Hemogenic

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

El objetivo general de este protocolo de inducción hemogénica consiste en desencadenar un proceso de desarrollo en fibroblastos de ratón mediante la sobreexpresión de factores de transcripción para generar in vitro células precursoras hematopoyéticas que produzcan células hematopoyéticas tras un cultivo prolongado. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la programación hematopoyética, como si es posible desarrollar un protocolo para obtener de novo células madre hematopoyéticas auténticas (HSCs) capaces de diferenciarse en múltiples líneas y de ser trasplantadas. La principal ventaja de esta técnica radica en que, mediante la sobreexpresión de un número mínimo de factores de transcripción, puede iniciarse el proceso de desarrollo en células reprogramadas sin necesidad de pasar por un estado intermedio pluripotente.Después de cultivar fibroblastos embrionarios de ratón o MEFs y producir el virus según el protocolo descrito, use gelatina al 0,1 por ciento en PBS para recubrir previamente placas de 6 pocillos. Asegúrese de que la gelatina cubra toda el área del pocillo. Coloque las placas en el incubador a 37 grados celsius durante al menos 20 minutos.Luego, retire las placas y aspire la gelatina. Siembre los MEF con DMEM estándar a una densidad de 25.000 células por pocillo y permita que las células se asienten durante la noche a 37 grados centígrados. Prepare un cóctel viral de 100 microlitros mezclando 50 microlitros de M2RTTA y 12,5 microlitros de cada uno de GATA2, GFI1B, CFOS y ETV6.Aspire el medio de los MEF y agregue dos mililitros de DMEM estándar con 8 microgramos por mililitro de bromuro de hexadimetrina. Luego, transduzca cada pocillo de MEF con 15 microlitros de la mezcla vírica e incube durante la noche a 37 grados centígrados. Tras 16 a 20 horas de incubación, reemplace el medio en cada pocillo con dos mililitros de DMEM estándar fresco, suplementado con un microgramo por mililitro de DOX.Incubar a 37 grados Celsius durante tres días. En el día cuatro, preparar medio de cultivo hematopoyético suplementado con hidrocortisona, factor de células madre, ligando de tirosina quinasa tres relacionado con MFS, interleucina tres, interleucina seis y DOX. A continuación, aspirar el medio de los MEF y usar un mililitro de PBS para lavar las células.Luego, después de aspirar el PBS, agregue un mililitro de tripsina al 0,05 por ciento por pocillo para disociar y recolectar las células. Cuente las células utilizando el hemocitómetro, luego centrifugue a 300 × g durante cinco minutos y use 12 mililitros del medio hematopoyético recién preparado para resuspender las células. A continuación, siembre 10 000 células por pocillo en placas de seis pocillos recubiertas con gelatina.Cada seis días, cambie el medio por medio de cultivo hematopoyético suplementado fresco durante toda la duración del cultivo. Analice las células de acuerdo con el protocolo descrito en el texto. Después de diseccionar las placentas de ratones preñados según el protocolo descrito en el texto, use de dos a cinco mililitros de colagenasa tipo uno al 0,2 por ciento en PBS con 20 por ciento de FBS para lavar el tejido y, utilizando una aguja de calibre 18 acoplada a una jeringa de cinco mililitros, disocie mecánicamente el tejido en la solución de PBS.Incube las células placentarias en dos a cinco mililitros de solución de colagenasa a 37 grados Celsius durante 1,5 horas. Luego, pase las células varias veces a través de agujas de calibre 20 a 25 acopladas a jeringas de 5 mililitros para disociarlas mecánicamente de forma adicional. A continuación, filtre las suspensiones de células individuales a través de filtros celulares de 70 micrones.Luego, utilizando un hemocitómetro, cuente las células y irradie a 2.000 voltios centigray para la inactivación mitótica. Añada diez mililitros de medio de cultivo hematopoyético suplementado con lo siguiente a una placa de diez centímetros. Coloque el filtro de 0,65 micrones directamente sobre el medio de cultivo en la placa, permitiendo que flote para crear una interfase líquido-gas y deje la placa aparte.Disociar los MEF transducidos del día 25 como se demostró anteriormente en este video y mezclar 33.000 de los MEF transducidos con 167.000 células de los agregados placentarios inactivados mitóticamente. Para generar un agregado, centrifugar la mezcla de células MEF y placentarias a 300 × g durante cinco minutos. Aspirar el medio y utilizar de 30 a 50 microlitros de DMEM estándar para resuspender las células sedimentadas, introduciendo la suspensión de células individuales en una punta de pipeta no biselada de 200 microlitros.A continuación, tape la punta de la pipeta con una película de parafina. Luego, coloque la punta tapada en un tubo cónico de 15 mililitros y centrifúgelo a 300 ×g durante cinco minutos para que se forme un pellet en el extremo cubierto de la punta. Retire cuidadosamente la punta del tubo de 15 mililitros y colóquela en el extremo de una pipeta P200.Deseche la película de parafina y expulse el botón celular sobre el filtro que flota en la placa con medio de cultivo. Cultive los agregados sobre los filtros flotantes a 37 grados Celsius y cinco por ciento de dióxido de carbono durante cuatro a cinco días. Mediante un raspador celular, recoja los agregados, combínelos y utilice colagenasa al 0,5 por ciento para digerirlos.Después de la disociación, utilice de dos a cinco mililitros de PBS con cinco por ciento de FBS para lavar los agregados y centrifugue a 300 ×g durante cinco minutos. Re suspenda los agregados en 500 microlitros de DMEM sin FBS, Pen-Strep ni L-glutamina. Añada toda la suspensión a tres mililitros de medio de metilcelulosa al uno por ciento suplementado con diez nanogramos por mililitro de Tepo, evitando cuidadosamente la formación de burbujas.Plaque volúmenes iguales de esta mezcla en tres placas de cultivo no tratadas de 35 por 10 milímetros para ensayos de UFC. Como control, cultive agregados placentarios irradiados. Finalmente, cuente manualmente las colonias hematopoyéticas bajo un microscopio después de 10 a 14 días de cultivo a 37 grados Celsius con 5 por ciento de dióxido de carbono.En el proceso de reprogramación de MEFs a HSCs, las células se transducen con factores de transcripción como se muestra aquí. Después de tres días de expansión y exposición a DOX para iniciar la activación del transgén, las células se disocian, dividen y cultivan en placas recubiertas con gelatina y medio hematopoyético suplementado. En el día 20 en cultivo, tras la transducción con medio de reprogramación, los MEFs 34/H2BGFP adoptan cambios morfológicos evidentes, incluida una morfología endotelial distinta a la de los MEFs.Un cultivo adicional hasta el día 35 da como resultado varias células redondeadas de tipo hematopoyético que emergen de los intermediarios de tipo endotelial, que son positivos para GFP y se tiñen positivos para los marcadores hematopoyéticos Sca1 y CD45. Un cultivo más prolongado da lugar a células que expresan CD45 mientras mantienen la expresión del reportero humano CD34. Tras la agregación placentaria, las células en cultivo adquieren potencial clonogénico y generan colonias en metilcelulosa que contienen diversas morfologías hematopoyéticas y células de tipo blasto. Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar cada sección lentamente para no cometer errores. Cualquier equivocación será difícil de detectar hasta semanas después de comenzar la reprogramación. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como los ensayos de células formadoras de empedrado y los ensayos de células iniciadoras de cultivo a largo plazo, con el fin de responder preguntas adicionales, tales como si las células derivadas poseen verdaderamente función hematopoyética, tal como se demuestra en los ensayos funcionales.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la programación de células madre hematopoyéticas exploraran otras estrategias de reprogramación y protocolos de optimización en sangre, células endoteliales y otros tipos celulares. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir un programa hemogénico en fibroblastos de ratón, la sobreexpresión de factores de transcripción y cómo ensayar funcionalmente la célula derivada. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este video muestra el procedimiento para generar células madre pluripotentes inducidas mediante lentivirus inducible que expresan Oct4, Sox2, c-Myc y Klf4.

La generación de células iPS a partir de MEFs través de la expresión forzada de Sox-2, Oct-4, c-Myc y Klf4

El Inducible Stemgent Dox ratón TF Set Lentivirus puede reprogramar fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) de células madre pluripotentes inducidas (iPS) a las células. Aquí se demuestra el protocolo para la expresión de DOX-inducible de los factores de la transcripción del ratón reprogramación Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc para generar iPS colonias que expresan marcadores comunes MES pluripotencia.

Generación de células madre pluripotentes inducidas por reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón con un factor de transcripción Cuatro, doxiciclina inducible sistema de transducción de lentivirales

El fibroblasto embrionario de ratón puede ser reprogramado en células madre pluripotentes inducidas con baja eficiencia mediante la expresión forzada de los factores de transcripción Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. Los raros intermediarios de la reacción de reprogramación son los FACS aislados mediante marcaje con anticuerpos contra los fabricantes de superficie celular Thy-1.2, Ssea-1 y Epcam.

Marcador de superficie celular mediada Purificación de iPS intermedios célula de un modelo reprogramable Ratón

Este protocolo describe la inducción eficiente de endotelio hemogénico y progenitores hematopoyéticos multipotenciales a partir de células madre pluripotentes humanas a través de la expresión forzada de factores de transcripción.

La inducción directa de Hemogenic endotelio y la Sangre por la sobreexpresión de factores de transcripción en células madre pluripotentes Humanos

Este manuscrito describe un protocolo paso a paso para la generación y cuantificación de diversos subtipos cardíacos reprogramados utilizando una administración mediada por retrovirus de Gata4, Hand2, Mef2c y Tbx5.

La evaluación de cardiomiocitos subtipos A raíz de reprogramación mediada por el factor de transcripción de fibroblastos embrionarios de ratón

Aquí presentamos un método robusto para reprogramar fibroblastos embrionarios primarios en cardiomiocitos funcionales a través de la sobreexpresión de GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 y miR-133 (GHMT2m) junto con la inhibición de la señalización de TGF-β. Nuestro protocolo genera cardiomiocitos paliza tan pronto como transducción después de 7 días con hasta un 60% eficiencia.

Supresión de la señalización Pro-fibróticos potencia Factor-mediada la reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón en cardiomiocitos inducida

Presentamos nuestro protocolo para producir inducida por progenitores eritroides (iEPs) de fibroblastos adultos ratón usando transcripción basada en el factor dirigen linaje reprogramación (DLR).

Directo linaje reprogramación de fibroblastos de ratón adulto a progenitores eritroides

Este protocolo demuestra la inducción de un programa hemogénico en fibroblastos dérmicos humanos mediante la expresión forzada de los factores de transcripción GATA2, GFI1B y FOS para generar células hematopoyéticas madre y progenitoras.

Reprogramación hemogénica de fibroblastos humanos por expresión forzada de factores de transcripción

La validación experimental de la actividad potenciadora se aborda mejor mediante el análisis de pérdida de función. Aquí se presenta un protocolo eficiente que utiliza la deleción mediada por CRISPR/Cas9 para estudiar la regulación específica de alelos de la transcripción génica en células ES F1 que contienen un genoma híbrido (Mus musculus129 x Mus castaneus).

La generación de CRISPR / Cas9 mediada monoallelic deleciones para estudiar la función del reforzador en las células madre embrionarias de ratón

células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) se derivan de las células endoteliales especializadas (hemogenic) durante el desarrollo, sin embargo, se sabe poco sobre el proceso por el cual algunas células endoteliales especifican a convertirse en la formación de la sangre. Demostramos un método basado en citometría de flujo permite el aislamiento simultáneo de las células endoteliales y hemogenic HSPC de tejidos embrionarios murinos.

Aislamiento de las células murinas embrionarias Hemogenic endoteliales

Aprende a inducir un programa hemogénico en fibroblastos embrionarios de ratón mediante la sobreexpresión de factores de transcripción para generar células precursoras hematopoyéticas in vitro.

La reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón con factores de transcripción para inducir un programa Hemogenic

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