La polimerización aniónica de un copolímero anfífilo para la Preparación de micelas de copolímeros de bloques estabilizados por interacciones de apilamiento π-pi

El objetivo general de este trabajo es demostrar los pasos fundamentales necesarios para la síntesis de materiales de copolímeros en bloque mediante polimerización aniónica por apertura de anillo, y mostrar la secuencia necesaria de estudios para la formulación de micelas de copolímeros en bloque con un fármaco hidrófobo. Este protocolo muestra la ejecución adecuada de los pasos y procedimientos necesarios para la síntesis de copolímeros en bloque mediante polimerización aniónica. La gran ventaja de la polimerización aniónica por apertura de anillo es la obtención de materiales con buen rendimiento y baja dispersidad contaminante.

Así como la escalabilidad del proceso. Es un momento emocionante para la administración de fármacos mediante polímeros. Con varios fármacos que dependen de formulaciones y micelas de copolímeros en bloque, actualmente en etapas avanzadas de preclínica o en desarrollo clínico.

Preparar los reactivos y los materiales para la transferencia según se describe en el protocolo escrito. Pesar metoxipolietilenglicol con un peso molecular de 5.000. Añadir el mPEG a un matraz seco que contenga una barra de agitación y sellar el adaptador de purga con un septum en la parte superior.

Conecte el matraz al colector y burbujee argón a través del matraz durante dos a tres minutos. Gire la válvula a la posición de vacío para burbujear el matraz. Gire manualmente el matraz y seque el recipiente de reacción de manera homogénea, con un secador de aire caliente o pistola térmica, hasta que el mPEG se derrita.

Después de un minuto, rompa el vacío girando la válvula del colector hacia la posición de Argón con varios movimientos rápidos para enfriar el matraz. Mantenga el macroiniciador polimérico bajo vacío durante aproximadamente dos horas y luego bajo Argón antes de que comience la reacción. A continuación, monte dos aparatos de destilación al vacío alto que previamente se hayan secado en un horno bajo la campana.

Un aparato es para la destilación de DMSO, y otro aparato es para la destilación del monómero, éter de fenil glicerol. Conecte los matraces separados a los dos aparatos e instale cada uno en una manta calefactora hemisférica o en un baño de aceite. Conecte agua fría a la parte superior de cada aparato y al colector.

Asegúrese de que cada aparato esté seguro y bien sellado. Active el vacío mediante la válvula. Establezca el calentamiento mediante un controlador de temperatura e inicie la agitación de las soluciones.

Después de dos horas de circulación en destilación de DMSO, cierre la válvula de alto vacío para recoger aproximadamente 20 mililitros de solución. A continuación, libere la fracción en el matraz y repita la operación una vez más, para asegurar la pureza de la fracción deseada que se recoge posteriormente. Caliente el matraz que contiene el mPEG bajo vacío con la pistola de calor hasta que el polímero se derrita, y luego burbujee nuevamente con argón.

Después de dos horas, cierre la válvula de alto vacío y recoja el volumen de disolvente. Detenga el calentamiento y libere el vacío desde el colector. Introduzca argón en la cámara, como se describió anteriormente.

Bajo una presión positiva de argón, conecte un extremo de la cánula a un cilindro graduado, o directamente al matraz que contiene el mPEG, también bajo argón, e introduzca cuidadosamente el otro extremo en la fracción recién destilada. Conecte un burbujeador adicional al matraz, cierre el flujo de argón y utilice únicamente la presión de argón proveniente del aparato de destilación. Para evitar accidentes causados por la presión de argón, abra la llave de vidrio durante uno o dos segundos, y vuélvala a cerrar para continuar el flujo de DMSO hasta que se complete la transferencia total.

A continuación, bajo argón, conecte un extremo de la cánula desde el cilindro graduado seco, sellado mediante un septo, a una solución stock de potasio naftaleno 0,3 molar. Luego, agregue un burbujeador adicional al cilindro graduado, cierre el flujo de argón hacia el cilindro y, bajo presión positiva de argón, transfiera cinco mililitros de potasio naftaleno 0,3 molar mediante cánulación desde la solución stock al cilindro graduado. Introduzca otra aguja del manifold en el cilindro y retire el burbujeador adicional.

Retire con cuidado la cánula conectada a la solución stock, insértela rápidamente en el matraz de reacción y conecte un burbujeador adicional. A continuación, como se describió anteriormente, agregue la base gota a gota hasta que la solución se oscurezca. Tras la desaparición lenta del color, añada otra porción hasta que reaparezca el color oscuro, y repita hasta completar la transferencia.

Como se describió previamente, transfiera el volumen deseado de monómero a la reacción para alcanzar un grado de polimerización del éter glicol polifenólico de aproximadamente 18 a 20 unidades. Deje la reacción durante 48 horas a 80 grados celsius, bajo atmósfera de argón con agitación constante, para asegurar una polimerización completa. Detenga la reacción mediante la adición de gotas de ácido clorhídrico normal y metanol, observado por la desaparición del color.

Extraiga el naftaleno de la solución de DMSO con hexano. Elimine aproximadamente 70 mililitros del DMSO mediante destilación al vacío. Enfríe la solución en suspensión y agregue 15 mililitros de THF.

Elimine la sal de la solución en suspensión mediante centrifugación a 5.000 veces g durante diez minutos. Transfiera el sobrenadante y añádalo gota a gota a 500 mililitros de éter dietílico frío. Recoja el precipitado por filtración o por centrifugación.

Después de repetir la precipitación dos veces, seque el precipitado a temperatura ambiente bajo la campana extractora durante la noche y luego al vacío a 30 grados celsius durante 24 a 48 horas, obteniendo un rendimiento del 85 %. El copolímero ya está listo para su caracterización, como se describe en el protocolo del texto. Disuelva 12 miligramos de doxorrubicina en un mililitro de acetonitrilo. Añada 10 microlitros de trietilamina y deje agitar la solución en la oscuridad durante dos horas.

Disuelva 45 miligramos de copolímero en un mililitro de THF y agite durante el mismo período de tiempo. Añada la solución de copolímero a la solución de doxorrubicina y enjuague el vial que contiene el copolímero residual con un volumen adicional de THF. A continuación, añada la mezcla de copolímero-fármaco gota a gota a un vial de 20 mililitros que contenga 15 mililitros de solución salina al 0,9% con agitación.

Transfiera la solución a una bolsa de diálisis y realice diálisis frente a 500 mililitros de solución salina al 0,9%. Transfiera el dializado a un tubo de 15 mililitros y centrifugue a 5.000 × g durante 15 minutos. Luego, transfiera el sobrenadante a un sistema de ultrafiltración que contenga una membrana de diálisis.

Coloque el adaptador de agitación en el sistema de ultrafiltración, cierre la tapa y abra el flujo de nitrógeno. Concentre la solución de micelas de copolímero en bloque hasta un volumen de cuatro mililitros y agregue seis mililitros de solución salina fresca. Luego, concentre nuevamente la solución de micelas de copolímero en bloque hasta 4 mililitros, enjuague la cámara con 0,5 mililitros de solución salina y añádala a la solución.

Almacene la solución resultante en viales marrones a temperatura ambiente y en la oscuridad, antes de su uso posterior. Se utilizó la polimerización aniónica por apertura de anillo del éter de fenilglicerol sobre el macroiniciador mPEG para preparar el copolímero dibloque anfifílico mediante la protonación profunda del grupo hidroxilo del mPEG. Utilizando naftaleno potásico como anión radical, seguido de la polimerización del monómero de éter de fenilglicerol.

La caracterización del copolímero en bloque mediante cromatografía de permeación en gel y análisis por espectroscopia de resonancia magnética nuclear de protones confirmó una distribución estrecha de pesos moleculares con un grado de polimerización del éter de fenilglicerol de 15 unidades. En medios acuosos, los copolímeros en bloque anfifílicos se autoensamblan formando micelas que consisten en un núcleo hidrofóbico rodeado por una envoltura hidrofílica. La microscopía electrónica de transmisión confirmó una morfología esférica y la dispersión dinámica de luz indicó un diámetro hidrodinámico de 25 nanómetros.

La doxorrubicina fue encapsulada con éxito en micelas de copolímero en bloque. En comparación con el fármaco protonado libre en solución, la autoextinción de la doxorrubicina, observada mediante espectroscopía de fluorescencia, confirmó la incorporación del fármaco en las micelas poliméricas, con una capacidad de carga de hasta el 14%. El perfil de liberación de la doxorrubicina a partir de las micelas de copolímero en bloque indicó una buena estabilidad de esta formulación a pH neutro y una liberación sostenida del fármaco durante cuatro días en condiciones fisiológicamente relevantes.

Una vez dominada, esta técnica puede ayudar a los estudiantes de ciencias farmacéuticas a preparar la síntesis de copolímeros dibloque para su aplicación en la administración de fármacos. Este procedimiento descrito aquí puede aplicarse para la síntesis de una amplia gama de copolímeros con PEG como iniciador. Aquí se ha puesto énfasis en garantizar buenas prácticas de laboratorio, que proporcionen condiciones anhidras y den como resultado materiales de alta calidad.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo trabajar bajo condiciones anhidras y, a su vez, debería ser capaz de aplicar estos pasos para la síntesis de poliéster de PEG o materiales de poliéster de PEG. Al llevar a cabo cualquiera de las investigaciones descritas, es fundamental recordar que se está trabajando bajo condiciones controladas, con disolventes orgánicos potencialmente peligrosos y otros agentes. Además, todas las sustancias químicas son tóxicas y deben manipularse tomando las precauciones necesarias.

Por ejemplo, usar guantes, una bata de laboratorio, zapatos cerrados, así como usar una mascarilla cuando se desee pesar los fármacos.