La polimerización aniónica de un copolímero anfífilo para la Preparación de micelas de copolímeros de bloques estabilizados por interacciones de apilamiento π-pi

El objetivo general de este trabajo es demostrar los pasos críticos necesarios para la síntesis de materiales de copolímero en bloque mediante polimerización aniónica de apertura de anillo, y mostrar el flujo necesario de estudios para la formulación de micelas de copolímero en bloque de un fármaco hidrofóbico. Este protocolo demuestra la correcta ejecución de los pasos y procedimientos necesarios para la síntesis de copolímeros en bloque por polimerización aniónica. La gran ventaja de la apertura de anillo en una polimerización aniónica es la síntesis de materiales con buen rendimiento y baja dispersión contaminante.

Así como la escalabilidad del proceso. Este es un momento emocionante para la administración de fármacos poliméricos. Con una serie de fármacos que se basan en la formulación y el bloque de micelas de copolímero, ahora en fase avanzada de desarrollo preclínico o clínico.

Prepare los reactivos y los materiales para la transferencia como se describe en el protocolo de texto. Pesa metoxipolietilenglicol con un peso molecular de 5.000. Agregue el mPEG en un matraz seco que contenga una barra agitadora y selle el adaptador de lavado con un tabique en la parte superior.

Conecte el matraz al colector y coloque el matraz durante dos o tres minutos con argón. Gire la válvula a la posición de vacío para posar el matraz. Gire el matraz manualmente y seque el recipiente de reacción de manera homogénea, con un secador de pelo o una pistola de calor, hasta que el mPEG se derrita.

Después de un minuto, rompa el vacío girando la válvula del colector hacia la posición de argón con varios chasquidos rápidos para enfriar el matraz. Mantenga el macroiniciador polimérico al vacío durante aproximadamente dos horas y luego bajo argón antes de que comience la reacción. A continuación, monte dos aparatos de destilación al alto vacío que se hayan secado previamente en un horno debajo de la campana.

Un aparato es para la destilación de DMSO, y un aparato es para la destilación del monómero, éter de fenilglicerol. Conecte los matraces separados a los dos aparatos e instale cada uno en una repisa calefactora semiesférica o en un baño de aceite. Conecte el agua fría a la parte superior de cada aparato y al colector.

Asegúrese de que cada aparato esté seguro y bien sellado. Conecte el vacío a través de la válvula. Configure el calentamiento a través de un controlador de temperatura y comience a remover las soluciones.

Después de dos horas de destilación de circulación de DMSO, cierre la válvula de alto vacío para recoger aproximadamente 20 mililitros de solución. A continuación, se libera la fracción en el matraz, y se repite la operación una vez más, para asegurar la pureza de la fracción deseada que se recoge posteriormente. Calentar el matraz que contiene el mPEG al vacío con la pistola de calor hasta que el polímero se derrita, y luego posarse de nuevo con argón.

Después de dos horas, cierre la válvula de alto vacío y recoja el volumen de solvente. Deje de calentar y rompa el vacío del colector. Libere argón en la cámara, como se describió anteriormente.

Bajo una presión positiva de argón, conecte un lado de la cánula a un cilindro graduado, o directamente al matraz que contiene el mPEG, también debajo de argón, y sumerja el otro extremo cuidadosamente en la fracción recién destilada. Conecte un burbujeador adicional al matraz, cierre el flujo de argón y use solo la presión de argón del aparato de destilación. Para evitar accidentes causados por la presión del argón, abra la llave de paso del vidrio durante uno o dos segundos y vuelva a cerrarla para continuar el flujo de DMSO hasta que se complete la transferencia completa.

A continuación, bajo argón, conecte un lado de la cánula del cilindro graduado seco, sellado por un tabique, a una solución madre de naftaleno potásico 0,3 molar. Luego, agregue un burbujeador adicional al cilindro graduado, cierre el flujo de argón al cilindro y, bajo presión positiva de argón, transfiera cinco mililitros de naftaleno potásico 0.3 molar a través de la canulación de la solución madre al cilindro graduado. Inserte otra aguja del colector en el cilindro y retire el burbujeador adicional.

Retire la cánula conectada a la solución madre, con cuidado, insértela rápidamente en el matraz de reacción y conecte un burbujeador adicional. A continuación, como se ha descrito anteriormente, añade la base gota a gota hasta que la solución se oscurezca. Después de la lenta desaparición del color, agregue otra porción hasta que vuelva a aparecer el color oscuro y repita hasta la transferencia completa.

Como se describió anteriormente, transfiera el volumen deseado de monómero a la reacción para alcanzar un grado de polimerización del éter de polifenol glicol de aproximadamente 18 a 20 unidades. Deje la reacción durante 48 horas a 80 grados centígrados, bajo atmósfera de argón con agitación constante, para asegurar una polimerización completa. Apague la reacción mediante la adición de gotas de un ácido clorhídrico normal y metanol, como se observa por una desaparición de color.

Extraiga el naftaleno de la solución de DMSO con hexano. Retire aproximadamente 70 mililitros del DMSO por destilación al vacío. Enfríe la solución de suspensión y agregue 15 mililitros de THF.

Retire la sal de la solución de suspensión por centrifugación a 5.000 veces g durante diez minutos. Transfiera el sobrenadante y agregue una gota a gota hasta 500 mililitros de éter dietílico frío. Recoja el precipitado por filtración o centrifugación.

Después de repetir la precipitación dos veces, seque el precipitado a temperatura ambiente bajo el capó, durante la noche, y luego al vacío a 30 grados centígrados durante 24 a 48 horas, para un rendimiento del 85%El copolímero ahora está listo para la caracterización, como se describe en el protocolo de texto. Disuelve 12 miligramos de doxorrubicina en un mililitro de acetonitrilo. Agregue 10 microlitros de trietilamina y deje que la solución revuelva en la oscuridad durante dos horas.

Disuelva 45 miligramos de copolímero en un mililitro de THF y revuelva durante el mismo período de tiempo. Agregue la solución de copolímero a la solución de doxorrubicina y enjuague el copolímero residual que contiene un volumen adicional de THF. A continuación, agregue la mezcla de copolímero y medicamento gota a gota a un frasco de 20 mililitros que contenga 15 mililitros de solución salina al 0,9% con agitación.

Transfiera la solución a una bolsa de diálisis y dialice contra 500 mililitros de solución salina al 0,9%. Transfiera el dializado a un tubo de 15 mililitros y centrifugue a 5.000 veces g, durante 15 minutos. Luego, transfiera el sobrenadante a un sistema de ultrafiltración que contenga una membrana de diálisis.

Coloque el adaptador de agitación en el sistema de ultrafiltración, cierre la tapa y ábrala a un chorro de nitrógeno. Concentre la solución de micelas de copolímero en bloque a un volumen de cuatro mililitros y agregue seis mililitros de solución salina fresca. A continuación, concentre de nuevo la solución de micelas de copolímero en bloque en 4 mililitros, enjuague la cámara con 0,5 mililitros de solución salina y añádala a la solución.

Guarde la solución resultante en vilos marrones a temperatura ambiente en la oscuridad, antes de usarla más tarde. La polimerización aniónica de apertura de anillo de éter de fenilglicerol en el macroiniciador mPEG se utilizó para preparar el copolímero dibloque anfifílico mediante la protonación profunda del grupo hidroxilo de mPEG. Uso de naftaleno potasio como anión radical, seguido de la polimerización del monómero de éter de fenilglicerol.

La caracterización del copolímero en bloque por cromatografía de permeación en gel y el análisis de espectroscopia de RMN de protones confirmaron una distribución de peso molecular estrecha con un grado de polimerización del éter de fenilglicerol de 15 unidades. En el acervo medio, los copolímeros de bloque anfifílico se ensamblan para formar micelas que consisten en un núcleo hidrofóbico rodeado por una capa hidrofílica. La microscopía electrónica de transmisión confirmó una morfología esférica y la dispersión dinámica de la luz indicó un diámetro hidrodinámico de 25 nanómetros.

La doxorrubicina se encapsuló con éxito en las micelas de copolímero en bloque. En comparación con el fármaco protonado libre en solución, el autoenfriamiento de la doxorrubicina, observado por espectroscopia de fluorescencia, confirmó la incorporación del fármaco en las micelas poliméricas, con una capacidad de carga del fármaco de hasta el 14%El perfil de liberación de doxorrubicina, a partir de las micelas de copolímero en bloque, indicó una buena estabilidad para esta formulación a pH neutro. Y la liberación sostenida de la droga durante cuatro días en condiciones fisiológicamente relevantes.

Una vez dominada, esta técnica puede ayudar a los estudiantes de ciencias farmacéuticas a preparar los copolímeros dibloque de síntesis para su aplicación en la administración de fármacos. Este procedimiento descrito en este documento, se puede aplicar para la síntesis de una amplia gama de copolímeros con PEG como iniciador. Aquí se ha hecho hincapié en asegurar buenas prácticas de laboratorio, que proporcionen condiciones anhidras y den como resultado materiales de alta calidad.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo trabajar en condiciones anhidras y debería poder aplicar estos pasos para la síntesis de poliéster PEG o materiales de poliéster PEG. Al llevar a cabo cualquiera de las investigaciones descritas, es esencial recordar que está trabajando en condiciones controladas, con solventes orgánicos potencialmente peligrosos y otros agentes. Además, todas las drogas son tóxicas y deben manipularse con las precauciones necesarias.

Por ejemplo, usar guantes, bata de laboratorio, zapatos cerrados, así como usar una mascarilla cuando se quiera pesar los medicamentos.