El trabajo con células auditivas HEI-OC1

El objetivo general de este protocolo es describir los procedimientos básicos para trabajar con células HEI-OC1, que pueden utilizarse para estudiar los efectos de los fármacos farmacológicos en las células auditivas y ayudar en la caracterización funcional de la proteína motora prestina. Las células HEI-OC1 son utilizadas por muchos investigadores de todo el mundo en diferentes experimentos con diferentes objetivos y utilizando diferentes técnicas. Es de esperar que los procedimientos descritos aquí proporcionen una base común para que estos estudios sean comparables.

Por supuesto, estos procedimientos experimentales pueden mejorarse aún más. Pero las diferencias con los aquí descritos podrían ser clave para entender y explicar resultados posiblemente contradictorios. En esta demostración describiremos cómo trabajar con células HEI-OC1 partiendo de una alícuota congelada hasta tener muestras listas para realizar diferentes estudios con técnicas ampliamente disponibles.

Para comenzar este procedimiento, retire un vial de células HEI-OC1 criopreservadas de nitrógeno líquido y colóquelo en un baño de agua a 37 grados centígrados. Sumerja solo la mitad inferior del vial y deje que se descongele hasta que solo quede una pequeña cantidad de hielo en el vial. En una cabina de seguridad biológica, limpie el exterior del vial con alcohol al 70%.

A continuación, pipetear las células del vial y entregar todo el volumen gota a gota, lentamente, en un tubo cónico de 15 mililitros que contiene 10 mililitros de medio de crecimiento precalentado como DMEM suplementado con 10% de FBS. A continuación, retire el DMSO centrifugando el tubo durante cinco minutos. Después de cinco minutos, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en nueve mililitros de medio de crecimiento fresco.

Desagregue los grumos o láminas de células mediante el flujo y el reflujo de las células suspendidas entre la pipeta y el medio tres o cuatro veces con la punta de la pipeta tocando el fondo del tubo. Luego, coloque el volumen total de células suspendidas en el medio de crecimiento en una placa de cultivo celular de plástico sin tratar de 100 milímetros de diámetro. Incubar las células a 33 grados centígrados con 10%CO2.

En este paso, retire el medio viejo y lave las células con dos mililitros de PBS. A continuación, cubra la monocapa celular con tripsina al 0,25%. Examinar las células con un microscopio invertido cuando el 40% de ellas se hayan desprendido.

Si es necesario, agite suavemente la placa de cultivo para liberar las células adheridas restantes Vuelva a suspender las células y elimine la tripsina centrifugando el tubo durante cinco minutos. Después, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en nueve mililitros de medio de crecimiento fresco. A continuación, disgrege los grumos o láminas de células fundiendo y refluyendo las células suspendidas entre la pipeta y el medio, tres o cuatro veces con la punta de la pipeta tocando el fondo del tubo.

Proceda a sembrar las células en placas de cultivo celular de 100 milímetros de diámetro. Incubarlos a 33 grados centígrados con un 10% de CO2 y dividirlos tantas veces como sea necesario para los experimentos planificados, o para generar un nuevo stock. Para la diferenciación, incubar las células HEI-OC1 en las condiciones permisivas hasta que alcancen aproximadamente el 80% de confluencia.

Luego, incube las células a 39 grados centígrados con 5% de CO2 durante dos o tres semanas y cambie el medio cada dos días para eliminar las células muertas. Comience este procedimiento contando las células utilizando un contador automático de células o un hemocitómetro y ajuste la concentración de células al valor requerido. A continuación, siembre las células en una placa de fondo plano transparente de 96 pocillos, una placa de 96 pocillos de paredes blancas o una placa de seis pocillos.

Si el ensayo en particular lo requiere, incube las células durante la noche para la fijación del sustrato antes de tratarlas con los medicamentos de interés. Luego, mida el resultado del tratamiento mediante citometría de flujo u otra técnica adecuada. Para recolectar las células, lávelas dos veces con 10 mililitros de PBS sin calcio ni magnesio.

Añadir dos mililitros de la solución de separador sin enzimas e incubar las células durante tres minutos a 37 grados centígrados con 5% de CO2. Utilice un microscopio invertido para comprobar el desprendimiento de las células. Si es necesario, mueva suavemente la placa de cultivo celular para separar más células y tenga cuidado de no agitarla.

A continuación, agregue 10 mililitros de DMEM más 10% de FBS y pipetee las células hacia arriba y hacia abajo, suavemente, cinco veces. Después de eso, observe las células bajo un microscopio. Si más del 80% de las células ya están separadas, no es necesario pipetear más.

Si las células todavía están en grupos, continúe pipeteando suavemente hasta que más del 80% de las células ya no estén en grupos. Un control óptico de las células debe mostrar muchas células redondas individuales con bordes de membrana lisos. A continuación, proceda con las mediciones de patch-clamp y NLC, como se describe en el protocolo de texto.

Las células HEI-OC1 cultivadas en condiciones no permisivas mostraron una disminución altamente significativa en la viabilidad celular y un aumento igualmente significativo en la muerte celular con respecto a los cultivos celulares en condiciones permisivas. Dado que los efectos del fármaco en las células ya moribundas o con una viabilidad disminuida podrían ser diferentes de los efectos del mismo fármaco en las células sanas, se deben dedicar esfuerzos considerables a discriminar los efectos del fármaco de los efectos de las condiciones de cultivo en cualquier estudio de citotoxicidad realizado en células NP-HEI-OC1. Por lo tanto, recomendamos el uso de células HEI-OC1 cultivadas en condiciones permisivas para experimentos que no requieran específicamente células diferenciadas.

Las imágenes confocales mostradas aquí confirman la expresión de la proteína motora auditiva prestina en células HEI-OC1 cultivadas a 33 grados Celsius y 39 grados Celsius. Nótese que la prestina se inmunolocaliza principalmente en el citoplasma de las células HEI-OC1 que crecen en las condiciones permisivas, y está más concentrada en la membrana plasmática en las células más diferenciadas. Los estudios de citometría de flujo mostraron un claro aumento en la expresión de prestina en ambas condiciones, lo que sugiere que la translocación se acompañó de la síntesis de más moléculas de prestina.

Por otro lado, los estudios electrofisiológicos mostraron un NLC robusto en las células HEI-OC1 creciendo a 33 grados centígrados, con un valor máximo que disminuyó y un voltaje en capacitancia máxima que cambió a los valores más despolarizados a medida que las células se movieron a las condiciones no permisivas durante una y dos semanas. Curiosamente, estos resultados sugieren que la función motora podría verse comprometida si la densidad de las moléculas de prestina en la membrana plasmática es demasiado alta. Es importante recordar que los protocolos aquí descritos requieren el uso correcto de técnicas de cultivo celular bien establecidas.

Además, recuerde evitar el uso de antibióticos. Además, recuerde que el fenotipo y la respuesta de las células HEI-OC1 dependerán en gran medida de los parámetros de cultivo.