Name: El trabajo con células auditivas HEI-OC1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprende a trabajar con células HEI-OC1 para investigación auditiva y farmacología usando líneas celulares de ratón. Este protocolo estandarizado facilita el estudio de efectos de fármacos y la caracterización de la proteína prestin.

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones R01-DC010146 y R01-DC010397 de los NIH. Su contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial de los Institutos Nacionales de Salud.

<ol><li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+derivation+of+conditionally+immortall+cell+lines+from+an+H-2Kb-tsA58+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).</li>
<li>Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cochlear+cell+line+as+an+in+vitro+system+for+drug+ototoxicity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Audiol.+Neurootol%22%5BJournal%5D)">A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening.</a> Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).</li>
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<li>Hayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autophagy+pathway+maintained+signaling+crosstalk+with+the+Keap1-Nrf2+system+through+p62+in+auditory+cells+under+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress.</a> Cell Signal. 27, 382-393 (2015).</li>
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<li>Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+drug+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity.</a> Hear Res. 335, 105-117 (2016).</li>
<li>Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+prestin+function%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function.</a> Hear Res. 335, 9-17 (2016).</li>
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<li>Bertolaso, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+the+OC-k3+immortalized+cell+line+treated+with+different+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Audiology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents.</a> Audiology. 40, 327-335 (2001).</li>
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<li>Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+two+immortalized+cell+lines+derived+from+the+stria+vascularis+of+a+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%2221st+Midwinter+Meeting+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse.</a> 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).</li>
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<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).</li>
<li>Santos-Sacchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+inhibition+of+voltage-dependent+outer+hair+cell+motility+and+capacitance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance.</a> J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).</li>
<li>Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+pyroptosis%2C+and+necrosis%3A+mechanistic+description+of+dead+and+dying+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells.</a> Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).</li>
<li>Majno, G., Joris, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+oncosis%2C+and+necrosis.+An+overview+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death.</a> Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).</li>
<li>Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+necrosis%3A+the+expanding+network+of+non-apoptotic+cell+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).</li>
<li>Sun, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+kind+of+cell+suicide%3A+mechanisms+and+functions+of+programmed+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis.</a> Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).</li>
<li>Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+necrosis+in+the+cross+talk+of+cell+death+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation.</a> Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).</li>
<li>Vercammen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+signaling+of+the+Fas+receptor%3A+initiation+of+both+apoptotic+and+necrotic+cell+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways.</a> J Exp Med. 188, 919-930 (1998).</li>
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<li>Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+expressing+Tet-inducible+cell+line+recapitulates+in+situ+developmental+changes+in+prestin%27s+Boltzmann+characteristics+and+reveals+early+maturational+events%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin's Boltzmann characteristics and reveals early maturational events.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).</li>
<li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+the+outer+hair+cell+motor+prestin+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse.</a> J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).</li>
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<li>Tsunoo, M., Perlman, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+Oxygen+Tension%3A+Relation+to+Blood+Flow+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function.</a> Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses existentes o potenciales.

En este informe se describe cómo la cultura células HEI-OC1 y las utilizamos para evaluar los mecanismos de citotoxicidad inducida por fármacos y para investigar las propiedades funcionales de prestina, el motor molecular de las CCE coclear. Los procedimientos técnicos, sin embargo, son lo suficientemente generales como para ser adaptado fácilmente a diferentes estudios. Todos los protocolos descritos aquí requieren el uso correcto de técnicas de cultivo celular bien establecidos 10.</s...

House Ear Institute-órgano de Corti 1 células (IES-OC1) se derivan del órgano de la audición de un 1,2 ratón transgénico. La incubación de cualquier célula de este ratón transgénico a 33 ° C / 10% de CO 2 (condiciones permisivas) induce la expresión de un gen de inmortalización que desencadena de-diferenciación y la proliferación acelerada; mover las células a 39 ° C / 5% de CO 2 (condiciones no permisivas) conducen a disminución de la proliferación, la diferenciación y, por lo menos en el caso de HEI-OC1, la muerte celular 2,3. células HEI-OC1 fueron clonados y caracterizados en nuestro laboratorio hace más de una década, y los estudios iniciales indicaron que expresan marcadores específicos de células ciliadas cocleares, como prestin, miosina 7a, Atoh1, BDNF, calbindina y calmodulina, sino también los marcadores de apoyo células como la conexina 26 y el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF-R) 2. Por lo tanto, se sugirió que HEI-OC1 podría representar un common progenitoras de las células sensoriales y de soporte del órgano de Corti 2. Estudios paralelos proporcionan una fuerte evidencia de que arquetípica fármacos ototóxicos, tales como cisplatino, gentamicina y estreptomicina inducida por la activación de la caspasa-3 en estas células, mientras que los medicamentos que se consideran no ototóxicos, como la penicilina, no lo hicieron 2,3. Por lo tanto, esta línea celular fue propuesto como un sistema in vitro para investigar los mecanismos celulares y moleculares implicados en la ototoxicidad y para la detección de la ototoxicidad potencial o propiedades otoprotective de nuevos medicamentos farmacológicos. Se estima que las células HEI-OC1 se han utilizado en más de ciento cincuenta estudios publicados en los últimos diez años. Mientras que mirando el potencial pro-apoptóticos efecto de diferentes drogas fue el principal objetivo de la mayoría de los estudios con esta línea celular, otros procesos celulares importantes como la autofagia y la senescencia simplemente han comenzado a ser investigado en células HEI-OC1 4-7. yona reciente estudio realizado en nuestro laboratorio 8, que utiliza células HEI-OC1 para recoger un conjunto completo de datos sobre la muerte celular, la supervivencia, proliferación, senescencia y la autofagia inducida por diferentes drogas farmacológicas utilizadas con frecuencia en la clínica. También comparamos algunas de las respuestas de las células HEI-OC1 con las de células HEK-293 (células de riñón embrionario humano) y HeLa (células epiteliales humanas) que recibe un tratamiento idéntico. Nuestros resultados indican que las células HEI-OC1 responden a la cada fármaco de una forma característica, con una dosis-distintivo y la sensibilidad dependiente del tiempo de al menos uno de los mecanismos en estudio. También hicimos hincapié en que el estudio que una correcta interpretación de los resultados experimentales requerirá la realización de estudios paralelos con más de una técnica 8. En un estudio diferente se investigó el uso de células HEI-OC1 para evaluar la respuesta funcional de prestin, la proteína de motor de las células ciliadas externas cocleares (CCE) 9 </sarriba&gt;. Hemos informado citometría de flujo y estudios de microscopía láser confocal de barrido en el patrón de expresión prestina, así como la capacitancia no lineal (NLC) y los estudios de fijación de células enteras parche en células cultivadas HEI-OC1 al permisiva (P-IES-OC1) y no permisivas (NP-IES-OC1) condiciones. Nuestros resultados indican que tanto la expresión prestina y membrana plasmática aumento total de la localización de una manera dependiente del tiempo en las células NP-IES-OC1. Curiosamente, también se encontró que el aumento en la localización prestin en la membrana plasmática de las células NP-HEI-OC1 correlacionados con una disminución de Na + K + ATPasa, que transloca desde la membrana plasmática al citoplasma sin cambios significativos en la expresión de células total. Además, hemos demostrado que las células P-HEI-OC1 tienen un robusto NLC asociado a prestina la función motora, que disminuye cuando la densidad de las moléculas de prestina presentes en la membrana plasmática se incrementó. En conjunto, estos resultados apoyan firmemente la utilidad de HEI-OC1 en las células para investigar las proteínas auditivas. En este artículo de vídeo se describe cómo la cultura células HEI-OC1, por lo que es conveniente utilizar células que crecen en condiciones permisivas (P-IES-OC1) para los estudios de citotoxicidad, la forma de evaluar el mecanismo / s de la citotoxicidad inducida por fármacos y cómo para llevar a cabo estudios electrofisiológicos (por ejemplo, patch-clamp, la capacitancia no lineal (NLC)) para investigar las propiedades funcionales de prestin, el motor molecular de OHCs cocleares.

<table><tbody><tr>Células <td></td><td></td><td>HEI-OC1</td><td>TODOS LOS KITS DE ENSAYO, EQUIPOS&nbsp;</td></tr><tr><td>Cabina de seguridad biológica de clase II</td><td>The Baker Company</td><td>Sterilgard III</td><td>Y LAS EMPRESAS INDICADAS EN LA</td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>LAS 2 COLUMNAS ANTERIORES SON SOLO</td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 25</td><td>EJEMPLOS, Y CUALQUIER OTRO PRODUCTO SIMILAR</td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Stovall</td><td>HWB115</td><td>PODRÍA UTILIZARSE.</td></tr><tr><td>Contador de células</td><td>Nexcelom</td><td>Cellometer Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>Dos (2) incubadoras de células, una a 33 &deg; C/10% CO2 y otros a 39 &deg; C/5% CO2</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular, PS, 100 mm x 20 mm con rejillas de ventilación</td><td>Greinier Bio-One</td><td>664-160</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular, PS,&nbsp; 60 mm x 15 mm con rejillas de ventilación&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Matraces de cultivo de tejidos Cellstar&nbsp; 250 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658-175</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar tissue cultur&nbsp; matraces</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660-175</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Placa de cultivo celular de 6 pocillos, con tapa-Cellstar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>Microtest Placa de cultivo de tejidos, 96 pocillos, fondo plano con tapa</td><td>Becton Dickinson</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96 pocillos blanco, fondo transparente</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubo cónico de polipropileno con tapón Cellstars</td><td>Becton Dickinson&nbsp;</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tubos cónicos de polipropileno con tapón-Cellstars</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4 (1x)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH10073.1</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium, sin rojo fenol</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, 0.25%&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>TACS MTT Kit de ensayo de proliferación celular</td><td>Trevigen</td><td>4890-25-K</td><td></td></tr><tr><td>Caspasa-Glo 3/7 Ensayo&nbsp; kit</td><td>Promega</td><td>&nbsp; G8091&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proliferación celular BrdU&nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>6813</td><td></td></tr><tr><td>Solución de disociación celular no enzimática&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tox Green Kit de ensayo de citotoxicidad Promega</td><td></td><td>&nbsp; G8741&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento FACSAriaIII&nbsp;</td><td>BD Biociencias</td><td>&nbsp; FACSAriaIII</td><td>Con excitación de 488 nm (láser azul)</td></tr><tr><td>Escáner digital de transferencia</td><td>LI-COR</td><td>C-DiGit</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de electroforesis y transferencia</td><td>Hoefer</td><td>SE300 miniVE</td><td></td></tr><tr><td>Spectra Max 5 Lector de placas con software Soft Max Pro 5.2</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 5</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de pinza de parche</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>para la preparación electrodos de parche</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr></tbody></table>

el trabajo con células auditivas hei-oc1

Working with Auditory HEI-OC1 Cells

HEI-OC1 es una de las pocas líneas celulares auditivas de ratón disponibles para fines de investigación. Originalmente propuesto como un sistema in vitro para el cribado de fármacos ototóxicos, estas células se han utilizado para investigar las vías apoptóticas activadas por fármacos, la autofagia, la senescencia, el mecanismo de protección celular, las respuestas inflamatorias, la diferenciación celular, los efectos genéticos y epigenéticos de los fármacos farmacológicos, los efectos de la hipoxia, el estrés oxidativo y del retículo endoplásmico y la expresión de canales moleculares y receptores. Entre otros marcadores importantes de las células ciliadas cocleares, las células HEI-OC1 expresan endógenamente prestina, la proteína motora paradigmática de las células ciliadas externas. Por lo tanto, pueden ser muy útiles para dilucidar nuevos aspectos funcionales de esta importante proteína auditiva. Las células HEI-OC1 son muy robustas y su cultivo no suele presentar grandes complicaciones. Sin embargo, requieren algunas condiciones especiales, como evitar el uso de cócteles antibacterianos comunes que contengan estreptomicina u otros antibióticos, así como la incubación a 33 °C para estimular la proliferación celular y la incubación a 39 °C para desencadenar la diferenciación celular. Aquí, describimos cómo cultivar células HEI-OC1 y cómo usarlas en algunos ensayos típicos, como proliferación celular, viabilidad, muerte, autofagia y senescencia, así como cómo realizar mediciones de capacitancia no lineal y de fijación de parche.

En un par de publicaciones recientes se informó de un amplio conjunto de estudios dirigidos a evaluar la respuesta de las células HEI-OC1 a varios medicamentos farmacológicos de uso común, así como la investigación de la función prestina 8,9. En estos estudios hemos hecho uso de todos los protocolos descritos en las secciones anteriores. Uno de los resultados de estos estudios anteriores era que las células HEI-OC1 ...

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) es una de las pocas líneas celulares auditivas de ratón actualmente disponibles para fines de investigación. Este protocolo describe cómo trabajar con células HEI-OC1 para investigar los efectos citotóxicos de los fármacos farmacológicos, así como las propiedades funcionales de las proteínas del oído interno.

El trabajo con células auditivas HEI-OC1

HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic ...

El objetivo general de este protocolo es describir los procedimientos básicos para trabajar con células HEI-OC1, que pueden utilizarse para estudiar los efectos de fármacos farmacológicos sobre células auditivas y ayudar en la caracterización funcional de la proteína motora prestina. Muchos investigadores de todo el mundo utilizan las células HEI-OC1 en diferentes experimentos con distintos objetivos y empleando diversas técnicas. Esperamos que los procedimientos descritos aquí proporcionen una base común que permita comparar estos estudios.Por supuesto, estos procedimientos experimentales podrían mejorarse aún más. Sin embargo, las diferencias con los descritos aquí podrían ser fundamentales para comprender y explicar resultados posiblemente contradictorios. En esta demostración, describiremos cómo trabajar con células HEI-OC1, partiendo de una alícuota congelada hasta obtener muestras listas para realizar diferentes estudios mediante técnicas ampliamente disponibles.Para comenzar este procedimiento, retire un vial de células HEI-OC1 criopreservadas del nitrógeno líquido y colóquelo en un baño de agua a 37 grados Celsius. Sumerja solo la mitad inferior del vial y permita que se descongele hasta que solo quede una pequeña cantidad de hielo en el vial. En una cabina de seguridad biológica, limpie el exterior del vial con alcohol al 70%.Luego, pipeteé las células del vial y agregue todo el volumen gota a gota, lentamente, en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de medio de crecimiento precalentado, como el DMEM suplementado con 10 %FBS. A continuación, elimine el DMSO mediante centrifugación del tubo durante cinco minutos. Transcurridos cinco minutos, deseche el sobrenadante y resuspenda las células en nueve mililitros de medio de crecimiento fresco.Disgregue los agregados o láminas de células haciendo fluir y refluir las células en suspensión entre la pipeta y el medio tres o cuatro veces, con la punta de la pipeta tocando el fondo del tubo. A continuación, coloque el volumen total de células en suspensión en medio de crecimiento en una placa de cultivo celular de plástico no tratada de 100 milímetros de diámetro. Incube las células a 33 grados Celsius con 10%CO2.En este paso, retire el medio antiguo y lave las células con dos mililitros de PBS. A continuación, cubra la monocapa celular con tripsina al 0,25 %. Examine las células utilizando un microscopio invertido cuando el 40 % de ellas se hayan desprendido.Si es necesario, agite suavemente la placa de cultivo para liberar cualquier célula adherida restante. Re-suspenda las células y elimine la tripsina centrifugando el tubo durante cinco minutos. Posteriormente, deseche el sobrenadante y re-suspenda las células en nueve mililitros de medio de crecimiento fresco. A continuación, desagregue los agregados o láminas de células pasando y repasando las células suspendidas entre la pipeta y el medio, de tres a cuatro veces, con la punta de la pipeta tocando el fondo del tubo.Proceda a sembrar las células en placas de cultivo celular de 100 milímetros de diámetro. Incúbelas a 33 grados Celsius con 10%CO2 y páseles tantas veces como sea necesario para los experimentos planeados, o para generar un nuevo stock. Para la diferenciación, incube las células HEI-OC1 en condiciones permisivas hasta que alcancen aproximadamente un 80% de confluencia.Luego, incubar las células a 39 grados Celsius con 5%CO2 durante dos o tres semanas y cambiar el medio cada dos días para eliminar las células muertas. Comenzar este procedimiento contando las células utilizando un contador celular automático o un hemocitómetro y ajustar la concentración celular al valor requerido. A continuación, sembrar las células en una placa de 96 pocillos transparente con fondo plano, una placa de 96 pocillos con paredes blancas o una placa de seis pocillos.Si el ensayo lo requiere, incubar las células durante la noche para la adhesión del sustrato antes de tratarlas con los fármacos de interés. Luego, medir el resultado del tratamiento mediante citometría de flujo o cualquier otra técnica adecuada. Para recolectar las células, lavarlas dos veces con 10 mililitros de PBS sin calcio ni magnesio.Añada dos mililitros de la solución desprendedora sin enzima e incube las células durante tres minutos a 37 grados Celsius con 5%CO2. Utilice un microscopio invertido para verificar el desprendimiento de las células. Si es necesario, mueva suavemente el recipiente de cultivo celular para desprender más células, y tenga cuidado de no agitarlo.A continuación, agregue 10 mililitros de DMEM más 10%FBS y aspire y expulse las células cinco veces suavemente con una pipeta. Después de eso, observe las células bajo un microscopio. Si más del 80% de las células ya están separadas, no se necesita pipetear más.Si las células aún están en grupos, continúe pipeteando suavemente hasta que más del 80 % de las células ya no estén en grupos. Un control óptico de las células debe mostrar muchas células individuales redondas con bordes de membrana lisos. Posteriormente, continúe con las mediciones de parche-guía y NLC, como se describe en el protocolo del texto.Las células HEI-OC1 cultivadas en condiciones no permisivas mostraron una disminución altamente significativa en la viabilidad celular y un aumento igualmente significativo en la muerte celular en comparación con las células cultivadas en condiciones permisivas. Dado que los efectos de los fármacos sobre células que ya están muriendo o que tienen una viabilidad reducida podrían ser diferentes a los efectos del mismo fármaco sobre células sanas, se deben dedicar esfuerzos considerables a discriminar los efectos del fármaco de los efectos de las condiciones de cultivo en cualquier estudio de citotoxicidad realizado en células HEI-OC1 no permisivas. Por lo tanto, recomendamos utilizar células HEI-OC1 cultivadas en condiciones permisivas para experimentos que no requieran específicamente células diferenciadas.Las imágenes confocales mostradas aquí confirman la expresión de la proteína motora auditiva prestina en células HEI-OC1 cultivadas a 33 grados Celsius y 39 grados Celsius. Obsérvese que la inmunolocalización de prestina se localiza principalmente en el citoplasma de las células HEI-OC1 que crecen en condiciones permisivas, y se concentra más en la membrana plasmática en las células más diferenciadas. Estudios de citometría de flujo mostraron un claro aumento en la expresión de prestina en ambas condiciones, lo que sugiere que la translocación fue acompañada por la síntesis de más moléculas de prestina.Por otro lado, los estudios electrofisiológicos mostraron una CLN robusta en células HEI-OC1 cultivadas a 33 grados Celsius, con un valor máximo que disminuyó y un voltaje en la capacitancia máxima que se desplazó hacia valores más despolarizados a medida que las células se trasladaron a condiciones no permisivas durante una y dos semanas. Curiosamente, estos resultados sugieren que la función motora podría verse comprometida si la densidad de moléculas de prestina en la membrana plasmática es demasiado alta. Es importante recordar que los protocolos descritos aquí requieren el uso correcto de técnicas bien establecidas de cultivo celular.Además, recuerde evitar el uso de antibióticos. Asimismo, tenga en cuenta que el fenotipo y la respuesta de las células HEI-OC1 dependerán en gran medida de los parámetros de cultivo.

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Investigación

JoVE Journal

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Biología

Plenario de células patch-clamp grabaciones de las dendritas de fibras nerviosas auditivas en la sinapsis cinta del pelo interior de células de la cóclea de los mamíferos.

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Un método fiable para investigar células ciliadas externas (OHC) las respuestas de móviles, incluyendo electromotility, motilidad lenta y flexión, se describe. Motilidad OHC es provocado por la estimulación con un campo externo eléctrica alterna, y el método tiene la ventaja de la grabación de imágenes a alta velocidad, la iluminación basada en LED, y el software de última generación de imágenes de análisis.

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Los implantes cocleares (IC) permitir la audición por la estimulación eléctrica directa del nervio auditivo. Sin embargo, la mala frecuencia y la intensidad de la resolución limita la calidad de la audición con entidades de crédito. Aquí se describe la estimulación optogenética del nervio auditivo en ratones como estrategia alternativa para la investigación auditiva y el desarrollo de las futuras entidades de crédito.

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Existen varios métodos para introducir agentes ototóxicos en las cócleas de modelos animales. Se presenta un protocolo quirúrgico para la administración de agentes ototóxicos en el nicho de ventana redonda. El procedimiento es fiable, crea lesiones intracocleares específicas y evita daños mecánicos en la microarquitectura. Es posible examinar la autorreparación/regeneración coclear.

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Se describen los protocolos actuales para mantener células progenitoras óticas multipotentes inmortalizadas (iMOP) y la diferenciación ótica.  Se destacan las condiciones de cultivo y los marcadores moleculares que indican la diferenciación en epitelios sensoriales y neuronas ganglionares espirales (SGN).

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Modelos animales de implantes cocleares pueden avanzar el conocimiento de los fundamentos tecnológicos de tratamiento de la pérdida permanente de audición neurosensorial con estimulación eléctrica. Este estudio presenta un protocolo quirúrgico de implantación coclear de una matriz de electrodos en ratones, así como la evaluación funcional con respuesta auditiva del médula oblonga y agudo ensordecedor.

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