Name: La síntesis de hidrogeles funcionalizado-RGD como una herramienta para aplicaciones terapéuticas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Aprende a sintetizar hidrogeles funcionalizados con RGD mediante CuAAC y polimerización asistida por microondas para ingeniería de tejidos. Este método mejora la viabilidad celular en cultivos tridimensionales y ofrece aplicaciones prometedoras en terapias regenerativas.

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Los autores desean agradecer al Prof. Maurizio Masi para la discusión fructífera y la señorita Chiara Allegretti para la edición de idioma. la investigación de los autores es apoyado por Bando Giovani Ricercatori 2010 (Ministero della Salute GR-2010-2312573).

Nota: Los productos químicos se usaron como se recibieron. Linear RGD se compra, pero se puede preparar mediante síntesis de péptidos Fmoc en fase sólida estándar de 16,19. Los disolventes son de calidad analítica. La diálisis requiere el uso de membrana con un M w de corte igual a 3.500 Da. Los compuestos sintetizados se caracterizan por espectros de 1 H NMR registrado en un espectrómetro 400 usando cloroformo MHz (CDCl3) u óxido de deuterio (D 2 O) como disolventes, y los desplazamientos químicos se informan como valores delta en partes por millón. Además, los hidrogeles se someten a análisis FT-IR utilizando la técnica de pastilla de KBr y su caracterización física implica estudios de gelificación evaluó mediante el tubo de ensayo invertido a 37 ° C. 1. Síntesis de 4-Azidobutanoyl Cloruro de 1 <ol><li> Disolver 500 mg de 4-azidobutanoic ácido (3,90 mmol) en 10 ml de diclorometano y 0,5 ml de dimetilformamida. </li><li> Se enfría la solución a 0 ° C, Utilizando un baño de hielo. </li><li> Añadir 505 l de cloruro de oxalilo (5,85 mmol) a 5 ml de diclorometano y se añade lentamente gota a gota al sistema de reacción, mientras se agita. </li><li> Después de 1 hora a 0 ° C utilizando un baño de hielo, vuelva a la temperatura ambiente. </li><li> Eliminar el disolvente bajo presión reducida usando un evaporador rotatorio. </li><li> Caracterizar el producto obtenido mediante espectroscopia 1H-RMN, disolviendo la muestra en CDCl3 16. </li></ol> 2. Síntesis de RGD-azida derivado de 2 <ol><li> Disolver 50 mg de RGD (0,145 mmol) en 1 ml de NaOH 1 M. </li><li> Disolver 24 mg de 1 (0,16 mmol) en 2 ml de tetrahidrofurano. </li><li> Añadir toda la solución de RGD a la solución 1 gota a gota a 0 ° C usando un baño de hielo. </li><li> Volver a la temperatura ambiente y se agitó durante la noche. </li><li> Añadir 1 ml de HCl 1 M. </li><li> Eliminar el disolvente bajo presión reducida usando un evaporador rotatorio. </li><li> Caracterizar el OBTained producto por espectroscopia 1 H-NMR, la disolución de la muestra en D 2 O 16. </li></ol> 3. Modificación 3 PAA Acetileno <ol><li> Disolver 200 mg de 35% w / w solución de PAA (2,8 mmol) en 15 ml de agua destilada. </li><li> Añadir 15,4 mg de clorhidrato de propargilamina (0,20 mmol). </li><li> Disolver 42,8 mg de hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt, 0.28 mmol) en 14 ml de una mezcla 1: 1 v / v de acetonitrilo: solución de agua destilada por calentamiento a 50 ° C. </li><li> Añadir toda la solución de HOBt a la solución de PAA a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 53,6 mg de etildimetilaminopropilcarbodiimida (EDC, 0,28 mmol) a la mezcla de reacción. </li><li> Utilice M HCl 1 para ajustar el pH a 5,5 y se agita el sistema de reacción durante la noche a temperatura ambiente. </li><li> Se dializa la solución. Disolver 11,2 g de cloruro sódico en 2 L de agua destilada y a continuación, añadir 0,2 ml de 37% w / w HCl. Se dializa la solución usando una membrana con un M w de corte de 3,5 kDa. </li><li> perform diálisis durante tres días. Cambie la solución de diálisis a diario con 2 L de agua destilada recién preparada que contenga 0,2 ml de 37% w / w HCl. </li><li> Almacenar la solución final a -80 ° C. Liofilizar en un liofilizador de acuerdo con los protocolos del fabricante. </li><li> Caracterizar el polímero funcionalizado por espectroscopia 1H-RMN, disolviendo la muestra en D2O 16. </li></ol> 4. Síntesis de PAA-RGD de polímero 4 <ol><li> Disolver 78 mg de PAA modificada alquino 3 (1,083 mmol) en 10 ml de agua destilada. </li><li> Disolver 25 mg de la RGD derivado de azida 2 (0,0722 mmol) en 5 ml de tetrahidrofurano. </li><li> Añadir toda la solución de RGD a la solución polimérica. </li><li> Añadir 2,2 mg de yoduro de cobre (0,0116 mmol) y 2,2 mg de ascorbato de sodio (0,0111 mmol). </li><li> Se somete a reflujo la mezcla resultante durante la noche a 60 ° C, con agitación. </li><li> Enfriar la mezcla a 25 ° C. </li><li> Dialyze la solución. Disolver 11,2 g de cloruro sódico en 2 L de agua destilada y a continuación, añadir 0,2 ml de 37% w / w HCl. Se dializa la solución usando una membrana con un M w de corte de 3,5 kDa. </li><li> Realizar la diálisis durante tres días. Cambie la solución de diálisis a diario con 2 L de agua destilada recién preparada que contenga 0,2 ml de 37% w / w HCl. </li><li> Almacenar la solución final a -80 ° C. Liofilizar en un liofilizador de acuerdo con los protocolos del fabricante. </li><li> Caracterizar el producto obtenido mediante espectroscopia 1H-RMN, disolviendo la muestra en D2O 16. </li></ol> 5. RGD-funcionalizado Hidrogel Síntesis <ol><li> Preparar la PBS. Disolver 645 mg de sal de PBS en 50 ml de agua destilada. </li><li> Mezcla de 40 mg de carbómero y 10 mg de PAA funcionalizado 4 en 9 ml de PBS (paso 5.1), a temperatura ambiente, hasta la disolución completa (30 min). </li><li> Añadir 400 mg de PEG a la solución y mantener la agitación durante 45 min. </li><li> Detener la agitación y dejar que el sistema se estabilice durante 30 minutos. </li><li> Utilice NaOH 1 N para ajustar el pH a 7,4. </li><li> A 5 ml de la mezcla obtenida, añadir 25 mg de polvo de agarosa. </li><li> Irradiar el sistema con radiación de microondas a 500 W hasta que hierva, durante un tiempo por lo general entre 30 segundos y 1 min, y electromagnéticamente calentar hasta 80 ° C. </li><li> Dejar reposar la mezcla se expone a temperatura ambiente hasta que su temperatura se reduce a 50 ° C y añadir 5 ml de PBS (paso 5.1), con el fin de obtener una solución en una proporción 1: 1 volumétrica. </li><li> Preparar 12 cilindros de acero de la placa que contiene múltiples pocillos con un diámetro de 1,1 cm. </li><li> Tomar 500 ml de alícuotas de la solución y colocarlos a cada uno cilindros de acero. </li><li> Deja en reposo durante 45 minutos hasta que la gelificación completa del sistema. </li><li> Retirar los cilindros utilizando una pinza de acero inoxidable para obtener los hidrogeles. </li></ol> 6. La carga de herramienta terapéutica (medicamentos o células) <ol><li> Repita steps 05.01 a 05.07. </li><li> Cuando la mezcla (ya en estado de sol) alcanza 37 ° C, añadir 5 ml de la solución que contiene la solución de fármaco o de células de cultivo deseada, con el fin de obtener un sistema final en una proporción 1: 1 volumétrica. </li><li> Repita los pasos 5.9 a 5.12 para obtener redes poliméricas con biocompuestos físicamente atrapado dentro del gel. </li></ol> 7. Hidrogel Caracterización <ol><li> El análisis FT-IR <ol><li> Después de la formación de gel, en remojo uno de los hidrogeles sintetizados en 2,5 ml de agua destilada durante 24 horas. </li><li> Retire el medio acuoso en el que se sumerge hidrogel y liofilizar con N2 líquido. </li><li> Laminar la muestra de hidrogel de acuerdo con la técnica de pastilla de KBr. <ol><li> Añadir una espátula llena de KBr en un mortero de ágata. Tomar una pequeña cantidad de muestra de hidrogel (0,1-2% de la cantidad de KBr, o sólo lo suficiente para cubrir la punta de espátula) y se mezcla con el polvo de KBr. </li><li> Moler la mezcla hasta que el polvo es fina y homogénea. &lt;/ Li&gt; <li> Utilice el kit de pastilla de KBr para formar el pellet IR. Pulse el polvo usando una prensa de laboratorio Manual: durante 3 min a la capacidad de presión igual a 5 toneladas y luego durante 3 minutos a la capacidad de presión de 10 toneladas. </li><li> Liberar la presión para obtener el sedimento final lo más homogénea y transparente en apariencia. Insertar el pellet en el soporte de muestra de IR y ejecutar el espectro 16. </li></ol></li></ol></li><li> Estudios de gelificación <ol><li> Llene el tubo de microcentrífuga de 2 ml con 900 l de PBS y se equilibre a 37 ° C. </li><li> Añadir 100 l de la solución de polímero preparada para formar el hidrogel y se incuba a 37 ° C. </li><li> Invertir el tubo y observe si el gel fluye a 1, 2, 5, 10 y 20 min. Registre el tiempo en el que el gel no fluye como el tiempo de gelificación. </li></ol></li></ol>

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Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses y no han recibido ningún pago en la preparación de este manuscrito.

La modificación posterior a la polimerización de PAA con restos de alquino y la funcionalización de RGD con el grupo azida garantizan la formación de un enlace estable entre el polímero y el péptido. De hecho, el triazol sirve como una unidad de enlace rígida entre los átomos de carbono, unida a las posiciones 1,4 del anillo de 1,2,3-triazol y no se puede escindir hidrolíticamente o de otra manera. Además, el triazol es extremadamente difícil de oxidar y reducir, a diferencia de otras estructuras cíclicas como los benzen...

Los hidrogeles son redes tridimensionales formadas por polímeros reticulados hidrófilos, que son naturales o sintéticos, y caracterizado por una estructura tridimensional distintivo. Estos aparatos son cada vez más atractivo en los campos de la biomedicina de la administración de fármacos, la ingeniería de tejidos, los portadores del gen y sensores inteligentes 1,2. De hecho, su alto contenido de agua, así como sus propiedades reológicas y mecánicas los hacen candidatos adecuados para imitar microambientes de tejidos blandos y hacerlos herramientas eficaces para citoquina soluble en agua o entrega del factor de crecimiento. Uno de los más prometedores es el uso como un biomaterial inyectable que lleva células y compuestos bioactivos. Los hidrogeles pueden mejorar la supervivencia celular y destino de la célula de control de potencia colocando y entregar con precisión las señales de regulación de células madre de una manera relevante fisiológico, como se observa en in vitro e in vivo en experimentos de 3,4. La ventaja principal de esto es la posibilidadpara mantener las células inyectadas dentro de la zona de inoculación (in situ), minimizando la cantidad de células que sale de la zona y se extravasa en el torrente circulatorio, migrando por todo el cuerpo y perder el objetivo de destino 5. La estabilidad de las redes de hidrogel tridimensionales se debe a sus sitios de reticulación, formados por enlaces covalentes o fuerzas de cohesión entre las cadenas de polímero 6. En este marco, la química selectiva ortogonal aplicado a cadenas de polímero es una herramienta versátil capaz de mejorar el rendimiento de hidrogel 7. En efecto, la modificación de polímeros con grupos químicos adecuados podría ayudar a proporcionar químico apropiado, física y las propiedades mecánicas para mejorar la viabilidad celular y su uso en la formación de tejido. De la misma manera, entre las técnicas para cargar las células o factores de crecimiento dentro de la matriz de gel, el uso del péptido RGD permite mejoras en la adhesión celular y la supervivencia. RGD es un tripéptido compuestode arginina, glicina y ácido aspártico, que es con mucho el más eficaz y a menudo empleado tripéptido debido a su capacidad para hacer frente a más de un receptor de adhesión celular y su impacto biológico en anclaje de células, el comportamiento y la supervivencia 8,9. En este trabajo, la síntesis de hidrogeles RGD-funcionalizado se estudió con el objetivo de diseñar redes caracterizadas por propiedades bioquímicas suficientes para un microambiente celular hospitalario. El uso de radiación de microondas en la síntesis de hidrogel ofrece un procedimiento sencillo para minimizar las reacciones secundarias y obtener mayores velocidades de reacción y los rendimientos en un periodo de tiempo más corto en comparación con los procesos térmicos convencionales 10. Este método no requiere etapas de purificación y los rendimientos de hidrogeles estériles debido a las interacciones de los polímeros y la ausencia de disolvente orgánico en el sistema de reacción 11. Por lo tanto, se asegura un alto porcentaje de RGD vinculados a la red polimérica, porque no modespecifica- se requiere que los grupos químicos de polímeros que intervienen en la formación de gel. Los grupos carboxilo, de PAA y carbómero, y grupos hidroxilo, de PEG y de agarosa, dan lugar a la estructura tridimensional de hidrogel a través de una reacción de policondensación. Los polímeros mencionados se utilizan para la síntesis de hidrogeles en los tratamientos de reparación de lesiones de médula espinal 12. Estos dispositivos, como se informó en trabajos anteriores 13,14, muestran una alta biocompatibilidad, así como propiedades mecánicas y fisicoquímicas que se asemejan a los de muchos tejidos vivos y en la naturaleza tixotrópica. Por otra parte, permanecen localizados in situ, en la zona de la inyección. En este trabajo, los grupos carboxilo de PAA se modifican con un resto alquino (Figura 1), y un compuesto RGD-azida se sintetiza la explotación de la reactividad del grupo terminal tripéptido -NH 2 con un compuesto químico preparado con la estructura (CH 2) n - N 3 (&lt;strong&gt; Figura 2). Posteriormente, el PAA modificado reacciona con el derivado de RGD-azida a través de CuAAC reacción clic 15-17 (Figura 3). El uso de un catalizador de cobre (I) conduce a importantes mejoras tanto en la velocidad de reacción y de la regioselectividad. La reacción CuAAC es ampliamente utilizado en la síntesis orgánica y en la ciencia de polímeros. Combina alta eficiencia y una alta tolerancia a los grupos funcionales, y no se ve afectado por el uso de disolventes orgánicos. Una alta selectividad, un tiempo de reacción rápida y sencilla un procedimiento de purificación permiten la obtención de polímeros estrella, copolímeros de bloques o cadenas de injerto restos deseados 18. Esta estrategia clic hace que sea posible modificar polímeros después de la polimerización para personalizar las propiedades físico-químicas de acuerdo con la aplicación bioquímica final. Las condiciones experimentales CuAAC son fácilmente reproducible (la reacción es insensible al agua, mientras que la oxidación de cobre se puede producir mínimamente), y la naturaleza detriazol formado asegura la estabilidad del producto. El uso de metal de cobre se puede considerar un punto crítico, debido a su potencial efecto tóxico contra las células y en el microambiente biológica, pero la diálisis se utiliza como un método de purificación para permitir la completa eliminación de residuos catalíticos. Finalmente, PAA modificada RGD se utiliza en la síntesis de hidrogel (Figura 4) y las propiedades fisicoquímicas de las redes resultantes son investigados, con el fin de comprobar la funcionalidad potencial de estos sistemas como células o fármacos portadores. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig1.jpg" /> Figura 1: PAA modificó la síntesis de alquino Un esquema de funcionalización PAA con el grupo alquino;. &quot;n&quot; indica los monómeros con grupo carboxilo que reacciona con propargilamina. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver</a>una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig2.jpg" /> Figura 2:.. RGD-azida síntesis La síntesis de derivados de RGD-azida <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig3.jpg" /> Figura 3: Haga clic en el Esquema de reacción de la reacción entre el derivado clic RGD-azida y alquino-PAA.. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig4.jpg" /> Figura 4: Hidrogel syntHESIS. RGD funcionalizado procedimiento de síntesis de hidrogel. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Solución de poli(ácido acrílico) promedio Mw ~100,000, 35% en peso en H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>523925</td><td>CAS 9003-01-4</td></tr><tr><td>Poli(etilenglicol) 2,000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84797</td><td>CAS 25322-68-3</td></tr><tr><td>Carbomeer 974P</td><td>Fagron</td><td>1387083</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>Invitrogen Corp.</td><td>16500-500</td> Péptido RGD de <td>agarosa ultrapura</td></tr><tr><td></td><td>abcam</td><td>ab142698</td><td></td></tr><tr><td>ácido 4-azidobutanoico</td><td>Aurum Pharmatech</td><td>Z-2421</td><td>&nbsp; CAS 54447-68-6</td></tr><tr><td>Cloruro de oxalilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O8801</td><td>CAS 79-37-8</td></tr><tr><td>Clorhidrato de proparilamina 95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P50919</td><td>CAS 15430-52-1</td></tr><tr><td>Yoduro de cobre (I)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3140</td><td>CAS 7681-65-4</td></tr><tr><td>Ascorbato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0000039</td><td>CAS 134-03-2</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Laboratorio de espectro de membrana de diálisis</td><td>, Inc.</td><td>132725</td><td>Membrana de diálisis Spectra/Por 3&nbsp; Tubería RC estándar MWCO: 3.5 kD</td></tr></tbody></table>

la síntesis de hidrogeles funcionalizado-rgd como una herramienta para aplicaciones terapéuticas

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

El uso de polímeros como biomateriales ha proporcionado ventajas significativas en aplicaciones terapéuticas. En particular, la posibilidad de modificar y funcionalizar cadenas poliméricas con compuestos capaces de mejorar la biocompatibilidad, las propiedades mecánicas o la viabilidad celular permite el diseño de nuevos materiales para hacer frente a nuevos retos en el campo biomédico. Con las estrategias de funcionalización de polímeros, la química de clic es una herramienta poderosa para mejorar la compatibilidad celular y las propiedades de administración de fármacos de los dispositivos poliméricos. Del mismo modo, la necesidad fundamental de la biomedicina de utilizar herramientas estériles para evitar posibles efectos secundarios adversos, como la toxicidad o la contaminación del entorno biológico, da lugar a un interés cada vez mayor en la estrategia asistida por microondas.
La combinación de la química de clic y el método asistido por microondas es adecuada para producir hidrogeles biocompatibles con las funcionalidades deseadas y un rendimiento mejorado en aplicaciones biomédicas. Este trabajo tiene como objetivo sintetizar hidrogeles funcionalizados con RGD. El RGD (ácido arginilglicilaspártico) es un tripéptido que puede imitar las proteínas de adhesión celular y unirse a los receptores de la superficie celular, creando un microambiente hospitalario para las células dentro de la red polimérica 3D de los hidrogeles. La funcionalización de RGD se produce a través de la cicloadición 1,3-dipolar de Huisgen. Algunos grupos carboxilo PAA se modifican con un resto de alquino, mientras que RGD se funcionaliza con ácido azido como residuo terminal de la secuencia peptídica. Por último, ambos productos se utilizan en una reacción de clic catalizada por cobre para unir permanentemente el péptido al PAA. Este polímero modificado se utiliza con carbómero, agarosa y polietilenglicol (PEG) para sintetizar una matriz de hidrogel. La estructura 3D se forma debido a una reacción de esterificación que involucra grupos carboxilo de PAA y grupos carbómero e hidroxilo de agarosa y PEG a través de policondensación asistida por microondas. La eficiencia del mecanismo de gelificación asegura un alto grado de funcionalización de RGD. Además, el procedimiento para cargar compuestos terapéuticos o herramientas biológicas dentro de esta red funcionalizada es muy sencillo y reproducible.

El derivado de alquino PAA se sintetiza de manera eficiente a partir de ácido poliacrílico y propargilamina, como se muestra en la Figura 1 donde n etiquetas de los monómeros cuyos grupos carboxilo reaccionar con la amina. La identidad del producto se confirmó por espectroscopía de 1 H-NMR. Figura 5 muestra el espectro de 1H-NMR de PAA modificada con triple enlace. <img alt="Figura 5" src="/files...

Presentamos un protocolo para la síntesis de hidrogeles funcionalizados con RGD como dispositivos para la administración de células y fármacos. El procedimiento consiste en la cicloadición de alquina-azida catalizada por cobre (CuAAC) entre el ácido poliacrílico modificado con alquino (PAA) y un derivado de RGD-azida. Los hidrogeles se forman mediante policondensación asistida por microondas y se investigan sus propiedades fisicoquímicas.

La síntesis de hidrogeles funcionalizado-RGD como una herramienta para aplicaciones terapéuticas

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

El objetivo general de esta metodología es sintetizar hidrogeles para aplicaciones en ingeniería de tejidos de manera muy sencilla. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ingeniería de tejidos, como la posibilidad de mantener una alta viabilidad celular en sistemas de cultivo celular tridimensionales. La principal ventaja de esta técnica es que, al utilizar una reacción rápida, podemos modificar fácilmente los sistemas de hidrogeles para mejorar su capacidad de mantener viables a las células.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de la lesión de la médula espinal porque las células cargadas dentro del andamiaje pueden reconstruir el tejido dañado. Este método puede proporcionar una información significativa sobre las terapias celulares en medicina regenerativa y sus implicaciones en muchas metodologías. También puede aplicarse en varios otros sistemas como el óseo, el cardíaco y el cartilaginoso.Para sintetizar el derivado de RGD-azida, disuelva 50 miligramos de RGD en un mililitro de hidróxido de sodio uno molar. Luego, disuelva 24 miligramos de cloruro de 4-azidobutanoyl en dos mililitros de tetrahidrofuran. Añada toda la solución de RGD a la solución de cloruro de 4-azidobutanoyl a cero grados Celsius gota a gota.Dejar que alcance la temperatura ambiente y agitar durante la noche. Añadir un mililitro de HCl uno molar. Eliminar el disolvente bajo presión reducida utilizando un evaporador rotatorio.Caracterice el producto obtenido mediante espectroscopía de resonancia magnética nuclear de protones, disolviendo la muestra en óxido de deuterio o D2O. Para realizar la modificación con alquino del PAA, disuelva 200 miligramos de una solución de PAA al 35% en peso en 15 mililitros de agua destilada. Añada 15,4 miligramos de clorhidrato de propargilamina.Luego, disuelva 42,8 miligramos de HOBt en 14 mililitros de una solución de acetonitrilo y agua destilada en una proporción uno a uno, calentando a 50 grados Celsius. Añada toda la solución de HOBt a la solución de PAA a temperatura ambiente. A continuación, añada 53,6 miligramos de EDC a la mezcla de reacción.Utilice HCl 1 M para ajustar el pH a 5,5 y agite el sistema de reacción durante la noche a temperatura ambiente. A continuación, disuelva 11,2 gramos de cloruro de sodio en dos litros de agua destilada. Luego agregue 200 microlitros de HCl al 37 % en peso.Dialice la solución utilizando una membrana con un corte de peso molecular de 3,5 kilodaltons. Realice la diálisis durante tres días. Cambie la solución de diálisis diariamente con dos litros de agua destilada recién preparada que contenga 200 microlitros de HCl al 37 %p/p.Almacene la solución final a menos 80 grados Celsius. Caracterice el polímero funcionalizado mediante espectroscopía de resonancia magnética nuclear de protones, disolviendo la muestra en D2O. Para sintetizar el polímero PAA-RGD, disuelva 78 miligramos de PAA modificado con alquino en 10 mililitros de agua destilada.Luego, disuelva 25 miligramos del derivado de RGD-azida en cinco mililitros de tetrahidrofuran. Añada toda la solución de RGD a la solución polimérica. A continuación, agregue 2,2 miligramos de yoduro de cobre.Y 2,2 miligramos de ascorbato de sodio. Reflujar la mezcla resultante durante la noche a 60 grados Celsius con agitación. Enfriar la mezcla a 25 grados Celsius.Para realizar la diálisis de la solución, disuelva 11,2 gramos de cloruro de sodio en dos litros de agua destilada y agregue 200 microlitros de HCl al 37 por ciento en peso por peso. Realice la diálisis durante tres días. Cambie la solución de diálisis diariamente con dos litros de agua destilada recién preparada que contenga 200 microlitros de HCl al 37 % en peso por peso.Luego, coloque la solución final a menos 80 grados Celsius. Caracterice y almacene el polímero PAA-RGD resultante tal como se hizo con sus constituyentes. Mezcle 40 miligramos de carbómero y 10 miligramos del PAA funcionalizado en nueve mililitros de solución salina tamponada con fosfato a temperatura ambiente hasta lograr la disolución completa.Añada 400 miligramos de PEG a la solución y continúe agitando durante 45 minutos. Detenga la agitación y deje que el sistema repose durante 30 minutos. Luego, use hidróxido de sodio uno molar para ajustar el pH a 7,4.A cinco mililitros de la mezcla obtenida, añada 25 miligramos de polvo de agarosa. Irradie el sistema con radiación de microondas a 500 vatios durante 30 segundos a un minuto hasta que hierva. Y caliente electromagnéticamente la solución hasta 80 grados Celsius.Deje la mezcla expuesta a temperatura ambiente hasta que su temperatura disminuya a 50 grados Celsius. Luego, agregue cinco mililitros de PBS para obtener una solución en una relación volumétrica uno a uno. Prepare una placa de 12 pocillos que contenga cilindros de acero con un diámetro de 1,1 centímetros.Tome alícuotas de 500 microlitros de la solución y colóquelas en cada cilindro de acero. Deje reposar la placa durante 45 minutos hasta que se complete la gelificación del sistema. Retire los cilindros utilizando pinzas de acero inoxidable para obtener los hidrogeles.Consulte el protocolo escrito para caracterizar las propiedades fisicoquímicas de los hidrogeles funcionalizados con RGD. El carbómero 974P, el PAA-RGD y el PEG, junto con el agarosa, participan en una policondensación aleatoria estadística tras la irradiación con microondas. Los grupos hidroxilo presentes en el PEG y en el agarosa reaccionan con los grupos carboxilo presentes en el carbómero 947P y en el PAA-RGD para formar hidrogeles ACPEG-RGD.Considerando las propiedades reológicas, se encontró que el módulo de almacenamiento era aproximadamente una orden de magnitud mayor que el módulo de pérdida, lo que indica un material elástico en lugar de viscoso. Además, es claramente visible que el comportamiento del hidrogel está dominado, a valores bajos de deformación, por el módulo elástico. La microscopía electrónica de barrido muestra la morfología de una muestra de hidrogel funcionalizado con RGD y de un hidrogel sin funcionalización.Ambos hidrogeles revelaron que poseen una estructura altamente enredada de poros interconectados, con algunos poros más grandes que contienen poros pequeños y algunas redes fibulares en las paredes de los poros. Las propiedades similares indican que la presencia de RGD no altera la red polimérica. Tras este desarrollo, esta técnica allanó el camino para la investigación en el campo de la ingeniería de tejidos, con el fin de explorar la estabilidad de estos sistemas de cultivo celular en varias enfermedades adicionales.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo funcionalizar hidrogeles. Mejorando su capacidad para mantener células madre viables.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Un bioprinter se utilizó para crear hidrogeles modelado basado en un molde de sacrificio. El molde poloxámero se rellenó con un segundo hidrogel y luego se eluyó, dejando huecos que estaban llenos de una tercera hidrogel. Este método utiliza elución rápida y buena capacidad de impresión de poloxámero para generar arquitecturas complejas a partir de biopolímeros.

Impresión Moldes inversa termosensible para la Creación de modelado hidrogeles de dos componentes para el 3D de cultivo celular

Este video ilustrar un método rápido y eficiente de metacrilato de poli (etilenglicol), lo que permite polimerizaciones de cadena y la síntesis de hidrogel. Demostrará cómo introducir de manera similar funcionalidades metacrilamida en péptidos, detalle los métodos analíticos comunes para evaluar la eficiencia de funcionalización, proporcionar sugerencias para la solución de problemas y modificaciones avanzadas y demostrar las técnicas típicas de caracterización de hidrogel.

Funcionalización asistida por microondas de poli (etilenglicol) y los péptidos sobre resina para uso en polimerizaciones de cadena y Formación de hidrogel

Describimos un proceso secuencial para la formación mediada por luz y el posterior modelado bioquímico de matrices de hidrogel sintético para aplicaciones de cultivo celular tridimensional. Se demuestra la construcción y modificación de hidrogeles con química fotoclic citocompatible. Además, se presentan técnicas sencillas para cuantificar y observar patrones y determinar la viabilidad celular dentro de estos hidrogeles.

Formación luz mediada y el patrón de hidrogeles para aplicaciones de cultivo celular

Se describen los protocolos para la fabricación de hidrogeles degradables interpenetrantes basados en hidrazona Cross-linking de oligómeros poliméricos en la escala de a granel microescala, nanoescala y el último para la preparación de nanopartículas de gel y nanofibras.

Fabricación de hidrogeles degradables de interpenetrantes en múltiples escalas de la longitud mediante extrusión reactiva, microfluídica, uno mismo-Asamblea y Electrospinning

Diferentes métodos para manipular arquitectura tridimensional en Hidrogeles basados en proteína se evalúan aquí con respecto a las propiedades del material. Las redes macroporoso son funcionalizadas con un péptido de la célula-adhesivo, y se evalúa su viabilidad en cultivo de células utilizando dos líneas celulares de diferentes modelos.

Fácil manipulación de arquitecturas en Hidrogeles basados en proteínas para aplicaciones de la cultura de célula

En este método, utilizamos fotopolimerización e inmovilización de técnicas de química haga clic en crear patrones de proteína o péptido en la superficie del hidrogel de polietilenglicol (PEG), proporcionando señales bioactivas para el estudio de las respuestas celulares en vitro .

Patrones bioactivas proteínas o péptidos en hidrogel con fotoquímica para usos biológicos

Modelos de cultura bicapa actuales no permiten estudios funcionales en vitro que imitan en vivo microambientes. Uso de glicol de polietileno y un método de plantillas de óxido de zinc, este protocolo describe el desarrollo de una membrana del sótano biomiméticos ultrafino con rigidez sintonizable, porosidad y composición bioquímica que imita muy de cerca en vivo matrices extracelulares.

Hidrogeles ultrafino Porated elástico como una membrana del sótano biomiméticos para doble cultura de la célula

Este protocolo describe la síntesis y formulación de biomateriales inyectables de hidrogel de polímeros y nanopartículas supramoleculares (PNP). Se demuestran las aplicaciones de estos materiales para la administración de fármacos, la estabilización biofarmacéutica y la encapsulación y administración celular.

Hidrogeles de polímeros y nanopartículas supramoleculares inyectables para aplicaciones de administración de células y fármacos

El protocolo presentado aquí muestra la síntesis de un fuerte adhesivo de gelatina de hidrogel o-nitrosobenzaldehído (gelatina-NB). La gelatina-NB tiene una capacidad de adhesión tisular rápida y eficiente, que puede formar una fuerte barrera física para proteger las superficies de las heridas, por lo que se espera que se aplique al campo de la biotecnología de reparación de lesiones.

Síntesis de hidrogel adhesivo fuerte, gelatina O-nitrosobenzaldehído

Aquí, presentamos dos protocolos para incrustar reacciones de síntesis de proteínas libres de células en matrices de hidrogel a macroescala sin la necesidad de una fase líquida externa.

Métodos para incorporar reacciones de síntesis de proteínas libres de células en hidrogeles a macroescala

Aprende a sintetizar hidrogeles funcionalizados con RGD mediante CuAAC y polimerización asistida por microondas para ingeniería de tejidos. Este método mejora la viabilidad celular en cultivos tridimensionales y ofrece aplicaciones prometedoras en terapias regenerativas.

La síntesis de hidrogeles funcionalizado-RGD como una herramienta para aplicaciones terapéuticas

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