Enumeración de células madre neurales Usando ensayos clonales

El objetivo general de este procedimiento es enumerar la frecuencia de células madre neurales en una población determinada mediante la formación y diferenciación de neuroesferas bajo condiciones clonales. Este método tiene aplicaciones clave en el campo de las células madre neurales, como la evaluación de marcadores candidatos de células madre neurales, la purificación de células madre neurales y la distinción entre células madre neurales y progenitores neurales. Las ventajas de este método son que requiere 13 días para realizarse, lo cual es más corto que los métodos actuales para numerar la frecuencia de células madre neurales, y se lleva a cabo bajo condiciones clonales.

Para comenzar este procedimiento, el día uno, prepare el medio de crecimiento para CNE combinando el medio DMEM F12 con B27, EGF, bFGF y penicilina-estreptomicina. A continuación, disocie los neuroesferas de ratón E14.5 en un mililitro de medio de crecimiento para CNE y un mililitro de hidróxido de sodio 0,05 N durante siete minutos a temperatura ambiente. Pipetee las células hacia arriba y hacia abajo ocasionalmente para mantenerlas en suspensión, luego agregue un mililitro de ácido clorhídrico 0,05 N para neutralizar el álcali.

A continuación, realice un recuento celular utilizando tinción con azul de tripano y un hemocitómetro. Posteriormente, siembre células neuroesféricas de ratón E14.5 individuales a una densidad de 50 células por mililitro o menos en 100 microlitros de medio de crecimiento para CNE en una placa de 96 pocillos. Incube las células a 37 grados Celsius, 5 %CO2 durante una semana para generar neuroesferas clonales.

Para cultivar neuroesferas para el medio acondicionado, el día tres disocie neuroesferas de ratón E14.5 y siembre las células individuales a una densidad de 20.000 células por mililitro en 10 mililitros de medio de crecimiento para CNE en una placa de cultivo de 10 centímetros. A continuación, incube las células a 37 grados Celsius, 5 %CO₂ durante cinco días para generar neuroesferas cultivadas en bloque. El día ocho, prepare la solución de recubrimiento mezclando 700 microlitros de poli-L-lisina al 0,01 %, 70 microlitros de laminina, agregue un miligramo por mililitro y 6.230 microlitros de PBS.

A continuación, recubra un plato de cultivo de 10 centímetros con siete mililitros de solución de poli-L-lisina laminina durante dos horas a 37 grados Celsius. Utilizando una pipeta serológica de 10 mililitros, transfiera todas las neuroesferas cultivadas en masa a un tubo cónico de centrífuga de 15 mililitros. Centrifugue las neuroesferas a 171 ×g durante un minuto a temperatura ambiente y elimine completamente el sobrenadante.

A continuación, prepare el medio de diferenciación de CNE combinando el medio DMEM F12 con B27 y SFB. Añada 10 mililitros de medio de diferenciación de CNE a las neuroesferas y pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces para resuspender las neuroesferas. Luego aspire la poli-L-lisina laminina del platillo de cultivo de 10 centímetros y lave una vez con 10 mililitros de PBS.

Transfiera todas las neuroesferas a la placa de cultivo de 10 centímetros recubierta con poli-L-lisina y laminina, e incúbelas durante la noche a 37 grados Celsius, 5 %CO2 para que las neuroesferas se adhieran a la placa. En el día ocho, cuente el número de neuroesferas formadas en cada pocillo bajo un microscopio, luego recubra cada pocillo de una cubreobjetos con cámara de 50 pocillos con 10 microlitros de solución recubridora de poli-L-lisina y laminina durante dos horas a 37 grados Celsius. A continuación, prepare tres tubos cónicos para centrífuga de 50 mililitros que contengan 30 mililitros de PBS cada uno.

Utilizando fórceps estériles, retire la cubreobjetos con cámara de 50 pocillos recubierta, sumerja la cubreobjetos con cámara en el primer tubo de PBS, seguido por el segundo y luego el tercero, para eliminar la solución de recubrimiento. Posteriormente, aspire cualquier líquido residual de los pocillos de la cubreobjetos con cámara. Transfiera suavemente todo el medio y las neuroesferas de cada pocillo de la placa de 96 pocillos a un solo recipiente de cultivo de 10 centímetros.

Asegúrese de seleccionar solo una neuroesfera cada vez ajustando la columna de la pipeta a dos microlitros; bajo el microscopio, tome una neuroesfera de muestra utilizando una micropipeta P10 equipada con una punta de pipeta de 10 microlitros. Las neuroesferas pueden seleccionarse bajo el microscopio, colocarse en una cabina de flujo laminar o sobre una superficie de trabajo. Luego, transfiera la neuroesfera al centro de un pocillo de la cubreobjetos con cámaras recubierta de 50 pocillos.

Repita los procedimientos hasta que cada pocillo de la cubreobjetos con cámaras contenga una neuroesfera. Posteriormente, agregue 10 microlitros de medio de diferenciación de CNE a cada pocillo de la cubreobjetos con cámaras. Coloque la cubreobjetos con cámaras en una placa de cultivo de 10 centímetros.

Se pueden colocar hasta dos laminillas con cámaras en un recipiente de 10 centímetros. Pipetee PBS a lo largo de los bordes del recipiente para evitar el secado del medio de diferenciación de CNE. Incube la laminilla con cámara durante la noche a 37 grados Celsius, 5%CO2.

En el día nueve, transfiera el medio acondicionado de los neuroesferoides cultivados a granel a un tubo cónico de centrífuga de 15 mililitros. Utilizando una jeringa estéril de 20 mililitros, pase el medio acondicionado a través de un filtro de 0,2 micrómetros para eliminar cualquier célula o residuo. Luego, transfiera el medio acondicionado filtrado de vuelta a la placa de cultivo de 10 centímetros.

A continuación, utilizando fórceps estériles, coloque suavemente la cubreobjetos con cámara sobre el medio acondicionado de forma invertida, de modo que las neuroesferas queden orientadas hacia abajo. Incube la cubreobjetos con cámara durante tres días a 37 grados Celsius, 5%CO2. En el día 12, retire suavemente la cubreobjetos con cámara de la placa de cultivo de 10 centímetros utilizando fórceps estériles.

Sumerja suavemente la lámina en PBS para eliminar el medio condicionado. Luego, retire cuidadosamente la junta de silicona de la lámina, haciendo esto de forma lenta y delicada para evitar romperla. Tenga en cuenta el lado donde están adheridos los neuroesferas diferenciados.

A continuación, pipetee un milímetro de paraformaldehído al 4 % sobre un trozo de película de parafina cortado al tamaño del cubreobjetos. Coloque suavemente el cubreobjetos sobre la película de parafina con las neuroesferas orientadas hacia abajo, en contacto con el paraformaldehído, y fije las neuroesferas durante 20 minutos a temperatura ambiente. Aquí, se seleccionaron neuroesferas individuales y se diferenciaron en un cubreobjetos con cámara de 50 pocillos durante tres días.

Esta es una imagen representativa de una neuroesfera tripotente teñida con DAPI y una inmunotinción para GFAP, TUJ1 y O4. Esta imagen muestra la superposición de DAPI, GFAP, TUJ1 y O4. Este protocolo se utiliza para evaluar la capacidad de LeX, un marcador conocido de CNE, para enriquecer células CNE. Este gráfico muestra el porcentaje de neuroesferas unipotentes, bipotentes y tripotentes generadas por células positivas y negativas para LeX. Y las células positivas para LeX generan significativamente más neuroesferas tripotentes que las células negativas para LeX.

Esta tabla muestra que la frecuencia de CSC de células LeX positivas y células LeX negativas se calculó como el producto de UFNT y el porcentaje de neuroesferas tripotentes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo se pueden cultivar y diferenciar las neuroesferas en condiciones clonales para enumerar la frecuencia de células madre neurales. Al realizar este método, es importante utilizar medios de crecimiento y diferenciación recién preparados, así como una solución de recubrimiento recién preparada, para garantizar condiciones óptimas de crecimiento y diferenciación para las neuroesferas.

Una vez dominado, este método puede realizarse en 13 días, un tiempo más corto en comparación con los métodos actuales para enumerar la frecuencia de células madre neurales. Este método podría utilizarse junto con métodos actuales, como el ensayo de formación de colonias neurales, para enriquecer células madre más nuevas e identificar un marcador definitivo de células madre neurales.