Dirigida Packaging de proteínas dentro de la membrana externa de vesículas de Escherichia coli: Diseño, Producción y Purificación

El objetivo general de este procedimiento es purificar y caracterizar vesículas de membrana externa bacterianas llenas de enzimas para su uso como reactivos catalíticos in vitro. Esta técnica de aislamiento enzimático permite que los OMV bacterianos se recolecten de los medios de cultivo y luego se empleen para realizar la catálisis libre de células de un compuesto organofosforado. El empaquetamiento dirigido dentro de OMV bacterianos mejora significativamente la estabilidad de la enzima en una variedad de condiciones de reacción y almacenamiento, a diferencia de las técnicas tradicionales que a menudo resultan en una pérdida gradual y continua de la actividad enzimática.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el empaquetamiento de proteínas con relevancia en múltiples campos, como el desarrollo de terapias, la remediación o el desarrollo de sistemas catalíticos libres de células. Si bien este protocolo detalla la purificación de OMV a partir de E. coli, las técnicas con modificación de la estrategia de empaquetamiento podrían usarse fácilmente para la purificación de OMV a partir de una variedad de cultivos de células microbianas. Después de generar vesículas de membrana externa o OMV en bacterias de acuerdo con el protocolo de texto, centrifugue el medio de cultivo bacteriano intacto a 7.000 veces G y cuatro grados Celsius durante 15 minutos.

Retire y guarde el sobrenadante, teniendo cuidado de no alterar la pellet de la celda. Luego, someta el sobrenadante a un segundo centrifugado para asegurarse de que se eliminen todas las bacterias del medio. Para eliminar los agregados de proteínas y el material celular grande del medio de cultivo guardado, extraiga la solución en una jeringa estéril de 10 a 50 mililitros.

Coloque un filtro de 0,45 micras para atraer el extremo de la jeringa. A continuación, presione el émbolo y recoja el flujo en un nuevo tubo. Alternativamente, filtre al vacío el medio de cultivo transfiriéndolo a un aparato de filtración estéril.

Conecte la unidad a una bomba de vacío o aspirador de fregadero para generar succión. Transfiera el medio filtrado a un nuevo recipiente. Para aislar los OMV, transfiera el medio de cultivo filtrado a tubos de ultracentrifugación.

Haga girar el medio a aproximadamente 150.000 veces G y cuatro grados Celsius durante tres horas utilizando un rotor que corresponda a los tubos que se están utilizando. Inmediatamente después de la ultracentrifugación para evitar la pérdida de masa del pellet, decantar el medio de cultivo agotado en OMV del pellet de OMV ligeramente marrón que puede o no ser visible a simple vista. El pellet OMV formado después de la ultracentrifugación solo puede adherirse sin apretar a la vesícula de centrifugación.

Se debe tener cuidado al decantar para asegurarse de que el pellet no se desprenda ni se pierda. Guarde el sobrenadante para la dispersión dinámica de la luz posterior para verificar que las partículas OMV se agotaron completamente del medio. Agregue de 0.5 a un mililitro de PBS filtrado estéril, PH 7.4 u otro tampón filtrado, según lo determinen las necesidades o condiciones experimentales, al pellet y déjelo incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.

A continuación, pipetee con cuidado la solución OMV purificada, mezclando suavemente para asegurarse de que todo el pellet se ha solubilizado. Para determinar la distribución del tamaño OMV, abra el software de seguimiento de nanopartículas DLS para el instrumento que se está utilizando. Encienda el microscopio y limpie todas las superficies del microscopio y de la unidad de seguimiento de nanopartículas.

Con una jeringa estéril de un mililitro, agregue aproximadamente 0,5 mililitros de muestra de OMV directamente a la ventana de visualización del dispositivo de seguimiento de partículas a través del accesorio inferior, teniendo cuidado de cubrir toda la ventana de visualización sin inyectar burbujas de aire en el sistema. Coloque la unidad de seguimiento de nanopartículas en la platina del microscopio y encienda el láser. A continuación, haga clic en Capturar en el software.

Ajuste el enfoque y la etapa del microscopio para visualizar las partículas en la pantalla de vista previa presente en la ventana del software. Ajuste el obturador de la cámara y la ganancia de la cámara hasta que las partículas brillantes se visualicen claramente sobre un fondo oscuro. Ajusta la duración de la captura a 60 segundos y, a continuación, haz clic en Grabar.

Cuando se le solicite, introduzca la temperatura del dispositivo de muestra, etiquete la muestra y guarde los datos de vídeo al final de cada ejecución en una carpeta designada por el usuario. Mantenga todos los parámetros de análisis en modo de detección automática y haga clic en Secuencia de proceso. Registre la distribución del tamaño de partícula y la concentración como partículas por mililitro según lo determine el software.

Para determinar el contenido de proteína OMV, utilice SDS-PAGE y Western Blots para evaluar la producción de enzimas de pureza OMV y la eficiencia de reticulación de SpyCatcher o SC a SpyTag o ST. Es imperativo confirmar la expresión de las enzimas objetivo y la proteína de anclaje. La expresión de proteínas recombinantes a menudo puede ser infructuosa por una variedad de razones, y la producción exitosa de proteínas debe confirmarse antes de la caracterización de OMV.

Para llevar a cabo un ensayo de actividad de fosfotriesterasa o PTE, agregue cinco microlitros de una dilución de uno a 1.000 de paraoxón en tampón CHES a cinco microlitros de OMV purificados en 90 microlitros de CHES. Tome lecturas de absorbancia a 405 nanómetros y 348 nanómetros cada 20 segundos durante aproximadamente dos horas de tiempo de reacción total para monitorear la progresión del producto de descomposición cromogénica del paraoxón p-nitrofenol. Por último, realizar el análisis de datos según el protocolo de texto.

A continuación se muestran ejemplos de la morfología de los OMV purificados a partir de E. coli a través de SEM. Los OMV varían en tamaño de 50 a 250 nanómetros según se determine utilizando instrumentación de seguimiento de partículas. En este gráfico, se muestra la concentración absoluta de OMV.

Cuando N terminal OMP-A-ST se co-transformó con PTE-SC en presencia de arabinosa e IPTG, se observó un aumento significativo en la producción de OMV en comparación con las muestras de control. El SDS-PAGE y los Western Blots que se ven aquí caracterizan aún más el contenido de proteína OMV y la expresión de proteína recombinante para OMP-A-ST, OMP-A nativo, PTE-SC y OMP-A-ST-PTE-SC. En esta figura, los niveles generales de expresión de PTE y la eficiencia de empaquetamiento de OMV en los gránulos de células, el sobrenadante de UC y los gránulos de UC OMV purificados se determinaron mediante mediciones iniciales de velocidad utilizando paraoxón como sustrato cromogénico.

En este caso, se utilizó Triton X-100 para verificar la translocación de paraoxón a través de bicapas OMV intactas. Hubo poca diferencia de actividad con o sin detergente, lo que indica que el paraoxón pasa libremente a través de los poros endógenos en el OMV. Finalmente, como se ve en este experimento, los datos cinéticos de PTE-SC se ajustan a una ecuación cinética enzimática estándar de Michaelis-Menten para N terminal OMP-A-ST co-transformado con PTE-SC en presencia de una arabinosa e IPTG y PTE-SC en presencia de activación de arabinosa.

Una vez que se han hecho y confirmado todas las construcciones genéticas, el empaquetamiento de la enzima y la purificación de OMV se pueden lograr durante un período de dos días. Es necesario un tercer día para confirmar y caracterizar los OMV cada vez que se desarrolla un nuevo constructo. Al intentar este procedimiento, es importante recordar verificar las clasificaciones de seguridad de todos los materiales y equipos de centrifugación.

Además, es importante verificar el éxito de cada paso antes de pasar al siguiente. Los pasos de caracterización descritos aquí se pueden complementar con otros para confirmar el empaquetamiento de la enzima y la morfología del OMV. La concentración de proteínas, el contenido de lípidos, la concentración de LPS y muchas otras propiedades pueden variar con diferentes cargas útiles y condiciones de aducción y pueden influir en las aplicaciones posteriores.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo purificar y caracterizar OMV llenos de enzimas, así como realizar ensayos preliminares para evaluar la actividad de la carga enzimática. No olvide que trabajar con bacterias y reactivos químicos puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben usar precauciones como una técnica aséptica adecuada y equipo de protección personal mientras se realiza este procedimiento.