Name: Dirigida Packaging de proteínas dentro de la membrana externa de vesículas de Escherichia coli: Diseño, Producción y Purificación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Aprende a purificar y caracterizar vesículas de membrana externa de Escherichia coli cargadas con enzimas para aplicaciones de catálisis in vitro. Este método mejora la estabilidad enzimática para reacciones sin células.

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Esta investigación fue financiada por la Oficina de Investigación Naval a través de fondos básicos proporcionados al Laboratorio de Investigación Naval.

1. Preparación de los plásmidos <ol><li> Preparar un plásmido (por ejemplo, pET22) que contiene la proteína de anclaje (OmpA) fusionado a un dominio de ligamiento biorthogonal (denominado en el presente Protocolo como ancla-ST), etiqueta de epítopo (por ejemplo, 6xHis, etiquetas myc o FLAG para la purificación e identificación), periplásmico etiqueta de localización, resistencia a los antibióticos, y de origen adecuada de la replicación basada en la cepa bacteriana seleccionada 7. <ol><li> Extraer el ADN plasmídico a partir de cultivos de una noche usando un kit de aislamiento de ADN disponibles comercialmente siguiendo el protocolo del fabricante. </li></ol></li><li> Preparar un plásmido (por ejemplo, pACYC184) que contiene la enzima / proteína (PTE) para ser empaquetados dentro de la OMV fusionado con el dominio de ligamiento bioorthogonal complementaria a la de la proteína de anclaje (denominado en el presente protocolo como enzima-SC), etiqueta de epítopo, etiqueta periplasmic localización, resistencia a los antibióticos que es diferente que el plásmido proteína de anclaje, y orig apropiadoen la replicación basado en la cepa bacteriana seleccionada 7. <ol><li> Extraer el ADN plasmídico a partir de cultivos de una noche usando un kit de aislamiento de ADN disponibles comercialmente siguiendo el protocolo 7 del fabricante. </li></ol></li></ol> 2. Generación de una OMV Packaging E. coli Cultura <ol><li> aislamiento del plásmido <ol><li> Purificar plásmidos que codifican la enzima-SC construir y anclaje-ST construye a partir de líneas celulares de mantenimiento separadas utilizando un kit de aislamiento de plásmido comercial según el protocolo del fabricante 7. Determinar la concentración de ADN y la pureza mediante la medición de la absorbancia a 260 nm y 280 nm. </li></ol></li><li> Co-transformación <ol><li> Seleccione una cepa de E. coli que está disponible comercialmente para facilitar la expresión de proteínas. NOTA: BL21 células se utilizaron aquí (DE3). Se requiere que el lisógeno T7 para expresión de la construcción de anclaje-ST, que se basa en el promotor T7 y la ARN polimerasa T7 para protein expresión. El uso de otras cepas bacterianas requiere o bien la presencia del gen lisógeno T7 o el uso de un plásmido que no sea pET22 7. </li><li> Diluir plásmido de ADN purificado a concentraciones molares equivalentes luego transformarlas en células bacterianas competentes a través de ya sea el calor de transformación de choque o la electroporación siguiendo el protocolo del fabricante para las células competentes elegidos. </li><li> células de la placa transformada Onto Luria-Bertani (LB) placas de agar con ampicilina (pET22) y cloranfenicol (pACYC184) que contiene los antibióticos; ambos presentes a concentraciones finales de 25 mg / ml. </li><li> Coloque la placa de cultivo a 37 ° C durante la noche para aislar sólo los clones que contienen ambos plásmidos. NOTA: Las colonias que sobreviven a la selección de antibióticos se utilizan para todas las futuras preparaciones de OMV. Antibióticos (ampicilina y cloranfenicol) se añadirán a todos los cultivos líquidos para mantener la presión selectiva y asegurar la presencia de ambos plásmidos. </li></ol></li></ol> 3. Producción de OMV <ol><li> expansión de la colonia <ol><li> Inocular 5 ml de medio de cultivo (típicamente Caldo Terrific (TB) o LB) que contenía antibióticos a las concentraciones mencionadas anteriormente (etapa 2.2.3) con una sola colonia de las placas de selección descritos en 2.2.4. </li><li> Realizar una dilución 1: 100 veces del cultivo iniciador durante la noche en frascos de cultivo con deflectores. NOTA: Utilice un volumen de medios de comunicación entre 250-500 ml. </li><li> Mantener el cultivo a 37 ° C con agitación a 250 rpm para asegurar que la aireación suficiente de la cultura se alcanza. </li></ol></li><li> La inducción de cada plásmido <ol><li> Deje que el cultivo de bacterias para crecer hasta una DO600 de 0,6-0,8, aproximadamente 3 horas después de la inoculación del crecimiento del matraz crecimiento primario. </li><li> Para mejorar el rendimiento final de vesículas cargadas PTE-SC, centrifugar todo el cultivo a 7.000 xg durante 15 min. Resuspender el sedimento celular en la pre-calentado, medios de cultivo fresco. NOTA: Este optional paso ayuda a eliminar cualquier OMV vacío que están presentes en el medio de cultivo antes de la inducción PTE-SC. </li><li> Hacer una solución madre 20% de L-arabinosa en agua y filtro estéril utilizando un filtro de 0,22 micras. Almacenar la solución de L-arabinosa a 4 ° C durante 2-4 semanas. </li><li> Añadir la solución de L-arabinosa al matraz de cultivo a una concentración final 0,2% para iniciar la producción PTE-SC. NOTA: Esto ayuda a cargar previamente el espacio periplásmico con PTE-SC antes de la promoción de una mayor formación de vesículas través de la inducción de la mutante OmpA-ST. </li><li> Hacer una solución 1 M isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) en agua y filtro estéril utilizando un filtro de 0,22 micras. NOTA: IPTG debe ser utilizado inmediatamente una vez hidratado. Alícuotas de IPTG se pueden almacenar congeladas durante 3-6 meses y se pueden descongelar inmediatamente antes de su uso. </li><li> Añadir IPTG después de un período de incubación de 3 horas adicionales a una concentración final de 0,5 mM para iniciar la producción de la OmpA-ST. </li><li> Permitir que el cultura de crecer para un 8-14 h adicionales a 37 ° C con agitación. </li></ol></li></ol> 4. Purificación OMV <ol><li> La eliminación de bacterias intactas <ol><li> Centrifugar los medios de cultivo bacteriano durante 15 minutos a 7000 xga 4 ° C para sedimentar las bacterias intactas. </li><li> Se decanta, y guardar, los medios de comunicación fuera de la parte superior del poste centrifugación sedimento celular con cuidado de no perturbar el sedimento celular. </li><li> Repetir los pasos 4.1.1 y 4.1.2 para un ciclo de centrifugación adicional para asegurar que todas las bacterias intactas se retiran de los medios de cultivo asegurándose de decantar y guardar los medios de comunicación. </li></ol></li><li> La eliminación de agregados de proteínas <ol><li> purificar adicionalmente el medio de cultivo bacteriano utilizando un filtro de 0,45 micras de membrana para eliminar las bacterias residuales y el material celular grande no deseado. NOTA: Utilice un material de membrana biológicamente compatible para mayores recuperaciones y menor absorción de proteínas, tales como acetato de celulosa (CA) o difluoruro de polivinilideno (PVDF). volúmenes filtro de jeringa de menos de 100 ml y los volúmenes de filtro de vacío de más de 100 ml. <ol><li> Para filtro de jeringa, extraer el medio de cultivo en jeringa estéril de 10-50 ml. Adjuntar 0,45 micras filtro a extremo Luer de la jeringa. Presionando el émbolo y recoger de flujo continuo en un buque nuevo. </li><li> Para aspirar filtro, transferir medio de cultivo a un aparato de filtración estéril. Coloque la unidad de la bomba de vacío o se hundirá aspirador para generar succión. Transferir medio filtrado a la nueva embarcación. </li></ol></li></ol></li><li> Aislamiento de OMV a través de ultracentrifugación <ol><li> Añadir los medios de cultivo filtrado en tubos de centrifugación teniendo cuidado de equilibrar tubos opuestas en la centrífuga. </li><li> Pellet a ~ 150.000 xg durante 3 horas a 4 ° C en una ultracentrífuga mediante el rotor correspondiente a juego tanto el instrumento y tubos que se utilizan. </li><li> Se decanta el medio de cultivo agotado OMV a partir del sedimento OMV, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento de OMV, inmediatamente a la terminación of centrifugación como permitir que el sedimento OMV a permanecer en los medios de comunicación se ablandará el sedimento de la reducción de la recuperación de OMV. NOTA: Este pellet será ligeramente marrón y dependiendo de la cantidad de partida de cultivo bacteriano puede o no ser visible a simple vista. De aspiración de los medios de comunicación directamente desde la parte superior del tubo de centrifugación es también una opción teniendo en cuenta que los medios de comunicación más retiradas de la OMV sedimentar las más pura será la muestra final OMV. </li><li> Guardar el sobrenadante se centrifuga para las pruebas más adelante dispersión dinámica de luz (DLS) para verificar que las partículas de OMV estaban completamente agotados de los medios de comunicación. </li><li> Añadir 0,5 a 1 ml de pH 7,4 o mM N 100 tampón estéril filtrada Phosphate Buffered Saline (PBS) ciclohexil-2-aminoetanosulfónico ácido (CHES) a pH 8,0 al sedimento OMV lo que le permite incubar durante 30 min a TA. Asegúrese de que la pastilla no se seque. NOTA: Los extremos en la concentración de la solución iónica, el pH y la temperatura puede dar lugar a una solubilidad reducida OMV y promover agregación. </li><li> pipetear cuidadosamente la solución OMV purifica a partir del tubo de centrífuga, mezclando suavemente para asegurar la totalidad de la pastilla ha sido solubilizado. </li></ol></li></ol> 5. Caracterización de OMV <ol><li> Utilizar cualquier software DLS o el seguimiento de nanopartículas disponibles comercialmente siguiendo los protocolos del fabricante proporcionado únicos para cada instrumento para determinar la distribución del tamaño de partícula y la concentración de OMV. NOTA: En este caso, se determinó la distribución del tamaño de OMV y la concentración de la utilización de nanopartículas NanoSight LM10 de seguimiento y software de análisis NTA 2.3. <ol><li> Abra el software. </li><li> Encienda el microscopio y limpiar todas las superficies de la unidad de microscopio y el seguimiento de las nanopartículas. </li><li> Añadir ~ 0,5 ml de muestra de OMV directamente a la ventana de visualización del dispositivo de rastreo de partículas a través del adaptador Luer con una jeringa estéril de 1 ml asegurándose de cubrir toda la ventana de visualización sin inyectar burbujas de aire en el sistema. </li><li> lugar tque nanopartícula unidad de seguimiento sobre la platina del microscopio y encender el láser. </li><li> Haga clic en &quot;Capture&quot; en el software. </li><li> Ajuste el enfoque del microscopio y la etapa de visualizar las partículas en la pantalla de vista previa presente en la ventana del software. </li><li> Ajuste el &quot;obturador de la cámara&quot; y &quot;ganancia de la cámara&quot; hasta que las partículas brillantes se visualizan claramente en un fondo oscuro. </li><li> Ajustar la duración de la captura hasta 60 seg. </li><li> Haga clic en &quot;Grabar&quot;. </li><li> Cuando se le solicite, introduzca la temperatura / dispositivo de muestra, etiquetar la muestra, y guardar los datos de vídeo al final de la cada funcionar en una carpeta designada por el usuario. </li><li> Mantenga todos los parámetros de análisis (detección de umbral, la falta de definición, Pista longitud mínima, que se espera Min Tamaño de Partículas) en Modo de detección automática y haga clic en &quot;secuencia del proceso.&quot; NOTA: Consulte el manual de cómo cada parámetro se puede ajustar de forma independiente a los resultados de análisis de sintonía fina. </li><li> Registro de partícula y distribución de tamaño de partículas / mconcentración de L como se determina por el software. NOTA: Un rango de tamaño hidrodinámico OMV típico es entre 30-200 nm con una concentración de partículas / ml de ~ 10 x 10 8. </li></ol></li><li> Determinar el contenido de proteína OMV <ol><li> Utilice estándar SDS-PAGE y los protocolos de transferencia de Western para evaluar la pureza OMV, la producción de la enzima, y la eficacia de reticulación SC-ST 7. NOTA: La reticulación eficiencia no será 100% 7. </li></ol></li></ol> 6. Verificación de enzima Packaging <ol><li> Ensayo de la actividad PTE <ol><li> Realizar todos los ensayos enzimáticos en un tampón adecuado, tal como 100 mM de tampón CHES (pH 8) a 25 ° C, ya sea en una cubeta o multiplexados en una placa de 96/384 también. </li><li> Añadir 5 l de una dilución 1: 1000 de paraoxón en tampón CHES 90 l de CHES y 5 l de OMV purificado (~ 36 veces concentrado en comparación con la concentración de OMV presente en el medio de cultivo). Precaución: paraoxón es un pesticida tóxicoy debe ser manejado por el fabricante y las directrices institucionales. </li><li> Tomar las lecturas de absorbancia a intervalos regulares (cada 20 segundos durante ~ 2 horas de tiempo de reacción total) a 405 nm (ε = 18,1 mM -1 cm -1) y 348 nm (ε punto isosbéstico = 5,4 mM -1 cm -1) a controlar la progresión de reacción del producto de la descomposición paraoxón cromogénico, p-nitrofenol. NOTA: A valores de pH por encima de 8 está presente la forma desprotonada dominante de p-nitrofenol lo que permite un seguimiento preciso a 405 nm. En todas las demás soluciones de pH complejo o inferior, es necesario utilizar el punto de 348 nm isosbéstico como múltiples formas de la p-nitrofenol estarán presentes. </li><li> Calcular las velocidades iniciales de reacción mediante la determinación de la pendiente de la porción lineal de las curvas de progreso de la etapa 6.1.3 para comparar la cantidad relativa de PTE en cada muestra, la eficiencia de embalaje, y la producción total de PTE. </li><li> Realizar enzimática estándarprotocolos de ensayo para determinar la K M, V max y kcat para el OMV encapsulados PTE. NOTA: Un análisis de Lineweaver-Burk puede ser utilizado para la determinación de estos parámetros cinéticos en la intersección y = 1 / V máx y la pendiente max = 20 K M / V. </li></ol></li><li> Transmembrana Substrato / difusión del producto. <ol><li> Realizar el mismo análisis ensayo cinético descrito en el paso 6.1 utilizando concentraciones crecientes de Triton X-100 en tampón CHES de 0-3% en volumen. NOTA: La adición de Triton X-100 a las funciones de OMV solubilizados para interrumpir la bicapa lipídica permitiendo de los contenidos de la OMV a ser libremente accesible a la solución de reacción. </li><li> Calcular y comparar las velocidades iniciales en cada nivel de Triton X-100 para verificar el paso transmembrana del sustrato / producto indicado por el cambio mínimo en la actividad de la enzima (velocidades iniciales) en comparación con la actividad enzimática in la ausencia de Triton X-100. Si se observa un aumento sustancial de la actividad enzimática en presencia de Triton X-100, es probable que el sustrato no se difunde libremente en la OMV. </li><li> actividad de la enzima libre de ensayo (como se describe anteriormente en la sección 6.1) en presencia de Triton X-100 para verificar que la actividad de la enzima no es inhibida por el propio agente tensioactivo. NOTA: Si la actividad se ve afectada en gran medida por Triton X-100, aditivos alternativos, tales como saponinas o varios polisorbato / tensioactivos de interpolación pueden ser más adecuados para romper la membrana OMV. </li></ol></li></ol> 7. Almacenamiento OMV <ol><li> Congelación <ol><li> alícuotas lugar ~ 100 l de OMV purificada directamente en nitrógeno líquido para congelar las alícuotas complemento asegurándose de no sumergir totalmente los viales o ponerse en contacto con cualquier nitrógeno líquido con la propia muestra. NOTA: Purified OMV puede congeló directamente en la memoria intermedia que fue seleccionado para solubilizar el precipitado OMV durante el purificatproceso de ion sin crioprotectores adicionales necesarios 7. </li><li> Almacenar las alícuotas se congelaron rápidamente a -80 ° C. </li><li> Descongelar alícuotas congeladas procedentes de la etapa 7.1.1 colocándolos a temperatura ambiente asegurándose de no calentar las muestras. </li><li> Antes de preparar todas las muestras para el almacenamiento de esta manera realizar el ensayo enzimático descrito en la etapa 6.1 la comparación de velocidades iniciales antes y después de la congelación para verificar que no hay pérdida significativa en la actividad de la enzima poste de congelación-descongelación. NOTA: tienda purificó OMV a 4 ° C si se observa una reducción en la actividad enzimática debido a la congelación. </li></ol></li><li> La liofilización <ol><li> Liofilizar las alícuotas se congelaron rápidamente VME purificadas utilizando equipos de liofilización disponible en el mercado 21. </li><li> Tienda liofilizado alícuotas a temperatura ambiente durante semanas o a -80 ° C durante muchos meses. </li><li> Añadir el mismo volumen de agua purificada a la OMV liofilizado como antes de la liofilización y dejar reposar a temperatura ambiente durante 30 min para rehidratar tse muestra. Mezclar suavemente cuando sea necesario asegurarse de no Vortex o sonicar la OMV. </li><li> Agregue el polvo liofilizado OMV directamente al punto de atención para aplicaciones donde antes de dilución / solubilización no es necesario. </li></ol></li></ol>

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<li>Blakeley, B. D., Chapman, A. M., McNaughton, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-superpositive+GFP+reassembly+is+a+fast%2C+efficient%2C+and+robust+method+for+detecting+protein-protein+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+BioSyst%22%5BJournal%5D)">Split-superpositive GFP reassembly is a fast, efficient, and robust method for detecting protein-protein interactions in vivo.</a> Mol. BioSyst. 8 (2036), (2012).</li>
<li>De Crescenzo, G., Litowski, J. R., Hodges, R. S., O'Connor-McCourt, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+the+interacation+of+two-stranded+de+novo+designed+coiled-coils%3A+effect+of+chain+length+on+the+kinetic+and+thermodynamic+constants+of+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of the interacation of two-stranded de novo designed coiled-coils: effect of chain length on the kinetic and thermodynamic constants of binding.</a> Biochemistry. 42, 1754-1763 (2003).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este funciones de protocolo para demostrar un representante dirigidas técnica de embalaje en el que se produce y se empaqueta en OMV por E. coli una enzima de interés. Al igual que con muchas técnicas complejas hay varias áreas en las que el protocolo puede ser modificado para adaptarse a su uso en diferentes aplicaciones únicas, algunas de las cuales se detallan a continuación. Si bien el mecanismo de envases OMV y la encapsulación de la enzima se puede adaptar a las necesidades específicas hay varios pasos de...

Se presenta aquí un método para el diseño, la producción y purificación de vesículas de enzimas cargadas bacterianas de membrana externa (OMV). OMV son pequeños, principalmente unilamelar, proteoliposomas que varían en tamaño desde 30 hasta 200 nm de 1,2. Todas las bacterias Gram-negativas y Gram-positivas que han sido estudiados hasta la fecha han demostrado la liberación de cualquiera de las OMV o vesículas extracelulares (EV) de su superficie de 3,4. El mecanismo exacto por el cual se producen OMV aún no se han aclarado por completo debido a las diversas poblaciones bacterianas que ellos, así como las diferentes funciones que sirven secretan. OMV se ha demostrado que el transporte de una amplia gama de carga a partir de moléculas pequeñas, péptidos y proteínas al material genético que sirve una variedad de complejo de señalización, la translocación de genes, y la virulencia funciones 5,6. Los mecanismos exactos de la biogénesis OMV no están bien caracterizadas, y parecen diferir entre especies bacterianas. A pesar de this hecho, hemos desarrollado un método para mejorar la eficacia de empaquetamiento de una proteína recombinante en OMV mediante la creación de una unión sintética entre una proteína de interés y una proteína muy abundante endógena a la membrana externa bacteriana y la posterior OMV. En ausencia de un enlace sintético, o afinidad constituida artificialmente, entre la proteína expresada de forma recombinante y la OMV la eficacia de empaquetamiento observada es muy bajo 7. Este resultado es de esperar que la incorporación de las proteínas dentro de la OMV se produce ya sea a través de la encapsulación azar en el preciso momento de la formación de OMV en la superficie bacteriana o por medio de envasado dirigido por mecanismos que no se comprenden bien. Algunos éxito se ha observado en el envasado de proteínas simplemente a través de más de expresión dentro del espacio periplásmico que se basa en la encapsulación azar pero el envase eficaz es altamente dependiente de la proteína con algunas proteínas de envasado a alta eficiencia en comparación con otros tha no empaquetar en absoluto 8-10. Mediante la utilización de técnicas de biología sintética comunes hemos tratado de diseñar Escherichia coli (E. coli) para producir al mismo tiempo, el paquete y segregan una enzima activa de interés en OMV que elude las limitaciones del conocimiento actual acerca de cómo se forman y cómo OMV de carga es seleccionada por las bacterias para embalaje. Para los fines de esta solicitud se seleccionó un sistema de bioconjugación proteína de división como la unión sintética de elección para facilitar el embalaje direccional en la OMV. Como el nombre sugiere un sistema bioconjugation proteína de división se compone de dos dominios de subunidades complementarios que interactúan entre sí. Los dominios de la proteína de división seleccionados para los fines de este protocolo se conocen como la SpyCatcher (SC) y SpyTag dominio (ST) y se derivan de la proteína de unión a fibronectina pyogenes Streptococcus-(FbaB) 11. Este sistema de la proteína de división es inusual en que wuando las dos subunidades están dentro de la proximidad de un enlace isopeptide forma espontáneamente entre los extremos proximal aspártico residuos de ácido de ácidos y aminoácidos lisina que crean una unión covalente. Formación de enlaces isopeptídicos no requiere la adición de proteínas chaperonas, enzimas catalíticas, o cofactores y puede ocurrir fácilmente a temperatura ambiente (RT) y en un amplio rango de condiciones fisiológicamente relevantes 12. Como prueba de concepto, se seleccionó fosfotriesterasa (PTE) (EC 3.1.8.1) de Brevundimonas diminuta para ser envasados en E. coli derivado OMV 13. PTE contiene un sitio activo Zn / Zn binuclear y tiene la capacidad de descomponer los fosfatos orgánicos a través de una reacción de hidrólisis convertir aryldialkylphosphates en dialquilfosfatos y alcoholes de arilo 14. La exposición a los organofosfatos afecta la función del neurotransmisor adecuada a través de la inhibición de la hidrólisis de la acetilcolina por la acetilcolinesterasa en las uniones neuromusculares Makincompuestos derivados organofosforados g extremadamente peligrosas 15. La exposición prolongada o significativa a organofosforados habitualmente da lugar a convulsiones incontrolables y por lo general causa la muerte a través de la asfixia. Mientras PTE exhibe la actividad catalítica más alta hacia paraoxón, un muy potente insecticida, también es capaz de hidrolizar una amplia gama de otros pesticidas y agentes nerviosos química V / G de tipo 16. Para facilitar el empaquetamiento OMV, un plásmido bacteriano fue diseñado que codifica una construcción génica que contiene un promotor inducible, una secuencia de localización periplásmica, y un corto sitio de clonación múltiple aguas arriba de la secuencia del gen SC. La inserción del gen PTE entre el líder y la secuencia SC permitido para la creación de un interruptor genético que se dirige a la proteína de fusión PTE-SC al espacio periplásmico para el envasado de OMV. Si bien los esfuerzos descritos aquí se centran en PTE, el gen de la enzima es intercambiable y fácilmente podría ser reemplazada con otra secuencia de gen a FACilitate envasado de una enzima o proteína alternativa. A medida que la segunda parte de la ligamiento sintético, se elige una proteína de membrana externa abundante (OmpA) para presentar la secuencia del péptido ST. Si bien la elección de la proteína de anclaje puede variar, es esencial que la proteína tiene un dominio permisivo que presenta dentro del espacio periplásmico, tolera la construcción de fusión sin inducir citotoxicidad, se sabe que está presente en OMV, y no agregar cuando es recombinante producida. OmpA es una proteína transmembrana kDa porin 37.2 que se sabe que está altamente expresado en la membrana externa bacteriana y la posterior OMV 17. Se está implicada en el transporte de moléculas pequeñas, &lt;2 nm de tamaño, a través de la membrana bacteriana 18. Nativo OmpA tiene dos dominios estructuralmente únicos, un motivo de barril beta transmembrana y una porción C-terminal periplasmically soluble conocido para interactuar con el peptidoglicano 19. En el designe de fusión OmpA-ST mutanted aquí se ha eliminado la porción C-terminal de OmpA y el ST se fusionó a la N- frente periplasmically o C-terminales. La eliminación de la porción periplásmico de OmpA disminuye el número de interacciones entre la membrana exterior y el peptidoglicano que resulta en la desestabilización de la membrana que conduce a la hiper-7 vesiculación. Genomic OmpA se mantuvo además de la construcción de OmpA-ST expresado de forma recombinante para mitigar la desestabilización de membrana bruta.

<table><tbody><tr><td>IPTG</td><td>Cualquiera</td><td></td><td>Preparar siempre fresco o alícuota y congelar.</td></tr><tr><td>La L-arabinosa</td><td>Any</td><td></td><td>se puede preparar con anticipación y almacenar a 4 °C.</td></tr><tr><td>Agregue ampicilina</td><td>inmediatamente</td><td></td><td>antes de usar después de que el medio se enfríe lo suficiente después de ser esterilizado en autoclave. &nbsp;</td></tr><tr><td>Cloranfenicol&nbsp;</td><td>Cualquier Agregue</td><td></td><td>inmediatamente antes de usar después de que el medio se enfríe lo suficiente después de ser esterilizado en autoclave. &nbsp;</td></tr><tr><td>Medios de cultivo TB/LB Es</td> probable que <td>cualquier</td><td></td><td>otro medio de cultivo funcione de manera similar.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Cualquiera</td><td></td><td>de los muchos tensioactivos potencialmente adecuados. &nbsp;</td></tr><tr><td>Matraces de cultivo con deflectores</td><td>Cualquiera</td><td></td><td>Los deflectores promueven niveles más altos de aireación. &nbsp;</td></tr><tr><td>CHES</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP318-100</td><td>Tampón óptimo utilizado para la degradación de paraoxones (pH > 8).</td></tr><tr><td>Paraoxon</td><td>Chem Service</td><td>N-12816</td><td>Sustancia muy tóxica que debe manipularse con cuidado y eliminarse adecuadamente. &nbsp;</td></tr><tr><td>Filtro de jeringa 0.45 y micro; m</td><td>Thermo Scientific</td><td>60183-221 (30 mm)</td><td>El diámetro del filtro dependerá del volumen de la muestra. La membrana de baja unión a proteínas es crítica.</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>agitadora New Brunswick</td><td>Excella E24</td><td>La temperatura y la mezcla precisas son esenciales para el crecimiento bacteriano reproducible.</td></tr><tr><td>Centrífuga de cultivo Sorvall</td><td>Thermo Scientific</td><td>RC 5B PLUS</td><td>Centrífuga de cultivo de gran volumen (500 ml) con capacidad de 7.000 x g.</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga Sorvall&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>WX Ultra 90</td><td>Capaz de soportar fuerzas centrífugas &ge; 150.000 x g.</td></tr><tr><td>Rotor ultracentrífugo</td><td>Thermo Scientific</td><td>AH-629 Asegúrese de</td><td>que se utilicen el rotor y los tubos adecuados y de que todo esté correctamente equilibrado.</td></tr><tr><td>Tubos ultracentrífugos ultratransparentes (25 x 89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td>Asegúrese de que no haya fracturas por tensión antes de su uso y de que los tubos estén perfectamente equilibrados.</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro&nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Infinite M1000</td><td>Necesario para ensayos cinéticos de enzimas.</td></tr><tr><td>DLS/seguimiento de partículas</td><td>NanoSight&nbsp;</td><td>LM10</td><td>Necesario para la distribución del tamaño del OMV y la determinación de la concentración. &nbsp;</td></tr><tr><td>BL21(DE3)</td><td>NEB</td><td></td><td>Cepa de expresión bacteriana adecuada.</td></tr><tr><td>pET22</td><td>EMD Millipore</td><td>69744-3</td> Se <td>pueden utilizar otros plásmidos en lugar de estos. &nbsp;</td></tr><tr><td>pACYC184</td><td>NEB</td><td></td><td>Se pueden utilizar otros plásmidos en lugar de estos. &nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Kit de ejemplo.</td></tr></tbody></table>

dirigida packaging de proteínas dentro de la membrana externa de vesículas de<em&gt; escherichia coli</em&gt;: diseño, producción y purificación

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Un creciente interés en la aplicación de técnicas de biología sintética para programar vesículas de membrana externa (OMV) están dando lugar a algunas aplicaciones muy interesantes y únicos para los OMV en nanopartículas tradicionales están resultando demasiado difícil de sintetizar. Hasta la fecha, todas las bacterias Gram-negativas se han demostrado para producir envases que demuestra OMV de una variedad de carga que incluye moléculas pequeñas, péptidos, proteínas y material genético. Sobre la base de su diversa carga, OMV están implicados en muchos procesos biológicos que van desde la comunicación célula-célula para la transferencia de genes y la entrega de factores de virulencia, dependiendo de que las bacterias están produciendo la OMV. Sólo recientemente se han vuelto accesibles para su uso en una amplia gama de aplicaciones a través del desarrollo de técnicas para controlar y envasado directa de proteínas recombinantes en bacterias OMV OMV. Este protocolo describe un método para la producción, purificación, y el uso de la enzima de envasados ​​OMV proporcionar para mejorar la overall producción de la enzima recombinante, el aumento de vesiculación, y la estabilidad de la enzima mejorada. la utilización con éxito de este protocolo dará lugar a la creación de una cepa bacteriana que a la vez produce una proteína recombinante y la dirige para OMV de encapsulación a través de la creación de una unión sintética entre la proteína recombinante y una proteína de anclaje a la membrana externa. Este protocolo también se detallan los métodos para el aislamiento de OMV a partir de cultivos bacterianos, así como las técnicas apropiadas de manipulación y cosas para considerar cuando la adaptación de este protocolo para su uso en otras aplicaciones únicas, tales como: entrega de medicamentos, el diagnóstico médico, y la remediación ambiental.

La expresión simultánea de dos proteínas recombinantes, como se requiere para la estrategia de embalaje OMV se detalla en este protocolo, se puede lograr a través de un número de diferentes vías. Aquí, un sistema de dos vector se utilizó con orígenes de replicación compatibles y casetes de genes inducibles por separado. Para la expresión de la PTE-SC construir un plásmido comercial columna vertebral (pACY184) fue diseñado para incluir un casete de gen inducible de arabinosa y un doble ar...

Se presenta un protocolo para la producción, purificación y uso de vesículas de membrana externa (OMV) empaquetadas en enzimas que proporcionan una mayor estabilidad enzimática para su implementación en diversas aplicaciones.

Dirigida Packaging de proteínas dentro de la membrana externa de vesículas de<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Diseño, Producción y Purificación

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

El objetivo general de este procedimiento es purificar y caracterizar vesículas de la membrana externa bacterianas llenas de enzimas para su uso como reactivos catalíticos in vitro. Esta técnica de aislamiento enzimático permite obtener VME bacterianas del medio de cultivo y luego emplearlas para realizar la catalización libre de células de un compuesto organofosforado. El empaquetamiento dirigido dentro de las VME bacterianas mejora significativamente la estabilidad enzimática frente a una variedad de condiciones de reacción y almacenamiento, a diferencia de las técnicas tradicionales que a menudo provocan una pérdida gradual y continua de la actividad enzimática.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el empaquetado de proteínas con relevancia en múltiples campos, como el desarrollo de terapéuticas, la remediación o el desarrollo de sistemas catalíticos libres de células. Aunque este protocolo detalla la purificación de vesículas de membrana externa o OMVs a partir de E.coli, las técnicas con modificaciones en la estrategia de empaquetado podrían utilizarse fácilmente para la purificación de OMVs a partir de una variedad de cultivos celulares microbianos. Después de generar vesículas de membrana externa o OMVs en bacterias según el protocolo descrito, centrifugue el medio de cultivo bacteriano intacto a 7.000 × g y cuatro grados Celsius durante 15 minutos.Retire y guarde el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento celular. Luego, someta el sobrenadante a una segunda centrifugación para asegurar que todas las bacterias sean eliminadas del medio. Para eliminar agregados proteicos y material celular grande del medio de cultivo guardado, aspire la solución en una jeringa estéril de 10 a 50 mililitros.Coloque un filtro de 0,45 micrones en el extremo del embudo de la jeringa. Luego, presione el émbolo y recoja el flujo filtrado en un tubo nuevo. Alternativamente, filtre al vacío el medio de cultivo transfiriéndolo a un aparato de filtración estéril.Conecte la unidad a una bomba de vacío o a un aspirador de fregadero para generar succión. Transfiera el medio filtrado a un nuevo recipiente. Para aislar las VMO, transfiera el medio de cultivo filtrado a tubos de ultracentrifugación.Centrifugar el medio a aproximadamente 150.000 ×g y 4 °C durante tres horas utilizando un rotor que corresponda a los tubos que se están empleando. Inmediatamente después de la ultracentrifugación, para evitar la pérdida de masa del precipitado, desechar el medio de cultivo agotado de OMV del precipitado de OMV de color marrón claro, que puede ser o no visible a simple vista. El precipitado de OMV formado tras la ultracentrifugación puede estar solo ligeramente adherido al recipiente de centrifugación.Debe tenerse cuidado al decantar para asegurarse de que el precipitado no se desplace ni se pierda. Guarde el sobrenadante para realizar posteriormente dispersión dinámica de luz, a fin de verificar que las partículas de OMV se hayan agotado completamente del medio. Añada de 0,5 a un mililitro de PBS estéril filtrado, pH 7,4, u otro tampón filtrado según lo determine las necesidades o condiciones experimentales, al precipitado y permita que incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.Luego, pipetee cuidadosamente la solución purificada de OMV mezclando suavemente para asegurar que todo el precipitado se haya solubilizado. Para determinar la distribución del tamaño de las OMV, abra el software de seguimiento de nano-partículas por DLS del instrumento que se esté utilizando. Encienda el microscopio y limpie todas las superficies del microscopio y de la unidad de seguimiento de nano-partículas.Utilizando una jeringa estéril de un mililitro, agregue aproximadamente 0,5 mililitros de la muestra de OMV directamente a la ventana de visualización del dispositivo de seguimiento de partículas a través del accesorio inferior, teniendo cuidado de cubrir completamente la ventana de visualización sin inyectar burbujas de aire en el sistema. Coloque la unidad de seguimiento de nano-partículas sobre la platina del microscopio y encienda el láser. Luego, haga clic en Capturar en el software.Ajuste el enfoque del microscopio y la platina para visualizar las partículas en la pantalla de vista previa presente en la ventana del software. Ajuste el obturador de la cámara y la ganancia de la cámara hasta que las partículas brillantes se visualicen claramente sobre un fondo oscuro. Ajuste la duración de la captura a 60 segundos y luego haga clic en Grabar.Cuando se solicite, introduzca la temperatura del dispositivo de la muestra, etiquete la muestra y guarde los datos del video al final de cada análisis en una carpeta designada por el usuario. Mantenga todos los parámetros de análisis en modo de detección automática y haga clic en Procesar Secuencia. Registre la distribución del tamaño de partículas y la concentración en partículas por mililitro según lo determinado por el software.Para determinar el contenido proteico de las OMV, utilice electroforesis SDS-PAGE y transferencia Western para evaluar la pureza de las OMV, la producción enzimática y la eficiencia de reticulación entre SpyCatcher o SC y SpyTag o ST. Es fundamental confirmar la expresión de las enzimas diana y de la proteína anclaje. La expresión de proteínas recombinantes a menudo puede ser infructuosa por diversas razones, y se debe confirmar la producción exitosa de proteínas antes de la caracterización de las OMV.Para realizar un ensayo de actividad fosfotriesterasa o PTE, agregue cinco microlitros de una dilución uno a 1.000 de paraoxón en tampón CHES a cinco microlitros de OMV purificadas en 90 microlitros de CHES. Tome lecturas de absorbancia a 405 nanómetros y 348 nanómetros cada 20 segundos durante aproximadamente dos horas de tiempo total de reacción para monitorear el progreso del producto cromogénico de degradación del paraoxón, el p-nitrofenol. Finalmente, realice el análisis de datos según el protocolo descrito en el texto.Se muestran aquí ejemplos de la morfología de OMV purificadas de E.coli mediante MEB. Las OMV varían en tamaño entre 50 y 250 nanómetros, según se determinó utilizando instrumentación de seguimiento de partículas. En esta gráfica, se muestra la concentración absoluta de OMV.Cuando se co-transformó OMP-A-ST en el extremo N con PTE-SC en presencia de arabinosa e IPTG, se observó un aumento significativo en la producción de OMV en comparación con las muestras control. Los geles SDS-PAGE y los análisis por inmunotransferencia mostrados aquí caracterizan además el contenido proteico de las OMV y la expresión de proteínas recombinantes para OMP-A-ST, OMP-A nativo, PTE-SC y OMP-A-ST-PTE-SC. En esta figura, los niveles totales de expresión de PTE y la eficiencia de empaquetamiento en las OMV en los pellet celulares, el sobrenadante de UC y los pellet de OMV purificadas por UC se determinaron mediante mediciones de velocidad inicial utilizando paraoxón como sustrato cromogénico.Aquí, se utilizó Triton X-100 para verificar la translocación de paraxon a través de bicapas de OMV íntegras. Hubo poca diferencia en la actividad con o sin detergente, lo que indica que el paraxon atraviesa libremente los poros endógenos de la OMV. Finalmente, como se observa en este experimento, los datos cinéticos de PTE-SC se ajustaron a la ecuación estándar de cinética enzimática de Michaelis-Menten para la co-transformación del OMP-A-ST en el extremo N con PTE-SC en presencia de arabinosa e IPTG, y para PTE-SC en presencia de activación por arabinosa.Una vez que se hayan realizado y confirmado todas las construcciones genéticas, el empaquetamiento enzimático y la purificación de OMV pueden completarse en un período de dos días. Se requiere un tercer día para confirmar y caracterizar las OMV cada vez que se desarrolla una nueva construcción. Al intentar este procedimiento, es importante recordar verificar las clasificaciones de seguridad de todos los materiales y del equipo de centrifugación.Además, es importante verificar el éxito de cada paso antes de pasar al siguiente. Los pasos de caracterización descritos aquí pueden complementarse con otros para confirmar el empaquetamiento de enzimas y la morfología de las OMV. La concentración de proteínas, el contenido de lípidos, la concentración de LPS y muchas otras propiedades pueden variar según diferentes cargas y condiciones de aducción, y podrían influir en aplicaciones posteriores.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo purificar y caracterizar OMV llenas de enzimas, así como realizar ensayos preliminares para evaluar la actividad de la carga enzimática. No olvide que trabajar con bacterias y reactivos químicos puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como utilizar técnicas asépticas adecuadas y equipo de protección personal, al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

La purificación por afinidad de las proteínas etiquetadas en combinación con espectrometría de masas (APMS) es un potente método para la asignación sistemática de las redes de interacción de proteínas y para la investigación de la base mecánica de los procesos biológicos. A continuación, se describe un péptido secuencial optimizado afinidad (SPA) APMS procedimiento desarrollado por la...

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Dominios de dedos de zinc son células permeable intrínseca y capaz de mediar la entrega de proteínas en una amplia gama de tipos de células de mamíferos. Aquí, se presenta un protocolo detallado paso a paso para la implementación de la tecnología zinc-finger para la entrega de proteínas intracelulares.

Proteína entrega directa de células de mamíferos Utilización de Células permeable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -Su<sub&gt; 2</sub&gt; Dominios de zinc-finger

β barril de 'jove_content', cumplen muchas funciones dentro de las membranas externas de las bacterias Gram-negativas, mitocondrias y cloroplastos. Aquí, esperamos aliviar un cuello de botella conocido en los estudios estructurales mediante la presentación de protocolos para la producción de OMP de β barril en cantidades suficientes para la determinación de la estructura mediante cristalografía de rayos X o espectroscopia de RMN.

A partir de construcciones de Cristales - Hacia la determinación de la estructura de la β-barril proteínas de membrana externas

Prolina-prolina endopeptidasa-1 (PPEP-1) es una metaloproteasa secretada y una prometedora diana farmacológica del patógeno humano Clostridium difficile. Aquí describimos todos los métodos necesarios para la producción y determinación de la estructura de esta proteína.

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Describimos un método para la caracterización de transportadores de membrana impulsados por protones en preparaciones de vesículas de membrana producidas por la expresión heteróloga en E. coli y lisis de células utilizando una prensa francesa.

Caracterización de transportadores de membranas por expresión heteróloga en E. coli y producción de vesículas de membrana

Este protocolo describe el método, los materiales, el equipo y los pasos para la preparación ascendente de ARN y células sintéticas productoras de proteínas. El compartimento acuoso interno de las células sintéticas contenía el lisato bacteriano S30 encapsulado dentro de una bicapa lipídica (es decir, liposomas estables), utilizando un método de transferencia de emulsión de agua en aceite.

Preparación de células sintéticas productoras de proteínas mediante extractos bacterianos libres de células, liposomas y transferencia de emulsión

En la interfaz de disolventes orgánicos y acuosos, las proteínas anfifílicas a medida similares a la elastina se ensamblan en estructuras supramoleculares complejas como vesículas, fibras y coacervados desencadenados por parámetros ambientales. Los protocolos de montaje descritos producen compartimentos basados en membranas de proteínas (PMBC) con propiedades ajustables, lo que permite la encapsulación de varias cargas.

Montaje dirigido de proteínas similares a la elastina en estructuras supramoleculares definidas y encapsulación de carga in Vitro

Las bacterias secretan vesículas extracelulares (EV) de tamaño nanométrico que transportan moléculas biológicas bioactivas. La investigación EV se centra en comprender su biogénesis, su papel en las interacciones y enfermedades microbio-microbio y huésped-microbio, así como sus posibles aplicaciones terapéuticas. Se presenta un flujo de trabajo para el aislamiento escalable de vehículos eléctricos de varias bacterias para facilitar la estandarización de la investigación de vehículos eléctricos.

Aislamiento escalable y purificación de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias

El presente protocolo describe un método detallado para la producción bacteriana de proteínas recombinantes, incluidas proteínas típicamente insolubles o que contienen enlaces disulfuro, empaquetadas dentro de vesículas extracelulares unidas a la membrana. Esto tiene el potencial de aplicarse a áreas versátiles de la investigación científica, incluida la biotecnología aplicada y la medicina.

Producción y análisis optimizados de vesículas recombinantes llenas de proteínas de E. coli

Aprende a purificar y caracterizar vesículas de membrana externa de Escherichia coli cargadas con enzimas para aplicaciones de catálisis in vitro. Este método mejora la estabilidad enzimática para reacciones sin células.

Dirigida Packaging de proteínas dentro de la membrana externa de vesículas de Escherichia coli: Diseño, Producción y Purificación (Video) | JoVE Journal

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