Name: Multimodal Fase cuantitativa de imágenes con Digital holográfica Microscopía evaluación exacta de la inflamación intestinal Curación de heridas y epitelial (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Aprende a utilizar microscopía holográfica digital para evaluar cuantitativamente la inflamación intestinal y la cicatrización epitelial in vitro sin tinciones. Este método automatizado permite detectar parámetros físicos celulares y tisulares de forma objetiva en muestras de colon murino y humano.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Agradecemos a Faekah Gohar por corregir el manuscrito. Agradecemos a Sonja Dufentester y Elke Weber por su asistencia técnica experta.

Los autores no tienen nada que revelar.

Demostramos que DHM proporciona una evaluación precisa del daño histológico en modelos murinos de colitis y muestras de tejido del colon humanas ex vivo. Además, hemos demostrado DHM puede monitorizar de forma continua la curación de heridas epiteliales mismo tiempo, proporcione información multimodal sobre las alteraciones celulares. En DHM, la reconstrucción de hologramas capturadas digitalmente se realiza numéricamente 32. Por lo tanto, en comparación con la microscopía de campo claro, contraste d...

Enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), es decir, la colitis ulcerosa (UC) y la enfermedad de Crohn (CD) son trastornos inflamatorias idiopáticas del tracto gastrointestinal 1. La investigación sobre la fisiopatología subyacente de la EII y la evaluación de los potenciales nuevos fármacos o enfoques novedosos de diagnóstico es de particular importancia. Tanto en la investigación básica y el manejo clínico de los pacientes con EII, la mucosa intestinal se ha convertido en un foco de atención 2,3. La mucosa representa un límite anatómico, en la que la interacción entre bacterias comensales, células epiteliales y diversos componentes celulares del sistema inmunitario intestinal orquestar intestino homeostasis 4,5. Sin embargo, en los pacientes con EII, la inflamación intestinal incontrolada y persistente conduce a la mucosa daño, detectable como ulceraciones o estenosis, que finalmente pueden culminar en la descomposición de la función de la barrera epitelial, que a su vez agrava la inflamación local 6. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; epitelial de cicatrización de la herida tanto, es crucial para la regeneración epitelial después de la inflamación, pero también es un requisito esencial para la cicatrización de las úlceras gastrointestinales o dehiscencia de la anastomosis después de la cirugía gastrointestinal 7. Epitelial cicatrización de la herida puede ser simulado en la herida in vitro los ensayos de curación y en modelos murinos de inflamación intestinal 8,9. Tanto in vitro como in vivo enfoques tienen inconvenientes, que limitan la precisión de la evaluación experimental. Ensayos in vitro, como los ensayos de cero clásicos, requerir procedimientos de tinción o prolongadas de la transfección con cromóforos fluorescentes. A menudo están limitadas por su monitorización discontinua de la proliferación celular y la migración que no puede ser automatizado 10. Modelos in vivo, tales como sulfato de dextrano sódico (DSS) La colitis inducida, con frecuencia carecen de robustos lectura de los, en parte debido a la variación significativa vista en los marcadores de laboratorio, marey dichos marcadores inadecuados para evaluar la gravedad de la colitis 11,12. El análisis histológico de la mucosa inflamada es actualmente todavía el método más válido para determinar la gravedad colitis pero esto, como los ensayos de curación de heridas epiteliales in vitro, requiere tinción y depende de la experiencia del investigador 13. Microscopía holográfica Recientemente digital (DHM), una variante de la microscopía de fase cuantitativa 14, se identificó como herramienta útil para la evaluación de epitelial cicatrización de heridas in vitro y in vivo 15. DHM permite la evaluación de la densidad del tejido mediante la medición de retardo de longitud del camino óptico (OPD) , que el diagnóstico del cáncer perspectivas novela 16-18 y cuantificación de las alteraciones del tejido relacionado con la inflamación 19. Además, DHM permite la monitorización de la dinámica de la morfología celular mediante la determinación de espesor de la celda, el área de superficie de la célula cubierta y intracelular (proteína) la cantidad de contenido <sup&gt; 15,20. En ensayos in vitro, DHM también permite el análisis de procesos fisiológicos, por ejemplo, celular permeabilidad al agua mediante la evaluación de los cambios en el volumen celular y el espesor de 21,22. Por otra parte, las mediciones se pueden automatizar DHM que evita el sesgo de la muestra por el investigador asociado. A continuación, se demuestra el uso de DHM en un modelo murino de inflamación intestinal, y también aplicar DHM para el análisis de muestras de tejidos humanos para la monitorización cuantitativa de la cicatrización de heridas como un ensayo libre de etiquetas in vitro. En primer lugar, se evalúa alteraciones inflamatorias de las diferentes capas de la pared del colon-en ratones colíticos y secciones de tejidos de seres humanos con EII. Después de describir el procedimiento de formación de imágenes DHM fase cuantitativa, se proporcionan instrucciones detalladas para el uso de los componentes del microscopio, la preparación de secciones de tejido y también describir la evaluación de las imágenes de fase cuantitativos adquiridos. A continuación, mostramos que DHM puede ser utilizado para la monitorización multimodal continua de la curación de heridas epiteliales in vitro, y describir el análisis de las características celulares como espesor de la capa de células, masa seca y el volumen celular dar una idea de las alteraciones inducidas por drogas y celulares fisiológica.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Reactivos</fuerte></td>Azoximetano (AOM)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Alemania Matraz de cultivo celular A5486 Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania 658170 Costar Stripette Corning Inc., Nueva York, EE. UU. 4488 Sulfato de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> dextrano sódico (DSS)TdB Consulación,<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Uppsala, Suecia</td><td>DB001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F12</td><td>PAA Laboratories - Pasching - Austria</td><td>E15-813</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Alemania</td><td>SPR3196</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Alemania</td><td>E 9884</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 50 ml</td><td>BD Biosciences, Erembodegem, Bélgica</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Isopentano (2-metilbutano)</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Alemania</td><td>M32631-1L</td><td></td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>1159430025</td><td></td></tr><tr><td>Mitomicina C</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Alemania</td><td>M4287</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>G. Menzel, Braunschweig, Alemania</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Compuesto O.C.T. Tissue Tek&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sakura, Zoeterwonde, Países Bajos</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Estreptococo/Anfotericina B</td><td>Lonza, Verviers, Bélgica</td><td>1558</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato, PBS</td><td>Lonza, Verviers, Bélgica</td><td>4629</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza, Verviers, Bélgica</td><td>3626</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio 0,9%</td><td>Braun, Melsungen, Alemania</td><td>5/12211095/0411</td><td></td></tr><tr><td>Dieta estándar</td><td>Altromin, Lage, Alemania</td><td>1320</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, Leiden, Países Bajos</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA</td><td>Lonza, Verviers, Bélgica</td><td>7815</td><td></td></tr><tr><td>Vitro &ndash; Clud</td><td>R. Langenbrinck, Teningen, Alemania</td><td>04-0002&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &micro;-Plato de 35 mm con inserto de cultivo, alto</td><td>ibidi GmbH, Múnich, Alemania</td><td>81176</td><td></td></tr><tr><td>DIC Tapa para &micro;-platos, con inserto de vidrio</td><td>ibidi GmbH, Múnich, Alemania</td><td>80050</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICROM HM550</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, EE. UU</td>. <td>46320</td><td></td></tr><tr><td><microscopio holográfico digital fuerte></fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>componente</fuerte</td><td>><fuerte>Modelo</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>iMIC</td><td>Till Photonics, Graefelfing, Alemania</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Laser Compass 315M</td><td>Coherent GmbH, Luebeck, Alemania</td><td></td></tr><tr><td>Lente de microscopio</td><td>Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3</td><td>Zeiss, Goettingen, Alemania</td><td></td></tr><tr><td>Cámara CCD</td><td>DMK 41BF02</td><td>The Imaging Source, Bremen, Alemania</td><td></td></tr></tbody></table>

multimodal fase cuantitativa de imágenes con digital holográfica microscopía evaluación exacta de la inflamación intestinal curación de heridas y epitelial

Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

La incidencia de la enfermedad inflamatoria intestinal, es decir, la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, ha aumentado considerablemente en la última década. La etiología de la IBD permanece desconocida y estrategias terapéuticas actuales se basan en la supresión no específica del sistema inmune. El desarrollo de tratamientos que se dirigen específicamente la inflamación intestinal y la curación de la herida epitelial podría mejorar significativamente la gestión de la EII, sin embargo esto requiere una detección precisa de los cambios inflamatorios. Actualmente, los posibles candidatos a fármacos se evalúan por lo general el uso de modelos animales in vivo o con técnicas basadas en cultivos celulares in vitro. El examen histológico por lo general requiere que las células o tejidos de interés para ser teñidas, que pueden alterar las características de la muestra y, además, la interpretación de los resultados puede variar por la experiencia del investigador. microscopía holográfica digital (DHM), basado en la detección de retardo de longitud del camino óptico, permite-Libre de manchas de imágenes de contraste de fase cuantitativa. Esto permite que los resultados que se correlacionan directamente con los parámetros biofísicos absolutos. Se demuestra cómo la medición de los cambios en la densidad del tejido con DHM, basado en la medición del índice de refracción, puede cuantificar alteraciones inflamatorias, sin tinción, en diferentes capas de muestras de tejido del colon de ratones y seres humanos con colitis. Además, demostramos monitoreo libre de etiquetas multimodal continua de la curación de heridas epiteliales in vitro, utilizando DHM posible gracias a la determinación automatizada sencilla de la zona de la herida y la determinación simultánea de los parámetros morfológicos, como una masa seca y espesor de la capa de células que migran. En conclusión, DHM representa un valioso, herramienta novedosa y cuantitativo para la evaluación de la inflamación intestinal con valores absolutos de los parámetros posibles, la cuantificación simplificada de la curación de heridas epiteliales in vitro y por lo tanto tiene un alto potencial de diagnóstico u traslacionalse.

Configuración típica de los DHM de imagen digital para microscopía holográfica (DHM) Para llevar a cabo formación de imágenes de campo brillante y la imagen de contraste de fase cuantitativa DHM, se aplicó un microscopio invertido como se representa en la Figura 1 B. El sistema fue modificado uniendo un módulo DHM, como se describió anteriormente 25.</sup...

La evaluación precisa de los efectos antiinflamatorios es de suma importancia para la evaluación de posibles nuevos fármacos para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal. La microscopía holográfica digital proporciona una evaluación de la inflamación en muestras de tejido colónico murino y humano, así como una evaluación multimodal automatizada de la cicatrización de heridas epiteliales in vitro.

Multimodal Fase cuantitativa de imágenes con Digital holográfica Microscopía evaluación exacta de la inflamación intestinal Curación de heridas y epitelial

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

El objetivo general de este estudio es utilizar la microscopía holográfica digital o DHM para proporcionar imágenes de contraste de fase cuantitativas automatizadas y sin tinciones de muestras de tejido colónico de inflamación intestinal para la evaluación multimodal de la cicatrización de heridas epiteliales in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inflamación gastrointestinal y la cicatrización de heridas sobre la actividad de la enfermedad inflamada humana y marina. La principal ventaja de esta técnica es que permite la detección y cuantificación de células y tejidos por parámetros físicos de una manera objetiva y sin tinciones. La demostración de los procedimientos estará a cargo de Fittest Ketelhut, un técnico del Centro de Tecnología Biomédica.Configurar el cultivo celular, incubar cuatro veces diez a la quinta, Caco dos células por centímetros cuadrados en placas de Petri de 35 milímetros equipadas con insertos de alto cultivo en medio RPMI suplementado con FBS y antibióticos a 37 grados centígrados con 95% de humedad y cinco por ciento de dióxido de carbono. Después de dos días, trate las células con el agente de interés y devuelva lo

multimodal-quantitative-phase-imaging-with-digital-holographic

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Las ubicaciones tridimensionales de objetos débilmente-dispersión puede ser identificada usando microscopía holográfica digital de línea (MHDL), que implica una modificación menor a un microscopio estándar. Nuestro software utiliza una heurística simple de formación de imágenes junto con Rayleigh-Sommerfeld de propagación hacia atrás para producir la posición en tres dimensiones y la geometría de un objeto de fase microscópica.

Digital Inline holográfica Microscopía (MHDL) de sujetos débilmente dispersión de

Describimos el uso de un microscopio óptico estándar para realizar mediciones cuantitativas de masa, volumen y densidad celular a través de una combinación de imágenes de campo claro y contraste de interferencia diferencial.

Microscopía óptica cuantitativa: Medición de Biofísica Celular Características con un microscopio óptico estándar

Pequeños técnicas de imagen permiten animales exámenes de diagnóstico de serie y las intervenciones terapéuticas en vivo. Recientemente, el alcance de las aplicaciones se ha ampliado significativamente y actualmente incluye la evaluación del desarrollo de tumores del colon, la cicatrización de heridas y el seguimiento de la inflamación. Este protocolo se ilustran estas diversas aplicaciones potenciales de la endoscopia murino.

Murino Endoscopia para En Vivo Healing Multimodal Imaging de Carcinogénesis y Evaluación de la herida y la inflamación intestinal

Sondas específicas de objetivo representan una herramienta innovadora para el análisis de los mecanismos moleculares, como la expresión de proteínas en diversos tipos de enfermedad (p. ej., inflamación, infección y tumorigenesis). En este estudio, describimos una evaluación tomográfica tridimensional cuantitativa de la infiltración de macrófagos intestinales en un modelo murino de colitis con F4/80-específica mediada por fluorescencia tomografía.

Tomografía mediada por fluorescencia para la detección y cuantificación de la inflamación Intestinal murina relacionadas con macrófagos

Describimos un método para visualizar los IEL con la etiqueta GFP utilizando imágenes intravitales del intestino delgado murina mediante microscopía confocal de disco giratorio invertido. Esta técnica permite el seguimiento de células vivas dentro de la mucosa hasta 4 h y se puede utilizar para investigar una variedad de interacciones inmunoepiteliales intestinales.

Imágenes intravitales de linfocitos intraepiteliales en el intestino pequeño murino

Aprovechando la microscopía intravital, el método presentado aquí permite la visualización en tiempo real del desprendimiento de células epiteliales intestinales en animales vivos. Por lo tanto, la mucosa intestinal teñida tópicamente (acriflavina y rhodamineB-dextran) de ratones anestesiados se compara hasta una sola célula mediante microscopía confocal.

Un enfoque basado en microscopía intravital para evaluar la permeabilidad intestinal y el rendimiento del desprendimiento de células epiteliales

La puntuación sistemática de la inflamación intestinal utilizando un sistema asistido por computadora libre es una poderosa herramienta para comparar cuantitativamente los cambios histopatológicos en los modelos de colitis caracterizados por la presencia de úlceras y cambios inflamatorios. La evaluación de la puntuación de colitis histológica fortalece las observaciones clínicas y facilita la interpretación de los datos.

Análisis sistemático de puntuación para la inflamación intestinal en un modelo de colitis inducida por sulfato de sodio de dextrano de murina

Aquí, presentamos un método para obtener imágenes del intestino tras heridas inducidas por láser. Al exponer el intestino del ratón a un láser multifotónico, la pérdida de una o varias criptas se induce localmente. Al obtener imágenes repetidas del área dañada durante meses, se captura la dinámica en tiempo real de la recuperación intestinal.

Ablación láser y microscopía intravital para estudiar la remodelación intestinal

Presentamos un protocolo paso a paso para imágenes tridimensionales, sin etiquetas y de alta resolución de organoides mediante holotomografía de baja coherencia. Este protocolo detalla la preparación del cultivo de organoides, la adquisición de imágenes y el análisis computacional de imágenes, lo que permite la visualización en tiempo real de la dinámica estructural y las respuestas a los fármacos en organoides vivos.

Imágenes 3D de alta resolución y análisis de aprendizaje automático sin etiquetas de organoides intestinales mediante holotomografía de baja coherencia

Este estudio presenta un método de imagen en 3D que utiliza tejidos intestinales de montaje completo y microscopía multifotónica para cuantificar el moco secretado, lo que permite un análisis volumétrico preciso y la visualización de la dinámica del moco en respuesta a estímulos como el cloruro de carbamoilcolina.

Cuantificación tridimensional del moco intestinal mediante imágenes de tejido de montaje completo

Aprende a utilizar microscopía holográfica digital para evaluar cuantitativamente la inflamación intestinal y la cicatrización epitelial in vitro sin tinciones. Este método automatizado permite detectar parámetros físicos celulares y tisulares de forma objetiva en muestras de colon murino y humano.

Multimodal Fase cuantitativa de imágenes con Digital holográfica Microscopía evaluación exacta de la inflamación intestinal Curación de heridas y epitelial (Video) | JoVE Journal

Multimodal Fase cuantitativa de imágenes con Digital holográfica Microscopía evaluación exacta de la inflamación intestinal Curación de heridas y epitelial

Explorar más videos