Multimodal Fase cuantitativa de imágenes con Digital holográfica Microscopía evaluación exacta de la inflamación intestinal Curación de heridas y epitelial

El objetivo general de este estudio es utilizar la microscopía holográfica digital o DHM para proporcionar imágenes de contraste de fase cuantitativas automatizadas y sin tinciones de muestras de tejido colónico de inflamación intestinal para la evaluación multimodal de la cicatrización de heridas epiteliales in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inflamación gastrointestinal y la cicatrización de heridas sobre la actividad de la enfermedad inflamada humana y marina. La principal ventaja de esta técnica es que permite la detección y cuantificación de células y tejidos por parámetros físicos de una manera objetiva y sin tinciones. La demostración de los procedimientos estará a cargo de Fittest Ketelhut, un técnico del Centro de Tecnología Biomédica.

Configurar el cultivo celular, incubar cuatro veces diez a la quinta, Caco dos células por centímetros cuadrados en placas de Petri de 35 milímetros equipadas con insertos de alto cultivo en medio RPMI suplementado con FBS y antibióticos a 37 grados centígrados con 95% de humedad y cinco por ciento de dióxido de carbono. Después de dos días, trate las células con el agente de interés y devuelva los cultivos a la incubadora durante 24 horas adicionales. Al día siguiente, aspire el sobrenadante y use pinzas para quitar los insertos.

Lave el cultivo una o dos veces con un mililitro de medio de cultivo celular tamponado HEPES para eliminar las células muertas y los componentes celulares restantes del área de la herida. A continuación, añade dos mililitros de medio tamponado HEPES fresco y cierra el plato. Ahora coloque la placa de Petri en el microscopio holográfico digital y seleccione el objetivo 10 x.

Abra el software de adquisición de imágenes y seleccione el modo de imagen de campo claro. Ajuste la cámara de calentamiento a 37 grados centígrados y coloque el cultivo en la cámara de calentamiento. A continuación, mueva el campo de visualización hasta que se pueda visualizar una herida adecuada con una sola capa de células enormes y bordes rectos en ambos lados sin células muertas ni suero en la ventana de monitoreo en vivo.

Capture una imagen de luz blanca del área inicial de la herida. Luego, apague la iluminación de luz blanca y seleccione el modo de microscopía holográfica digital. Encienda la iluminación láser y seleccione un tiempo de exposición de menos de tres milisegundos para la grabación del holograma.

Si las franjas de interferencia holográficas fuera de acceso aparecen con un contraste adecuado, capture un holograma de muestra y reconstruya una imagen de fase cuantitativa con el software de reconstrucción para comprobar la calidad de la imagen. A continuación, inicie una observación DHM de la herida en un lapso de tiempo, deteniendo el registro en el punto final apropiado y obtenga una imagen final de la muestra bajo iluminación de luz blanca. Para la inducción de colitis por sulfato de sodio de dextrano agudo, o DSS, proporcione tres gramos de DSS disueltos en 100 mililitros de agua esterilizada en autoclave a los ratones ablibidim.

Después de siete días, obtenga secciones de siete micrómetros de espesor de muestras de colon laminado suizo de los animales de control y tratados. Sumerja cada sección en 50 a 100 microlitros de PBS y cubra las muestras con cubreobjetos de vidrio individuales. Confirme que la parte inferior de los portaobjetos esté libre de polvo y otra contaminación.

A continuación, coloque el primer portaobjetos en la platina del microscopio y ajuste el campo de visión hasta que el área de tejido de interés sea visible. Enfoque la muestra con nitidez y capture una imagen de campo claro en el software de adquisición de imágenes. A continuación, seleccione el modo de imagen DHM y cambie a la iluminación de luz láser.

Establezca un tiempo de exposición de menos de tres milisegundos y confirme que las franjas de interferencia de acceso desactivado holográfico aparezcan con un contraste adecuado en la ventana de imágenes en directo. A continuación, captura un holograma digital del tejido. Desde el punto de vista endoscópico, la evidencia de colitis moderada a grave incluye engrosamiento de la pared colónica, alteraciones del patrón vascular, nedudadaciones de las fibras y granularidad de la superficie de la mucosa.

La evaluación histológica convencional de las secciones colónicas revela un edema marcado en la pared colónica de los DSS tratados en comparación con los animales control localizados predominantemente en la submucosa. Las correspondientes imágenes cuantitativas de contraste de fase DHM y los mapas de índice de refracción relacionados también demuestran que estas alteraciones tisulares sin diferencias visibles en las densidades del menstroma epitelial son especialmente evidentes en las muestras de tejido nativo no teñido. El índice de refracción se reduce significativamente en el epitelio, la submucosa y el estroma de los ratones colíticos en comparación con los controles sanos, con una correlación significativa entre la pérdida relativa de peso corporal y el índice de refracción en los animales de experimentación.

Aquí se muestra el monitoreo continuo representativo de un ensayo de cicatrización de heridas mediante microscopía holográfica digital durante 45 horas. Permite calcular el área de superficie cubierta de células, el grosor promedio de las células y la masa seca celular en el transcurso del proceso de curación. Hemos demostrado que la DHM permite la monitorización continua de la cicatrización de heridas epiteliales y, al mismo tiempo, proporciona información biocentral sobre las alteraciones celulares inducidas por citocinas.

Además, demostramos la evaluación precisa del daño histológico en modelos de colitis y muestras de tejido colónico humano mediante DHM a través de la medición de los cambios en el índice de refracción. Como la DHM se basa en la detección del retraso de las longitudes de las trayectorias ópticas, los parámetros biofísicos absolutos, como la densidad del tejido, la masa seca o el grosor celular, pueden analizarse mediante imágenes cuantitativas de contraste de fase sin tinción. La culminación de la DHM con microscopios de investigación comunes y la robustez de la técnica allana el camino para las aplicaciones rutinarias de este método en biología celular y patología digital.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar la microscopía holográfica digital para el análisis de tejidos de cultivos de células vivas en el entorno de laboratorio biomédico. En conclusión, la DHM crea una herramienta valiosa, novedosa y cuantitativa para la evaluación de los parámetros absolutos de inflamación, así como para la cuantificación simplificada de epitelios voluntarios in vitro con un alto potencial para el uso diagnóstico traslacional.