Name: Multimodal Fase cuantitativa de imágenes con Digital holográfica Microscopía evaluación exacta de la inflamación intestinal Curación de heridas y epitelial (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Aprende a utilizar microscopía holográfica digital para evaluar cuantitativamente la inflamación intestinal y la cicatrización epitelial in vitro sin tinciones. Este método automatizado permite detectar parámetros físicos celulares y tisulares de forma objetiva en muestras de colon murino y humano.

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Agradecemos a Faekah Gohar por corregir el manuscrito. Agradecemos a Sonja Dufentester y Elke Weber por su asistencia técnica experta.

Los autores no tienen nada que revelar.

Demostramos que DHM proporciona una evaluación precisa del daño histológico en modelos murinos de colitis y muestras de tejido del colon humanas ex vivo. Además, hemos demostrado DHM puede monitorizar de forma continua la curación de heridas epiteliales mismo tiempo, proporcione información multimodal sobre las alteraciones celulares. En DHM, la reconstrucción de hologramas capturadas digitalmente se realiza numéricamente 32. Por lo tanto, en comparación con la microscopía de campo claro, contraste d...

Enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), es decir, la colitis ulcerosa (UC) y la enfermedad de Crohn (CD) son trastornos inflamatorias idiopáticas del tracto gastrointestinal 1. La investigación sobre la fisiopatología subyacente de la EII y la evaluación de los potenciales nuevos fármacos o enfoques novedosos de diagnóstico es de particular importancia. Tanto en la investigación básica y el manejo clínico de los pacientes con EII, la mucosa intestinal se ha convertido en un foco de atención 2,3. La mucosa representa un límite anatómico, en la que la interacción entre bacterias comensales, células epiteliales y diversos componentes celulares del sistema inmunitario intestinal orquestar intestino homeostasis 4,5. Sin embargo, en los pacientes con EII, la inflamación intestinal incontrolada y persistente conduce a la mucosa daño, detectable como ulceraciones o estenosis, que finalmente pueden culminar en la descomposición de la función de la barrera epitelial, que a su vez agrava la inflamación local 6. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; epitelial de cicatrización de la herida tanto, es crucial para la regeneración epitelial después de la inflamación, pero también es un requisito esencial para la cicatrización de las úlceras gastrointestinales o dehiscencia de la anastomosis después de la cirugía gastrointestinal 7. Epitelial cicatrización de la herida puede ser simulado en la herida in vitro los ensayos de curación y en modelos murinos de inflamación intestinal 8,9. Tanto in vitro como in vivo enfoques tienen inconvenientes, que limitan la precisión de la evaluación experimental. Ensayos in vitro, como los ensayos de cero clásicos, requerir procedimientos de tinción o prolongadas de la transfección con cromóforos fluorescentes. A menudo están limitadas por su monitorización discontinua de la proliferación celular y la migración que no puede ser automatizado 10. Modelos in vivo, tales como sulfato de dextrano sódico (DSS) La colitis inducida, con frecuencia carecen de robustos lectura de los, en parte debido a la variación significativa vista en los marcadores de laboratorio, marey dichos marcadores inadecuados para evaluar la gravedad de la colitis 11,12. El análisis histológico de la mucosa inflamada es actualmente todavía el método más válido para determinar la gravedad colitis pero esto, como los ensayos de curación de heridas epiteliales in vitro, requiere tinción y depende de la experiencia del investigador 13. Microscopía holográfica Recientemente digital (DHM), una variante de la microscopía de fase cuantitativa 14, se identificó como herramienta útil para la evaluación de epitelial cicatrización de heridas in vitro y in vivo 15. DHM permite la evaluación de la densidad del tejido mediante la medición de retardo de longitud del camino óptico (OPD) , que el diagnóstico del cáncer perspectivas novela 16-18 y cuantificación de las alteraciones del tejido relacionado con la inflamación 19. Además, DHM permite la monitorización de la dinámica de la morfología celular mediante la determinación de espesor de la celda, el área de superficie de la célula cubierta y intracelular (proteína) la cantidad de contenido <sup&gt; 15,20. En ensayos in vitro, DHM también permite el análisis de procesos fisiológicos, por ejemplo, celular permeabilidad al agua mediante la evaluación de los cambios en el volumen celular y el espesor de 21,22. Por otra parte, las mediciones se pueden automatizar DHM que evita el sesgo de la muestra por el investigador asociado. A continuación, se demuestra el uso de DHM en un modelo murino de inflamación intestinal, y también aplicar DHM para el análisis de muestras de tejidos humanos para la monitorización cuantitativa de la cicatrización de heridas como un ensayo libre de etiquetas in vitro. En primer lugar, se evalúa alteraciones inflamatorias de las diferentes capas de la pared del colon-en ratones colíticos y secciones de tejidos de seres humanos con EII. Después de describir el procedimiento de formación de imágenes DHM fase cuantitativa, se proporcionan instrucciones detalladas para el uso de los componentes del microscopio, la preparación de secciones de tejido y también describir la evaluación de las imágenes de fase cuantitativos adquiridos. A continuación, mostramos que DHM puede ser utilizado para la monitorización multimodal continua de la curación de heridas epiteliales in vitro, y describir el análisis de las características celulares como espesor de la capa de células, masa seca y el volumen celular dar una idea de las alteraciones inducidas por drogas y celulares fisiológica.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Reactivos</fuerte></td>Azoximetano (AOM)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Alemania Matraz de cultivo celular A5486 Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania 658170 Costar Stripette Corning Inc., Nueva York, EE. UU. 4488 Sulfato de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> dextrano sódico (DSS)TdB Consulación,<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Uppsala, Suecia</td><td>DB001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F12</td><td>PAA Laboratories - Pasching - Austria</td><td>E15-813</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Alemania</td><td>SPR3196</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Alemania</td><td>E 9884</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 50 ml</td><td>BD Biosciences, Erembodegem, Bélgica</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Isopentano (2-metilbutano)</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Alemania</td><td>M32631-1L</td><td></td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>1159430025</td><td></td></tr><tr><td>Mitomicina C</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Alemania</td><td>M4287</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>G. Menzel, Braunschweig, Alemania</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Compuesto O.C.T. Tissue Tek&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sakura, Zoeterwonde, Países Bajos</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Estreptococo/Anfotericina B</td><td>Lonza, Verviers, Bélgica</td><td>1558</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato, PBS</td><td>Lonza, Verviers, Bélgica</td><td>4629</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza, Verviers, Bélgica</td><td>3626</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio 0,9%</td><td>Braun, Melsungen, Alemania</td><td>5/12211095/0411</td><td></td></tr><tr><td>Dieta estándar</td><td>Altromin, Lage, Alemania</td><td>1320</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, Leiden, Países Bajos</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA</td><td>Lonza, Verviers, Bélgica</td><td>7815</td><td></td></tr><tr><td>Vitro &ndash; Clud</td><td>R. Langenbrinck, Teningen, Alemania</td><td>04-0002&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &micro;-Plato de 35 mm con inserto de cultivo, alto</td><td>ibidi GmbH, Múnich, Alemania</td><td>81176</td><td></td></tr><tr><td>DIC Tapa para &micro;-platos, con inserto de vidrio</td><td>ibidi GmbH, Múnich, Alemania</td><td>80050</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICROM HM550</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, EE. UU</td>. <td>46320</td><td></td></tr><tr><td><microscopio holográfico digital fuerte></fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>componente</fuerte</td><td>><fuerte>Modelo</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>iMIC</td><td>Till Photonics, Graefelfing, Alemania</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Laser Compass 315M</td><td>Coherent GmbH, Luebeck, Alemania</td><td></td></tr><tr><td>Lente de microscopio</td><td>Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3</td><td>Zeiss, Goettingen, Alemania</td><td></td></tr><tr><td>Cámara CCD</td><td>DMK 41BF02</td><td>The Imaging Source, Bremen, Alemania</td><td></td></tr></tbody></table>

multimodal fase cuantitativa de imágenes con digital holográfica microscopía evaluación exacta de la inflamación intestinal curación de heridas y epitelial

Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

La incidencia de la enfermedad inflamatoria intestinal, es decir, la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, ha aumentado considerablemente en la última década. La etiología de la IBD permanece desconocida y estrategias terapéuticas actuales se basan en la supresión no específica del sistema inmune. El desarrollo de tratamientos que se dirigen específicamente la inflamación intestinal y la curación de la herida epitelial podría mejorar significativamente la gestión de la EII, sin embargo esto requiere una detección precisa de los cambios inflamatorios. Actualmente, los posibles candidatos a fármacos se evalúan por lo general el uso de modelos animales in vivo o con técnicas basadas en cultivos celulares in vitro. El examen histológico por lo general requiere que las células o tejidos de interés para ser teñidas, que pueden alterar las características de la muestra y, además, la interpretación de los resultados puede variar por la experiencia del investigador. microscopía holográfica digital (DHM), basado en la detección de retardo de longitud del camino óptico, permite-Libre de manchas de imágenes de contraste de fase cuantitativa. Esto permite que los resultados que se correlacionan directamente con los parámetros biofísicos absolutos. Se demuestra cómo la medición de los cambios en la densidad del tejido con DHM, basado en la medición del índice de refracción, puede cuantificar alteraciones inflamatorias, sin tinción, en diferentes capas de muestras de tejido del colon de ratones y seres humanos con colitis. Además, demostramos monitoreo libre de etiquetas multimodal continua de la curación de heridas epiteliales in vitro, utilizando DHM posible gracias a la determinación automatizada sencilla de la zona de la herida y la determinación simultánea de los parámetros morfológicos, como una masa seca y espesor de la capa de células que migran. En conclusión, DHM representa un valioso, herramienta novedosa y cuantitativo para la evaluación de la inflamación intestinal con valores absolutos de los parámetros posibles, la cuantificación simplificada de la curación de heridas epiteliales in vitro y por lo tanto tiene un alto potencial de diagnóstico u traslacionalse.

Configuración típica de los DHM de imagen digital para microscopía holográfica (DHM) Para llevar a cabo formación de imágenes de campo brillante y la imagen de contraste de fase cuantitativa DHM, se aplicó un microscopio invertido como se representa en la Figura 1 B. El sistema fue modificado uniendo un módulo DHM, como se describió anteriormente 25.</sup...

La evaluación precisa de los efectos antiinflamatorios es de suma importancia para la evaluación de posibles nuevos fármacos para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal. La microscopía holográfica digital proporciona una evaluación de la inflamación en muestras de tejido colónico murino y humano, así como una evaluación multimodal automatizada de la cicatrización de heridas epiteliales in vitro.

Multimodal Fase cuantitativa de imágenes con Digital holográfica Microscopía evaluación exacta de la inflamación intestinal Curación de heridas y epitelial

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

El objetivo general de este estudio es utilizar la microscopía holográfica digital o DHM para proporcionar imágenes de contraste de fase cuantitativas automatizadas y sin tinciones de muestras de tejido colónico de inflamación intestinal para la evaluación multimodal de la cicatrización de heridas epiteliales in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inflamación gastrointestinal y la cicatrización de heridas sobre la actividad de la enfermedad inflamada humana y marina. La principal ventaja de esta técnica es que permite la detección y cuantificación de células y tejidos por parámetros físicos de una manera objetiva y sin tinciones. La demostración de los procedimientos estará a cargo de Fittest Ketelhut, un técnico del Centro de Tecnología Biomédica.Configurar el cultivo celular, incubar cuatro veces diez a la quinta, Caco dos células por centímetros cuadrados en placas de Petri de 35 milímetros equipadas con insertos de alto cultivo en medio RPMI suplementado con FBS y antibióticos a 37 grados centígrados con 95% de humedad y cinco por ciento de dióxido de carbono. Después de dos días, trate las células con el agente de interés y devuelva los cultivos a la incubadora durante 24 horas adicionales. Al día siguiente, aspire el sobrenadante y use pinzas para quitar los insertos.Lave el cultivo una o dos veces con un mililitro de medio de cultivo celular tamponado HEPES para eliminar las células muertas y los componentes celulares restantes del área de la herida. A continuación, añade dos mililitros de medio tamponado HEPES fresco y cierra el plato. Ahora coloque la placa de Petri en el microscopio holográfico digital y seleccione el objetivo 10 x.Abra el software de adquisición de imágenes y seleccione el modo de imagen de campo claro. Ajuste la cámara de calentamiento a 37 grados centígrados y coloque el cultivo en la cámara de calentamiento. A continuación, mueva el campo de visualización hasta que se pueda visualizar una herida adecuada con una sola capa de células enormes y bordes rectos en ambos lados sin células muertas ni suero en la ventana de monitoreo en vivo.Capture una imagen de luz blanca del área inicial de la herida. Luego, apague la iluminación de luz blanca y seleccione el modo de microscopía holográfica digital. Encienda la iluminación láser y seleccione un tiempo de exposición de menos de tres milisegundos para la grabación del holograma.Si las franjas de interferencia holográficas fuera de acceso aparecen con un contraste adecuado, capture un holograma de muestra y reconstruya una imagen de fase cuantitativa con el software de reconstrucción para comprobar la calidad de la imagen. A continuación, inicie una observación DHM de la herida en un lapso de tiempo, deteniendo el registro en el punto final apropiado y obtenga una imagen final de la muestra bajo iluminación de luz blanca. Para la inducción de colitis por sulfato de sodio de dextrano agudo, o DSS, proporcione tres gramos de DSS disueltos en 100 mililitros de agua esterilizada en autoclave a los ratones ablibidim.Después de siete días, obtenga secciones de siete micrómetros de espesor de muestras de colon laminado suizo de los animales de control y tratados. Sumerja cada sección en 50 a 100 microlitros de PBS y cubra las muestras con cubreobjetos de vidrio individuales. Confirme que la parte inferior de los portaobjetos esté libre de polvo y otra contaminación.A continuación, coloque el primer portaobjetos en la platina del microscopio y ajuste el campo de visión hasta que el área de tejido de interés sea visible. Enfoque la muestra con nitidez y capture una imagen de campo claro en el software de adquisición de imágenes. A continuación, seleccione el modo de imagen DHM y cambie a la iluminación de luz láser.Establezca un tiempo de exposición de menos de tres milisegundos y confirme que las franjas de interferencia de acceso desactivado holográfico aparezcan con un contraste adecuado en la ventana de imágenes en directo. A continuación, captura un holograma digital del tejido. Desde el punto de vista endoscópico, la evidencia de colitis moderada a grave incluye engrosamiento de la pared colónica, alteraciones del patrón vascular, nedudadaciones de las fibras y granularidad de la superficie de la mucosa.La evaluación histológica convencional de las secciones colónicas revela un edema marcado en la pared colónica de los DSS tratados en comparación con los animales control localizados predominantemente en la submucosa. Las correspondientes imágenes cuantitativas de contraste de fase DHM y los mapas de índice de refracción relacionados también demuestran que estas alteraciones tisulares sin diferencias visibles en las densidades del menstroma epitelial son especialmente evidentes en las muestras de tejido nativo no teñido. El índice de refracción se reduce significativamente en el epitelio, la submucosa y el estroma de los ratones colíticos en comparación con los controles sanos, con una correlación significativa entre la pérdida relativa de peso corporal y el índice de refracción en los animales de experimentación.Aquí se muestra el monitoreo continuo representativo de un ensayo de cicatrización de heridas mediante microscopía holográfica digital durante 45 horas. Permite calcular el área de superficie cubierta de células, el grosor promedio de las células y la masa seca celular en el transcurso del proceso de curación. Hemos demostrado que la DHM permite la monitorización continua de la cicatrización de heridas epiteliales y, al mismo tiempo, proporciona información biocentral sobre las alteraciones celulares inducidas por citocinas.Además, demostramos la evaluación precisa del daño histológico en modelos de colitis y muestras de tejido colónico humano mediante DHM a través de la medición de los cambios en el índice de refracción. Como la DHM se basa en la detección del retraso de las longitudes de las trayectorias ópticas, los parámetros biofísicos absolutos, como la densidad del tejido, la masa seca o el grosor celular, pueden analizarse mediante imágenes cuantitativas de contraste de fase sin tinción. La culminación de la DHM con microscopios de investigación comunes y la robustez de la técnica allana el camino para las aplicaciones rutinarias de este método en biología celular y patología digital.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar la microscopía holográfica digital para el análisis de tejidos de cultivos de células vivas en el entorno de laboratorio biomédico. En conclusión, la DHM crea una herramienta valiosa, novedosa y cuantitativa para la evaluación de los parámetros absolutos de inflamación, así como para la cuantificación simplificada de epitelios voluntarios in vitro con un alto potencial para el uso diagnóstico traslacional.

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